MMP-7在胃癌中表達(dá)上調(diào)的臨床病理意義及預(yù)后價(jià)值

沈小鋼，郭志義，趙高平，王 林

(四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院胃腸外科，四川 成都 610072)

MMP-7在胃癌中表達(dá)上調(diào)的臨床病理意義及預(yù)后價(jià)值

沈小鋼，郭志義，趙高平，王 林

(四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院胃腸外科，四川 成都 610072)

目的探討基質(zhì)金屬蛋白酶-7(MMP-7)的表達(dá)與胃癌臨床病理特征的關(guān)系以及對(duì)胃癌患者預(yù)后判斷的價(jià)值。方法采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)112例胃癌患者的癌組織和癌旁正常組織中MMP-7的表達(dá)。比較不同MMP-7表達(dá)水平胃癌患者的臨床病理學(xué)特征，以及患者的生存分析。結(jié)果MMP-7在胃癌組織中相對(duì)于正常胃黏膜組織高表達(dá)(P= 0.001)。胃癌患者M(jìn)MP-7表達(dá)上調(diào)，有更高的病理學(xué)分期(P= 0.037)，更深的組織浸潤(rùn)深度(P= 0.028)，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P= 0.015)和脈管浸潤(rùn)(P= 0.042)，以及更差的總體生存率(P= 0.008)和無病生存率(P= 0.015)。結(jié)論MMP-7在胃癌患者中高表達(dá)并預(yù)示著更差的術(shù)后生存率。

基質(zhì)金屬蛋白酶-7；胃癌；轉(zhuǎn)移；預(yù)后

全球每年新發(fā)胃癌951600例并導(dǎo)致723100例死亡[1]。盡管手術(shù)技術(shù)不斷提高化療藥物不斷發(fā)展，我國(guó)胃癌患者的五年生存率依然低于40%?；虻囊赘行砸约碍h(huán)境因素共同導(dǎo)致了腫瘤的發(fā)生已獲得了廣泛的共識(shí)。研究胃癌的侵襲和轉(zhuǎn)移對(duì)早期診斷胃癌，提高胃癌患者的預(yù)后具有重要意義?；|(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)是一類分泌蛋白水解酶，該蛋白酶能降解細(xì)胞外基質(zhì)，對(duì)血管生成、組織修復(fù)以及腫瘤浸潤(rùn)都有十分重要的作用[2]。基質(zhì)金屬蛋白酶-7(MMP-7)又稱基質(zhì)溶素，已有研究發(fā)現(xiàn)MMP-7蛋白在胃癌中高表達(dá)[3]。但目前對(duì)胃癌中MMP-7的mRNA表達(dá)水平知之甚少，更是缺乏其表達(dá)與胃癌患者預(yù)后關(guān)系的研究。本研究擬通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，研究MMP-7在胃癌及癌旁正常組織中的表達(dá)變化，分析不同表達(dá)水平胃癌患者的臨床病理學(xué)特征，以及不同的生存率，為胃癌的臨床診斷及治療提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料2011年7～12月在四川省人民醫(yī)院胃腸外科中心行胃癌根治術(shù)的患者112例，術(shù)前未接受放療或化療，術(shù)后給予常規(guī)化療。癌旁正常組織取材于距離腫瘤邊緣至少5厘米的胃正常黏膜組織。所有胃癌及胃正常黏膜組織均在標(biāo)本離體后第一時(shí)間采集并立即存放于液氮罐，最終存放于-80 ℃冰箱。術(shù)后依據(jù)國(guó)際抗癌聯(lián)盟第7版TNM分期對(duì)病員進(jìn)行病理分期?；颊叩碾S訪在術(shù)后的前兩年每3個(gè)月1次，之后每半年1次，包含體格檢查，腫瘤標(biāo)志物檢查，CT和胃鏡檢查。懷疑復(fù)發(fā)則通過活檢進(jìn)一步診斷?？偵嫫诙x為手術(shù)日至患者死亡的時(shí)間，無病生存期定義為手術(shù)日至癌癥復(fù)發(fā)或患者死亡的時(shí)間。該研究符合四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)所制定的倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)并通過該委員會(huì)批準(zhǔn)，所有受試對(duì)象術(shù)前均簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1引物序列與合成 本實(shí)驗(yàn)選取GADPH作為內(nèi)參基因，利用Taqman Gene Expression Assays軟件設(shè)計(jì)針對(duì)MMP-7和GADPH的特異性引物和探針由中國(guó)大連的Takara生物公司合成，如表1所示，并通過NCBI提供的BLAST程序驗(yàn)證了核酸序列的特異性。

