HPLC法測(cè)定南瓜中β-胡蘿卜素

鄧俊琳，朱永清，劉小俊，楊 宏，梁根云，陳 建，夏 陳，張盈嬌，李 娟

(1四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，成都 610066；2四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所/蔬菜種質(zhì)與品種創(chuàng)新四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 610066)

HPLC法測(cè)定南瓜中β-胡蘿卜素

鄧俊琳1，朱永清1，劉小俊2，楊 宏2，梁根云2，陳 建1，夏 陳1，張盈嬌1，李 娟1

(1四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，成都 610066；2四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所/蔬菜種質(zhì)與品種創(chuàng)新四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 610066)

目的：建立高效液相色譜法(HPLC)測(cè)定南瓜中β-胡蘿卜素含量的方法，并對(duì)12份南瓜樣品中β-胡蘿卜素含量進(jìn)行測(cè)定。方法：色譜柱：Eclipse XDB-C18柱(4.6mm×250mm，5μm)；流動(dòng)相：水(A)+丙酮(B)；檢測(cè)波長(zhǎng)：450nm。結(jié)果：南瓜中β-胡蘿卜素在35 min內(nèi)得到較好分離，重復(fù)性好(RSD=5.11%)，精密度高(RSD=0.70%)，穩(wěn)定性好(RSD=2.73%)，加標(biāo)回收結(jié)果準(zhǔn)確可靠(RSD=2.06%)。12份南瓜樣品中β-胡蘿卜素含量差異較大(8.9～94.4 μg/g)，印度南瓜16296-1中β-胡蘿卜素含量最高，其次為中國(guó)南瓜9132、印度南瓜16291-2和16167-8，這3種南瓜中β-胡蘿卜素含量較接近(均≥76 μg/g)，含量最低的為印度南瓜16185-6。結(jié)論：建立了一種快速測(cè)定南瓜中β-胡蘿卜素的高效液相色譜方法，該方法準(zhǔn)確、可靠；12份南瓜樣品中β-胡蘿卜素含量差異較大。

南瓜；β-胡蘿卜素；HPLC

南瓜耐干旱貧瘠、適應(yīng)能力較強(qiáng)，廣泛栽培于世界各地。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2013年我國(guó)南瓜栽培面積達(dá) 38.77 萬(wàn)hm2，總產(chǎn)量在 710 萬(wàn)t左右，是世界上最大的南瓜生產(chǎn)國(guó)。南瓜營(yíng)養(yǎng)豐富且全面，富含果膠、纖維素、淀粉、脂肪、甘露醇、維生素、生物堿、β-胡蘿卜素等[1]。研究表明，南瓜具有降血糖、預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化和冠心病作用、防癌、解毒、保肝腎、抗氧化等諸多功效[2-4]。

自然界中胡蘿卜素主要包括有α、β、γ等異構(gòu)體，其中以β-胡蘿卜素的活性最高。研究表明，補(bǔ)充 β-胡蘿卜素或提高β-胡蘿卜素血濃度，通過(guò)抗氧化、增強(qiáng)機(jī)體免疫能力以及促進(jìn)細(xì)胞縫隙連接等作用，抑制或降低癌癥的發(fā)生和發(fā)展[5]。β-胡蘿卜素可直接抑制和淬滅由電離輻射產(chǎn)生的活性單線態(tài)氧，維護(hù)線粒體膜的完整性，阻止自由基的進(jìn)一步產(chǎn)生，減輕放射線對(duì)人體產(chǎn)生的毒副作用[6]。此外，β-胡蘿卜素還有預(yù)防心血管疾病、增強(qiáng)免疫、補(bǔ)充人體維生素A等諸多功效[7-9]。隨著對(duì)其認(rèn)識(shí)的不斷深入，β-胡蘿卜素已被廣泛用于食品、工業(yè)、化妝品、醫(yī)藥等諸多領(lǐng)域。

大多數(shù)南瓜呈現(xiàn)黃色或橙色，與其高含量的類(lèi)胡蘿卜素有關(guān)，主要是β-胡蘿卜素和α-蘿卜素[10]。β-胡蘿卜素不僅與南瓜色澤有關(guān)，還與一些南瓜生理活性有密切關(guān)聯(lián)。Na-Rae Kim等[11]研究表明，β-胡蘿卜素可能是南瓜改善抑郁的主要活性成分。β-胡蘿卜素是維生素A的前體，南瓜因含有高含量的β-胡蘿卜素而被認(rèn)為是缺乏維生素A的兒童和婦女們?nèi)粘Ｉ攀车臐撛谘a(bǔ)充源[12]。β-胡蘿卜素作為南瓜的重要功效成分，對(duì)其品質(zhì)有直接影響，但到目前為止，南瓜中β-胡蘿卜素的檢測(cè)并未見(jiàn)一種檢測(cè)前處理簡(jiǎn)單、檢測(cè)方法準(zhǔn)確可靠、檢測(cè)效率高的方法。本文建立了一種簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確的HPLC檢測(cè)方法，并對(duì)該方法進(jìn)行方法學(xué)考察，以及對(duì)12份南瓜樣品中的β-胡蘿卜素含量進(jìn)行測(cè)定，以期為南瓜中β-胡蘿卜素的快速檢測(cè)和深入研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

