血管性癡呆模型小鼠海馬神經(jīng)元的電生理改變

韓 瑞 仇福成 李培培 王文婷 顧 平

(河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河北 石家莊 051000)

血管性癡呆模型小鼠海馬神經(jīng)元的電生理改變

韓 瑞 仇福成 李培培1王文婷 顧 平

(河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河北 石家莊 051000)

目的觀察血管性癡呆(VD)發(fā)病過(guò)程中神經(jīng)元的電生理改變。方法應(yīng)用被動(dòng)逃避反應(yīng)實(shí)驗(yàn)、神經(jīng)元硫堇染色技術(shù)、膜片鉗操作技術(shù)，對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的認(rèn)知功能及動(dòng)物海馬CA1區(qū)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)和密度進(jìn)行評(píng)價(jià)，進(jìn)而觀察神經(jīng)元的興奮性。結(jié)果與假手術(shù)組小鼠相比，模型組小鼠被動(dòng)逃避反應(yīng)實(shí)驗(yàn)成績(jī)明顯下降，海馬CA1區(qū)神經(jīng)元密度未見(jiàn)明顯改變，而海馬神經(jīng)元的興奮性出現(xiàn)了顯著降低。結(jié)論神經(jīng)元電興奮性的降低可能是導(dǎo)致VD的主要機(jī)制之一。

血管性癡呆；被動(dòng)逃避反應(yīng)實(shí)驗(yàn)；動(dòng)作電位

血管性癡呆(VD)是因腦組織血液循環(huán)障礙所致的一種獲得性、進(jìn)行性認(rèn)知功能障礙綜合征〔1〕。神經(jīng)元的信息傳遞是編碼為動(dòng)作電位的形式進(jìn)行的，如果神經(jīng)元受到損傷，動(dòng)作電位的形成變慢，信息的加工過(guò)程出現(xiàn)異常，進(jìn)而影響神經(jīng)元的功能〔2〕。海馬是學(xué)習(xí)記憶的關(guān)鍵中樞，也是缺血后最易受損的腦區(qū)之一〔3,4〕。本實(shí)驗(yàn)觀察VD小鼠海馬神經(jīng)元的電生理改變。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物模型和分組 將40只9月齡雄性C57小鼠隨機(jī)分為：①假手術(shù)組：只暴露雙側(cè)頸總動(dòng)脈，不阻斷血流。②模型組：分別暴露雙側(cè)頸總動(dòng)脈，反復(fù)夾閉雙側(cè)頸總動(dòng)脈3次，每次夾閉20 min，每次間隔10 min。

1.2避暗箱實(shí)驗(yàn) 術(shù)后第22天，開(kāi)始對(duì)所有動(dòng)物進(jìn)行避暗箱測(cè)試，采用被電次數(shù)和避暗潛伏期作為學(xué)習(xí)記憶的檢測(cè)指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)的第1天進(jìn)行適應(yīng)性訓(xùn)練：暗箱不通電，將小鼠以背向暗箱的方向放入透明箱中，令其可自由進(jìn)出暗箱，適應(yīng)5 min，記錄小鼠第1次進(jìn)入暗箱的時(shí)間為潛伏期。實(shí)驗(yàn)的第2天進(jìn)行認(rèn)知訓(xùn)練：暗箱通電，將小鼠以背向暗箱的方向放入透明箱中，訓(xùn)練5 min，記錄小鼠進(jìn)入暗箱被電次數(shù)。實(shí)驗(yàn)第3天進(jìn)行記憶檢測(cè)：暗箱通電，將小鼠以背向暗箱的方向放入透明箱中，記錄小鼠第1次進(jìn)入暗箱的時(shí)間即避暗潛伏期，如果在5 min內(nèi)小鼠不進(jìn)入暗箱，則避暗潛伏期記為300 s。

1.3腦組織病理學(xué)評(píng)價(jià) 動(dòng)物在行為學(xué)測(cè)定結(jié)束后，斷頭取腦，冠狀切取視交叉后1～4 mm腦組織，4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，常規(guī)腦組織切片(5 μm)，硫堇染色觀察海馬組織學(xué)改變。高倍鏡下計(jì)數(shù)海馬CA1區(qū)每1 mm區(qū)段內(nèi)細(xì)胞膜完整、胞核飽滿、核仁清晰的錐體細(xì)胞數(shù)目，每張切片海馬各計(jì)數(shù)3個(gè)區(qū)段取平均數(shù)為神經(jīng)元密度(ND)。