表1 MMP-7與GADPH的引物及探針序列

1.2.2熒光定量PCR檢測(cè) 使用美國(guó)Invitrogen公司的Trizol試劑按照說明書的方法提取總RNA，用紫外分光光度計(jì)測(cè)量260和280 nm下的吸光度并進(jìn)行定量，計(jì)算D(260)/D(280)，所有標(biāo)本的比值要求在1.8～2.0之間。低于此值者表明其含有雜質(zhì)，用氯仿重新提純。利用美國(guó)Fermentas公司的第一鏈合成試劑盒將2μg的RNA逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA?；赥aqman探針技術(shù)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)被用于基因表達(dá)的相對(duì)定量檢測(cè)。該實(shí)驗(yàn)在美國(guó)BIO-RAD公司的iCycler iQ系統(tǒng)上完成。所用的反應(yīng)條件如下：預(yù)變性溫度 94 ℃：2分鐘，解鏈溫度94 ℃ ：20秒，退火溫度53 ℃：30秒，復(fù)性溫度72 ℃：30秒。共經(jīng)過50個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增結(jié)束后，每一個(gè)標(biāo)本都會(huì)得到一個(gè)Ct值，它是熒光信號(hào)超過閾值所需的循環(huán)數(shù)。PCR擴(kuò)增效率采用公式E=10-1/slope計(jì)算。MMP-7的相對(duì)表達(dá)率R的計(jì)算基于PCR擴(kuò)增效率E以及樣本和對(duì)照的差(ΔCt)。R = (EMMP-7)ΔCtMMP-7 (control-sample)/(Eβ-actin)ΔCtβ-actin (control-sample)。R>1時(shí)表明MMP-7在胃癌(樣本組)中相對(duì)于胃正常黏膜組織(對(duì)照組)高表達(dá)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用基于隨機(jī)化檢測(cè)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件REST(relative expression software tool)對(duì)MMP-7在胃癌及胃正常組織的表達(dá)變化進(jìn)行檢測(cè)[4]。SPSS 16.0軟件基于卡方檢驗(yàn)對(duì)MMP-7表達(dá)變化與胃癌臨床病理學(xué)指標(biāo)的差異進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析?；趯?duì)數(shù)秩檢驗(yàn)的Kaplan-Meier法進(jìn)行生存分析。P< 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1MMP-7在胃癌和胃正常黏膜的表達(dá)變化MMP-7 mRNA在所有標(biāo)本中均能被檢測(cè)，RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為設(shè)計(jì)長(zhǎng)度(MMP-7，122bp；GADPH，141bp)。在50個(gè)擴(kuò)增循環(huán)中未發(fā)現(xiàn)引物二聚體。將5個(gè)等比例濃度梯度的cDNA進(jìn)行擴(kuò)增后得到的Ct值輸入REST軟件則獲得本反應(yīng)體系下PCR擴(kuò)增效率。在本實(shí)驗(yàn)中MMP-7和GADPH的PCR擴(kuò)增效率分別為1.88和1.72。在所有的112份配對(duì)的樣本中，86例R>1，這表明MMP-7在這些患者的癌組織中相對(duì)于正常黏膜組織高表達(dá)。如表2所示，MMP-7在胃癌的表達(dá)強(qiáng)度是其在胃正常黏膜中表達(dá)強(qiáng)度的4.382倍(P= 0.001)。

表2 REST軟件對(duì)胃癌和胃正常黏膜中MMP-7表達(dá)變化的輸出結(jié)果

2.2MMP-7不同表達(dá)水平下胃癌臨床病理特征的比較如表3所示，在MMP-7表達(dá)上調(diào)和表達(dá)下調(diào)中，胃癌的TNM分期、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、脈管浸潤(rùn)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.05)，而性別、年齡、腫瘤大小及分化程度比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P> 0.05)。

表3 MMP-7不同表達(dá)水平胃癌臨床病理學(xué)特征的比較

2.3不同MMP-7表達(dá)水平胃癌患者的生存分析

無論是總生存率(P= 0.008)還是無病生存率(P= 0.015)，MMP-7表達(dá)上調(diào)的胃癌患者均較其表達(dá)下調(diào)的患者差。胃癌的中位生存時(shí)間及五年生存率在MMP-7表達(dá)上調(diào)和下調(diào)的患者中分別是26個(gè)月和40.7%以及66個(gè)月和69.2%。

