耐低鉀山羊草基因型的篩選與鑒定

張正社， 牛 娜， 宋瑜龍， 馬守才， 張改生， 王軍衛(wèi)*

(1. 西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院 國家楊凌農(nóng)業(yè)生物技術(shù)育種中心/國家小麥改良中心楊凌分中心/小麥育種教育部 工程研究中心/陜西省作物雜種優(yōu)勢研究與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 陜西 楊凌 712100；2. 旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國家重點(diǎn) 實(shí)驗(yàn)室， 陜西 楊凌 712100；3. 草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院， 甘肅 蘭州 730020)

我國土壤全鉀含量在0.05%～2.5%之間，呈由南向北降低趨勢，鉀元素的虧缺是一個全國性的嚴(yán)重問題[1]。目前我國耕地有30%以上表現(xiàn)為缺鉀(有效鉀含量小于50 mg·kg-1)甚至嚴(yán)重缺鉀，土壤供鉀不足已嚴(yán)重影響著農(nóng)作物的生產(chǎn)[2]。相關(guān)調(diào)查顯示，目前我國耕地土壤速效鉀含量依然在逐年減少，年減少量已達(dá)到0.58～3.32 mg·kg-1。雖然農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上每年都會施入大量的鉀肥，但是鉀元素的當(dāng)季利用率較低，僅有20%～60%，加之我國又是鉀礦資源缺乏的國家[3]。因此，發(fā)掘優(yōu)良的種質(zhì)資源，培育耐低鉀品種，已成為眾多研究者亟需解決的問題。

鉀作為植物生長發(fā)育的必要元素，參與植物體內(nèi)60多種酶的活化，對于提高作物產(chǎn)量、改善作物品質(zhì)、增強(qiáng)作物的抗逆性起著非常重要的作用[4-6]。有關(guān)基因型耐低鉀指標(biāo)的篩選及鑒定的研究在國外開展較早[7]，國內(nèi)起步較晚，且多集中于水稻(Oryzasativa)[8-9]、玉米(Zeamays)[10]、甘薯(Ipomoeabatatas)[1]、棉花(Gossypiumspp)[11]、大麥(Hordeumvulgare)[12]、小麥(Triticumaestivum)[13]等作物，而有關(guān)山羊草(Aegilops)的研究目前尚未見報(bào)道。山羊草是小麥的近緣屬植物，在生物進(jìn)化過程中，山羊草不但適應(yīng)了各種逆境條件，而且還保留了許多優(yōu)良的抗逆特性，因此，被廣泛應(yīng)用為遠(yuǎn)緣雜交育種的試驗(yàn)材料[14]。

本研究以小麥的近緣種山羊草為試驗(yàn)材料，采用水培方法研究低鉀條件下不同山羊草種質(zhì)苗期的生長發(fā)育及鉀營養(yǎng)特性，基于多項(xiàng)指標(biāo)計(jì)算隸屬函數(shù)值，綜合評價供試山羊草種質(zhì)的耐低鉀脅迫特性，篩選和鑒定耐低鉀基因型，為進(jìn)一步研究山羊草的耐低鉀分子機(jī)制，以及育種上利用耐低鉀山羊草種質(zhì)提供了材料和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用材料為9個山羊草種質(zhì)(表1)，由西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院小麥雜優(yōu)利用課題組提供。

表1 供試山羊草種質(zhì)Table 1 Aegilops germplasm

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1盆栽試驗(yàn) 挑選籽粒均勻、飽滿的山羊草種子，首先用9%的雙氧水對種子進(jìn)行30 min的消毒，然后用蒸餾水沖洗干凈，浸泡在培養(yǎng)皿中放入恒溫(21℃)培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)至露白，等出芽后轉(zhuǎn)移至光照條件下，根據(jù)情況補(bǔ)充水分培養(yǎng)2天，挑選長勢均勻的幼苗移栽到80 mm×120 mm花盆中，1～2 mm石英砂做基質(zhì)。移栽初期用蒸餾水澆苗，等幼苗長到三葉期使用Hoagland營養(yǎng)液(pH=6.0，表2)處理幼苗[11]。試驗(yàn)設(shè)正常供鉀(2.0 mmol·L-1KCl)和低鉀(0.02 mmol·L-1KCl)兩個處理，每種山羊草種4盆，每盆5株，其中1盆作為對照，其余3盆為重復(fù)處理[11,13]。從第一次營養(yǎng)液處理開始計(jì)時，每2天澆一次營養(yǎng)液，連續(xù)處理40天。培養(yǎng)過程中觀察葉色、葉形等的變化，并進(jìn)行拍照記錄。盆栽試驗(yàn)于2014年3月-4月在西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院綜合樓實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，室溫保持在21℃，每天保持光照12小時。