南瓜：2017年2月9日采收于四川省農(nóng)科院海南試驗(yàn)基地。樣品詳細(xì)信息見(jiàn)表1。鮮樣去皮和瓤，取果肉切片打漿，稱(chēng)取1g于研砵中，加丙酮研磨至無(wú)色，將研磨液定容至25mL，0.22μm濾膜過(guò)濾于液相進(jìn)樣瓶中待測(cè)。各試劑均為色譜純，β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司(純度≥98%)。

電子天平，奧豪斯儀器(上海)有限公司；1260型高效液相色譜儀，美國(guó)Agilent公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 色譜條件 色譜柱：Eclipse XDB-C18柱(4.6mm×250mm，5μm)；DAD檢測(cè)器，檢測(cè)波長(zhǎng)450nm；柱溫：25℃；進(jìn)樣量：20μL；流速：1.5mL/min；流動(dòng)相：水(A)+丙酮(B)，梯度洗脫：0～30min，75%～95%(B)；30～32min，95%～100%(B)；32～35min，100%(B)。

表1 12份南瓜材料

1.2.2 β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備 準(zhǔn)確稱(chēng)取β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品14.5mg，置于25mL容量瓶中，丙酮溶解并定容，得濃度為580μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品母液，對(duì)該母液分別稀釋10、20、100、200、1 000、2 000倍，配置不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

1.2.3 南瓜樣品溶液的制備 分別精確稱(chēng)取同一批南瓜樣品3份，每份1g，置于研缽中，加入少量石英砂，丙酮研磨提取至無(wú)色，30℃水浴減壓濃縮，丙酮定溶于25mL容量瓶，0.22μm微孔濾膜過(guò)濾，作為樣品待測(cè)液。

2 結(jié)果與分析

2.1 β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品溶液和南瓜樣品的HPLC色譜

由附圖可知，在南瓜樣品色譜圖中的33.215min處有色譜峰，其保留時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)品的色譜峰保留時(shí)間33.280min基本一致。在此色譜條件下，南瓜樣品中的β-胡蘿卜素得到較好的分離。

附圖 β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品(a)和南瓜樣品(b)的HPLC色譜

2.2 方法學(xué)驗(yàn)證

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線和線性關(guān)系 在1.2.1色譜條件下分別對(duì)濃度為0.28、0.57、2.87、5.687、28.42、56.83 μg/mL的β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)樣20 μL色譜分析。以濃度(X，μg/mL)為橫坐標(biāo)、峰面積(Y)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得β-胡蘿卜素的線性方程為Y=61.866X-8.371 6(R2=0.999 8)，β-胡蘿卜素的峰面積和濃度之間呈良好的線性關(guān)系。

2.2.2 重復(fù)性試驗(yàn) 按照1.2.3的方法平行制備南瓜樣品溶液5份，以1.2.1的色譜條件進(jìn)行色譜測(cè)定分析，計(jì)算β-胡蘿卜素平均提取量為24.55μg/g，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為5.11%，表明試驗(yàn)方法重復(fù)性良好。

2.2.3 精密度試驗(yàn) 按照1.2.2的方法制備β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品溶液1份，以1.2.1的色譜條件連續(xù)進(jìn)樣5次，計(jì)算β-胡蘿卜素峰面積的RSD，為0.70%，表明儀器精密度良好。

2.2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 按照1.2.3的方法制備南瓜樣品溶液1份，以1.2.1的色譜條件分別在時(shí)間為0、2、4、6、8 h進(jìn)樣，計(jì)算β-胡蘿卜素峰面積的RSD，為2.73%，表明試驗(yàn)穩(wěn)定性良好良好。

2.2.5 回收率試驗(yàn) 稱(chēng)取5份南瓜樣品于研砵中，分別加入相同的β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品，以1.2.3的方法制備樣品，再按1.2.1的色譜條件進(jìn)行分析。結(jié)果顯示，β-胡蘿卜素的平均加標(biāo)回收率為93.922 5%，RSD為2.06%(表2)，表明試驗(yàn)方法有較好的回收率，回收結(jié)果準(zhǔn)確可靠。