1.4電流鉗記錄 動(dòng)物在行為學(xué)測(cè)定結(jié)束后，將小鼠冰上快速斷頭取腦(1 min左右)，冠狀切去部分額部、枕部，枕部切面用瞬間黏合劑粘固到振動(dòng)切片機(jī)的平臺(tái)上。浸入冰水匯合氧飽和的人工腦脊液，在冠狀平面上切取5～6片皮層腦組織(300 μm厚度)。置于95%O2+5%CO2飽和的人工腦脊液孵育槽中，室溫下(21℃～26℃)孵育1 h備用。數(shù)據(jù)由MultiClamp 700B放大器采集，應(yīng)用全細(xì)胞電流鉗記錄模式，觀察了海馬CA1區(qū)神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢坏念l率。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1避暗箱實(shí)驗(yàn)結(jié)果 與假手術(shù)組〔(22.9±0.3)s〕比較，在被動(dòng)逃避反應(yīng)實(shí)驗(yàn)第1天訓(xùn)練階段的潛伏期在模型組無(wú)明顯變化〔(24.1±13.8)s，P>0.05〕。在避暗箱實(shí)驗(yàn)第2天學(xué)習(xí)階段，被電次數(shù)在模型組較假手術(shù)組顯著增多〔(2.7±1.2) vs (1.8±0.8)s,P<0.05〕。在實(shí)驗(yàn)第3天，與假手術(shù)組小鼠相比，被動(dòng)逃避潛伏期在模型組顯著縮短〔(174.2±105.3)vs (251.4±84.4)s，P<0.05〕。

2.2小鼠海馬CA1區(qū)病理學(xué)結(jié)果 假手術(shù)組和模型組小鼠海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞3～5層，排列整齊致密，細(xì)胞形態(tài)完整，胞核飽滿，核仁清晰，均無(wú)明顯細(xì)胞缺失，見(jiàn)圖1。與假手術(shù)組(257.7±15.3)相比，模型組小鼠海馬CA1區(qū)ND有降低趨勢(shì)，但結(jié)果無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(252.2±13.0，P>0.05)。

圖1 兩組海馬CA1區(qū)病理學(xué)結(jié)果(HE，×400)

2.3神經(jīng)元興奮性變化 與假手術(shù)組(23.3±3.3)相比，模型組小鼠海馬CA1區(qū)的神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢划a(chǎn)生個(gè)數(shù)(18.3±4.3)顯著減少(P<0.05)，見(jiàn)圖2。

圖2 兩組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢皇疽鈭D

3 討 論

本文VD動(dòng)物模型未觀察到神經(jīng)元結(jié)構(gòu)明顯損傷，與國(guó)內(nèi)其他的VD模型中所描述的不同〔5〕。文獻(xiàn)報(bào)道神經(jīng)元興奮性的降低可以引起認(rèn)知功能損傷〔6〕，本研究中也印證了這一電生理現(xiàn)象在VD中的作用。文獻(xiàn)報(bào)道改善神經(jīng)元興奮性可以提高個(gè)體的認(rèn)知功能〔7,8〕，這就為臨床治療VD提供了新的思路，開(kāi)發(fā)、尋找可以提高神經(jīng)元興奮性的藥物或物理治療方法，提高神經(jīng)元的興奮性；并以此為靶點(diǎn)為尋找改善VD認(rèn)知功能障礙的方法提供理論支持。調(diào)節(jié)神經(jīng)元興奮性的離子通道主要有鉀離子通道，L型鈣離子通道〔8,9〕，具體是何種離子通道特性的改變引起的神經(jīng)元興奮性變化，針對(duì)這些神經(jīng)元興奮性變化的離子通道機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。

1Roh JH,Lee JH.Recent updates on subcortical ischemic vascular dementia〔J〕.J Stroke,2014;16:18-26.

2Randall AD,Booth C,Brown JT.Age-related changes to Na+channel gating contribute to modified intrinsic neuronal excitability〔J〕.Neurobiol Aging,2012;33:2715-20.

3Lee CH,Yoo KY,Choi JH,etal.Neuronal damage is much delayed and microgliosis is more severe in the aged hippocampus induced by transient cerebral ischemia compared to the adult hippocampus〔J〕.J Neurol Sci,2010;294:1-6.

4Fjell AM,McEvoy L,Holland D,etal.What is normal in normal aging? Effects of aging,amyloid and Alzheimer′s disease on the cerebral cortex and the hippocampus〔J〕.Prog Neurobiol,2014;117C:20-40.

5Choi DH,Lee KH,Kim JH,etal.NADPH oxidase 1,a novel molecular source of ROS in hippocampal neuronal death in vascular dementia〔J〕.Antioxid Redox Signal,2013;21(4):533-50.

6McKay BM,Matthews EA,Oliveira FA,etal.Intrinsic neuronal excitability is reversibly altered by a single experience in fear conditioning〔J〕.J Neurophysiol,2009;102(5):2763-70.

7Xiao Z,Cilz NI,Kurada L,etal.Activation of neurotensin receptor 1 facilitates neuronal excitability and spatial learning and memory in the entorhinal cortex:beneficial actions in an Alzheimer′s disease model〔J〕.J Neuroscience,2014;34(20):7027-42.

8Rose GM,Ong VS,Woodruff-Pak DS.Efficacy of MEM 1003,a novel calcium channel blocker,in delay and trace eyeblink conditioning in older rabbits〔J〕.Neurobiol Aging,2007;28(5):766-73.

9Thibault O,Landfield PW.Increase in single L-type calcium channels in hippocampal neurons during aging〔J〕.Science,1996;272(5264):1017-20.

〔2016-04-17修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢(mèng)園)

顧 平(1970-)，女，博士，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師，主要從事老年神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病研究。

韓 瑞(1977-)，女，主治醫(yī)師，主要從事老年變性疾病研究。

R741.044

A

1005-9202(2017)17-4211-02；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2017.17.019

1 河北省古城縣醫(yī)院內(nèi)科