表2 營養(yǎng)液配方Table 2 Nutrient solution formula

注：*正常鉀濃度為2.0 mmol·L-1，低鉀濃度為0.02 mmol·L-1
Note: *Normal potassium level was 2.0 mmol·L-1KCl, low potassium level was 0.02 mmol·L-1KCl

1.2.2測定指標(biāo)及方法 在山羊草的六葉期，對植株進(jìn)行收獲，地上部和根部分開，分別裝入紙袋中。置于烘箱內(nèi)進(jìn)行105℃殺青30 min。80℃下烘干8 h，稱重，再烘干2 h 稱重，兩次重量差異在1% 內(nèi)即可。否則再進(jìn)行烘烤。

測定指標(biāo)：根長、地上部長、根冠比、根干重、地上部干重、含鉀量、鉀積累量、鉀利用效率。鉀利用效率 = 全株干重/全株鉀積累量，鉀積累量 = 植株干重×植株含鉀量[15]。

含鉀量用火焰分光光度計(jì)測定[16]。采用濃H2SO4-H2O2消煮法制備待測液，并利用原子吸收光譜儀(由西北農(nóng)林科技大學(xué)水土保持研究所提供)測定鉀離子含量。鉀含量的計(jì)算方法[17]：K/% = (c×V×ts× 10-4)·m-1

式中，c：從標(biāo)準(zhǔn)曲線查得顯色液鉀離子的質(zhì)量濃度(mg·L-1)；V：顯色液體積(mL)；ts：分取倍數(shù)；m：烘干樣品質(zhì)量(g)。

1.2.3數(shù)據(jù)分析 為消除不同種質(zhì)個體間的差異，不同種類山羊草間的相互比較用相對值(相對性狀值=低鉀狀態(tài)下性狀值/正常供鉀狀態(tài)下同一性狀值)，同一種山羊草的不同處理比較用絕對值(實(shí)際測量值)。

用Excel軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，利用SPSS軟件對處理后數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性分析、主成分分析[18]。并利用隸屬函數(shù)值對幾種山羊草的耐低鉀特性進(jìn)行綜合評價[13,19-22]。運(yùn)用公式如下：

U(Xj) = (Xj-Xmin)·(Xmax-Xmin)-1
j= 1, 2……n

(1)

Wj=Pj·(∑Pj)-1j= 1, 2 …… n

(2)

Di= ∑[U(Xj) ×Wj]i= 1, 2 …… k

(3)

隸屬函數(shù)值公式(1)中Xj表示第j個因子得分值，Xmin，Xmax分別表示第j個因子得分的最小值和最大值。

權(quán)重公式(2)中Wj表示第j個公因子在所有公因子中的重要程度，Pj為第j個公因子的貢獻(xiàn)率。

綜合評價公式(3)中Di為材料在低鉀條件下用綜合指標(biāo)評價所得的耐低鉀特性綜合評價值，k為材料個數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 山羊草苗期表型觀察

在提供正常鉀素水平培養(yǎng)液的情況下，幼苗生長良好，莖稈粗壯、直立，葉色青綠，生長正常；在缺鉀條件下，僅有個別材料與對照差異不明顯外，其余材料同對照相比均表現(xiàn)出莖短細(xì)弱，葉色暗淡且沒有光澤，并出現(xiàn)倒伏(圖1)。其病狀首先出現(xiàn)在老葉上，表現(xiàn)為缺綠斑點(diǎn)，有些甚至呈燒焦?fàn)?，呈現(xiàn)出明顯的缺鉀癥狀。