圖1 不同MMP-7表達(dá)水平胃癌患者的生存曲線

圖2 不同MMP-7表達(dá)水平胃癌患者的無病生存率

3 討論

癌癥轉(zhuǎn)移的機(jī)制至今尚未完全闡明，是一個(gè)多步驟、多階段的復(fù)雜過程。一般認(rèn)為癌細(xì)胞需穿過細(xì)胞外基質(zhì)以及脈管基底膜進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)從而發(fā)生全身轉(zhuǎn)移。其中對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)和脈管基底膜的降解是其必要條件。MMPs已被證明可以降解細(xì)胞外基質(zhì)和脈管基底膜，能夠促進(jìn)腫瘤新生血管的形成，與腫瘤的浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[5]。1988年被首次報(bào)道的MMP-7基因位于11號(hào)染色體，包含有267個(gè)氨基酸，因其缺乏碳末端蛋白結(jié)構(gòu)域是MMPs家族中最小的成員[6]。MMP-7在眾多腫瘤組織中過表達(dá)，被認(rèn)為在細(xì)胞增殖、凋亡、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移以及血管生成等多個(gè)環(huán)節(jié)參與了腫瘤的發(fā)展。

本研究通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)在112例配對(duì)的胃癌組織及癌旁正常黏膜組織中MMP-7的表達(dá)變化，進(jìn)一步證實(shí)在mRNA水平，相對(duì)于正常胃黏膜，MMP-7在胃癌中高表達(dá)。MMP-7表達(dá)上調(diào)的胃癌患者中，TNM分期更晚，腫瘤浸潤(rùn)深度更深，更易出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和脈管浸潤(rùn)。由此可知MMP-7隨胃癌的發(fā)展而表達(dá)逐漸增高。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的胃癌患者M(jìn)MP-7表達(dá)上調(diào)的概率更高，這與既往的報(bào)道一致[7]。這表明MMP-7表達(dá)與腫瘤的轉(zhuǎn)移相關(guān)，而腫瘤的轉(zhuǎn)移與腫瘤患者的預(yù)后密切相關(guān)，同時(shí)本研究通過生存分析直接觀察到MMP-7表達(dá)上調(diào)的患者壽命更短，腫瘤也更容易復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移。前期已有報(bào)道表明在喉癌、結(jié)直腸癌及食管癌患者中，MMP-7表達(dá)高則意味著更差的預(yù)后[8～10]。是否在更多的腫瘤中MMP-7也具有相同的判斷預(yù)后能力，則需要進(jìn)一步的研究。

該研究采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)發(fā)現(xiàn)MMP-7在胃癌組織中的表達(dá)顯著高于胃正常黏膜組織，且MMP-7不同表達(dá)水平的胃癌患者病理分期、腫瘤浸潤(rùn)深度、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和脈管浸潤(rùn)是有差異的，表明MMP-7在胃癌的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移中發(fā)揮了重要的作用。而MMP-7高表達(dá)的胃癌患者有著更差的預(yù)后則表明該基因有望成為判斷胃癌患者預(yù)后的生物標(biāo)志物。能否通過RNA干擾技術(shù)下調(diào)MMP-7表達(dá)來治療胃癌，需要下一步研究和實(shí)驗(yàn)證明。

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ClinicopathologicalandprognosticsignificanceofupregulatedMMP-7ingastriccancer

SHENXiao-gang，GUOZhi-yi，ZHAOGao-ping，WANGLin

(DepartmentofGastrointestinalSurgery，SichuanAcademyofMedicalSciences&SichuanProvincialPeople’sHospital，Chengdu610072，China)

ObjectiveTo evaluate the clinicopathological significance of MMP-7 expression and investigate its prognostic value in gastric cancer.MethodsMMP-7 mRNA expression in cancerous tissue and corresponding normal mucosa tissue from 112 gastric cancer patients were analyzed by quantitative real-time RT-PCR.The clinicopathological characteristics and survival rates were compared among patients with various expression levels.ResultsThe expression of MMP-7 mRNA was found to be upregulated in cancerous tissue compared to normal mucosa tissue (P= 0.001).The expression levels were associated with advanced TNM stage (P= 0.037)，enhanced penetration depth (P= 0.028)，lymph node metastasis (P= 0.015) and vessel invasion (P= 0.042).Patients with upregulated MMP-7 showed a worse overall survival (P= 0.008) and disease free survival (P= 0.015).ConclusionThe expression of MMP-7 is upregultaed in cancer and associated with a decreased survival rate in patients with gastric cancer.

MMP-7；Gastric cancer；Metastasis；Prognosis

R735.2

A

1672-6170(2017)05-0128-04

2017-02-18；

2017-05-22)