2.2.6 12份南瓜材料中β-胡蘿卜素的含量 由表2可知，南瓜中β-胡蘿卜素含量差異顯著，不同類(lèi)型南瓜或者相同類(lèi)型的南瓜中β-胡蘿卜素含量有較大差異。其中，β-胡蘿卜素含量最高為印度南瓜16296-1，為94.4μg/g，其次為印度南瓜16167-8、16291-2和中國(guó)南瓜9132，含量均在75～80μg/g之間；印度南瓜16183-1和中國(guó)南瓜9133中含量均為13.9μg/g；β-胡蘿卜素含量最低為印度南瓜16185-6，僅含8.9μg/g。

表2 β-胡蘿卜素的加標(biāo)回收率(n=6)

表3 南瓜中β-胡蘿卜素含量 單位：μg/g

3 討論

β-胡蘿卜素屬于脂溶性維生素，由于其分子中存在多個(gè)共軛雙鍵，對(duì)光、熱、氧不穩(wěn)定，易被氧化、降解而降低其生物學(xué)活性[13]。測(cè)定β-胡蘿卜素的方法主要有紙層析法、薄層層析法、柱層析法、分光光度法和高效液相色譜法等。薄層層析法、紙層析法及柱層析法只能對(duì)β-胡蘿卜素進(jìn)行定性分析，要確定量的大小必須結(jié)合紫外分光光度計(jì)[14]。高效液相色譜法是目前測(cè)定β-胡蘿卜素含量最簡(jiǎn)便的方法，其操作簡(jiǎn)單、效率高、準(zhǔn)確度高，還可同時(shí)測(cè)定α、β-胡蘿卜素及其他類(lèi)胡蘿卜素[15]。劉秋芬等[16]以國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) GB/T 50089-2003的方法用HPLC法測(cè)定了8個(gè)南瓜品種果實(shí)中的β-胡蘿卜素，但該方法需經(jīng)過(guò)提取、濃縮、純化等復(fù)雜的前處理，測(cè)定樣品量較大時(shí)，難度增加。β-胡蘿卜素對(duì)許多物理、化學(xué)、生物因素都不穩(wěn)定，但其檢測(cè)前一般要經(jīng)過(guò)皂化、溶劑萃取、分離、濃縮等多次操作，檢測(cè)前的步驟越多，越易對(duì)β-胡蘿卜素造成損失[14]。Sarungallo等[17]采用柱切換技術(shù)完成食品添加劑中的β-胡蘿卜素的在線準(zhǔn)備與分離，該方法節(jié)省了大量檢測(cè)前期工作，但由于需要利用色譜柱切換技術(shù)，因此其應(yīng)用目前還較少。本次實(shí)驗(yàn)中β-胡蘿卜素的提取、檢測(cè)過(guò)程簡(jiǎn)單，不需要經(jīng)過(guò)復(fù)雜的純化步驟，且建立的方法重復(fù)性好(RSD=5.11%)，精密度高(RSD=0.70%)，穩(wěn)定性好(RSD=2.73%)，加標(biāo)回收結(jié)果準(zhǔn)確可靠(RSD=2.06%)。在35 min內(nèi)較好地將β-胡蘿卜素進(jìn)行了分離，峰型對(duì)稱(chēng)、基線平穩(wěn)、分離度高。色譜分離過(guò)程中的流動(dòng)相為丙酮和水，無(wú)需調(diào)節(jié)酸堿，流動(dòng)相中無(wú)鹽離子，對(duì)色譜柱較溫和。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)以丙酮和水作為流動(dòng)相，采用梯度洗脫的方式，較好地將β-胡蘿卜素在35min內(nèi)進(jìn)行了分離，且測(cè)定結(jié)果的重復(fù)性好(RSD=5.11%)，精密度高(RSD=0.70%)，穩(wěn)定性好(RSD=2.73%)，加標(biāo)回收結(jié)果準(zhǔn)確可靠(RSD=2.06%)。以此色譜條件測(cè)定12份南瓜材料中的β-胡蘿卜素含量，其結(jié)果表明：12份南瓜樣品中β-胡蘿卜素含量差異較大，印度南瓜16296-1中β-胡蘿卜素含量最高，為94.4μg/g，其次為中國(guó)南瓜9132、印度南瓜16291-2、印度南瓜16167-8，含量均≥76μg/g，含量最低的印度南瓜16185-6，僅有8.9μg/g?！?/p>

[1]Kim M Y，Kim E J，Kim Y N，et al.Comparison of the chemical compositions and nutritive values of various pumpkin(Cucurbitaceae)species and parts[J].Nutrition Research and Practice，2012，6(1)：21-27.

[2]Lee J，Kim D，Choi J，et al.Dehydrodiconiferyl alcohol isolated from Cucurbita moschata shows anti-adipogenic and anti-lipogenic effects in 3T3-L1 cells and primary mouse embryonic fibroblasts[J].Journal of Biological Chemistry，2012，287(12)：8839-8851.

[3]Que F，Mao L，F(xiàn)ang X，et al.Comparison of hot air‐drying and freeze‐drying on the physicochemical properties and antioxidant activities of pumpkin(Cucurbita moschata Duch.)flours[J].International Journal of Food Science & Technology，2008，43(7)：1195-1201.

[4]Wang S Y，Huang W C，Liu C C，et al.Pumpkin(Cucurbita moschata)fruit extract improves physical fatigue and exercise performance in mice[J].Molecules，2012，17(10)：11864-11876.

[5]Stanner S A，Hughes J，Kelly C N M，et al.A review of the epidemiological evidence for the ‘a(chǎn)ntioxidant hypothesis’[J].Public Health Nutrition，2004，7(3)：407-422.

[6]李怡嵐，喬珊珊，周蕾，等.β-胡蘿卜素的抗輻射作用[J].環(huán)境與健康雜志，2004，21(5)：300-302.

[7]Albanes D，Heinonen O P，Taylor P R，et al.α-Tocopherol and β-carotene supplements and lung cancer incidence in the Alpha-Tocopherol，Beta-Carotene Cancer Prevention Study：effects of base-line characteristics and study compliance[J].Journal of the National Cancer Institute，1996，88(21)：1560-1570.

[8]Naz H，Khan P，Tarique M，et al.Binding studies and biological evaluation of β-carotene as a potential inhibitor of human calcium/calmodulin-dependent protein kinase IV[J].International Journal of Biological Macromolecules，2017，96：161-170.

[9]Karppi J，Laukkanen J A，M?kikallio T H，et al.Low β-carotene concentrations increase the risk of cardiovascular disease mortality among Finnish men with risk factors[J].Nutrition，Metabolism and Cardiovascular Diseases，2012，22(10)：921-928.

[10]Azevedo-Meleiro C H，Rodriguez-Amaya D B.Qualitative and quantitative differences in carotenoid composition among Cucurbita moschata，Cucurbita maxima，and Cucurbita pepo[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，2007，55(10)：4027-4033.

[11]Kim N R，Kim H Y，Kim M H，et al.Improvement of depressive behavior by Sweetme Sweet Pumpkin? and its active compound，β-carotene[J].Life Sciences，2016，147：39-45.

[12]de Carvalho L M J，Gomes P B，de Oliveira Godoy R L，et al.Total carotenoid content，α-carotene and β-carotene，of landrace pumpkins(Cucurbita moschata Duch)：A preliminary study[J].Food Research International，2012，47(2)：337-340.

[13]吳翠栓，黃晶晶，艾秀麗，等.β-胡蘿卜素的研究進(jìn)展[J].中國(guó)醫(yī)院藥學(xué)雜志，2008，28(16)：1381-1383.

[14]朱秀靈.幾種 β-胡蘿卜素測(cè)定方法比較研究[J].食品信息與技術(shù)，2004(11)：58-58.

[15]Sarungallo Z L，Hariyadi P，Andarwulan N，et al.Analysis of α-cryptoxanthin，β-cryptoxanthin，α-carotene，and β-carotene of Pandanus conoideus oil by high-performance liquid chromatography(HPLC)[J].Procedia Food Science，2015，3：231-243.

[16]劉秋芬，梅文濤，賀明慧，等.8 個(gè)南瓜品種果實(shí)中 β-胡蘿卜素含量的測(cè)定[J].中國(guó)園藝文摘，2016(2)：16-18，57.

[17]Sarungallo Z L，Hariyadi P，Andarwulan N，et al.Analysis of α-cryptoxanthin，β-cryptoxanthin，α-carotene，and β-carotene of Pandanus conoideus oil by high-performance liquid chromatography(HPLC)[J].Procedia Food Science，2015(3)：231-243.

(責(zé)任編輯 李婷婷)

Determination on β-carotene in Fresh Pumpkin by HPLC Method

DENG Jun-lin1，ZHU Yong-qing1，LIU Xiao-jun2，YANG Hong2，LIANG Gen-yun2，CHEN Jian1，XIA Chen1，ZHANG Ying-jiao1，LI Juan1
(1Institute of Agro-Products Processing Science and Technology，Sichuan Academy of Agricultural Sciences，Chengdu 610066，China；2Institute of Horticulture Research Institute，Sichuan Academy of Agricultural Sciences/Vegetable Germplasm Innovation and Variety Improvement Key Laboratory of Sichuan Province，Chengdu 610066，China)

pumpkin；β-carotene；HPLC

公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專(zhuān)項(xiàng)經(jīng)費(fèi)(項(xiàng)目編號(hào)：201303112)；國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專(zhuān)項(xiàng)資金資助(項(xiàng)目編號(hào)：CARS-23-G32)。

鄧俊琳(1988— )，女，研究實(shí)習(xí)員，研究方向：功能食品加工。

劉小俊(1972— )，男，研究員，研究方向：瓜類(lèi)育種。