2.2 山羊草苗期耐低鉀基因型篩選指標(biāo)分析

確定有效地篩選指標(biāo)對篩選山羊草鉀高效基因型至關(guān)重要，而基因型變異程度是衡量篩選指標(biāo)是否適宜的重要依據(jù)，變異程度越大，說明該性狀指標(biāo)越能代表基因型間的差異。如表3和表4所示，不同基因型山羊草(苗期)不同鉀素處理水平下，各性狀間表現(xiàn)出很大差異，在正常鉀處理?xiàng)l件下，變異系數(shù)較大的性狀是根長、根冠比、地上干重、鉀積累量和鉀利用效率，其最大值和最小值的倍數(shù)關(guān)系分別是4.67，3.19，47.84，78和2.33；在低鉀處理?xiàng)l件下，變異系數(shù)較大的性狀是根長、根冠比、地上干重、含鉀量、鉀積累量和鉀利用效率，其最大值和最小值的倍數(shù)關(guān)系分別是16.95，4.15，18.5，2.83，13.2和2.75。

圖1 9種山羊草在不同鉀水平下的苗期生長表現(xiàn)Fig.1 Growth performances of nine Aegilops genotype germplasms in the seedling stage under different potassium levels

表3 正常鉀處理下山羊草苗期各指標(biāo)的變異Table 3 Variation of indexes in the seedling stage of Aegilops under normal potassium treatment setting

表4 低鉀處理下山羊草苗期各指標(biāo)的變異Table 4 Variation of indexes in the seedling stage of Aegilops under low potassium treatment setting

為了消除基因型間自身生物學(xué)特性的差異，確定主要篩選指標(biāo)，對變異系數(shù)較大的5個性狀指標(biāo)在正常鉀處理和低鉀處理水平下的相對變化做進(jìn)一步分析。結(jié)果如表5所示，變異系數(shù)的大小為相對地上干重(105%)>相對鉀積累量(104.64%)>相對鉀利用效率(37.11%)>相對根長(29.30%)>相對根冠比(28.80%)，這5個性狀變異系數(shù)均較大，說明他們對于不同山羊草基因型的耐低鉀的靈敏度較高，可以作為苗期鉀高效種質(zhì)篩選的重要指標(biāo)。

表5 不同鉀處理水平下山羊草苗期各指標(biāo)的變異表現(xiàn)Table 5 Variation of indexes in the seedling stage of different potassium treatment setting

表6 低鉀條件下山羊草不同基因型各指標(biāo)的相關(guān)系數(shù)矩陣Table 6 Correlation matrix of indexes of different Aegilops in low potassium treatment setting

2.3 山羊草苗期各生長指標(biāo)的相關(guān)分析

將相對根冠比、相對根長、相對地上部干重、相對鉀積累量和相對鉀利用效率這5個指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)分析(表6)，其中相對地上部干重與相對鉀積累量呈極顯著正相關(guān)(r= 0.875，N = 130，P<0.01)，與相對根冠比呈顯著正相關(guān)(r= 0.224，N = 130，P<0.05)，相對鉀積累量與相對鉀利用效率呈極顯著負(fù)相關(guān)(r= -0.321，N = 130，P<0.01)，相對根冠比與相對根長呈極顯著正相關(guān)(r= 0.773，N=130，P<0.01)，說明地上部干重隨鉀積累量增大而增大。

2.4 山羊草苗期生長指標(biāo)的主成分分析

與對照相比，低鉀脅迫處理后的9種山羊草植株受到不同程度的影響。根據(jù)其相對指標(biāo)(表5)，進(jìn)行相關(guān)分析(表6)可以看出，9種山羊草的5個相對指標(biāo)之間都存在一定的相關(guān)性，從而使得他們所提供的信息發(fā)生重疊，同時各指標(biāo)在耐低鉀中所起的作用也不盡相同。所以直接利用這些單個指標(biāo)進(jìn)行耐低鉀評價具有片面性。

對9種山羊草的5個相對指標(biāo)進(jìn)行主成分分析，提取3個綜合指標(biāo)(表7)，其貢獻(xiàn)率分別為41.34%，33.02%和20.53%，累積貢獻(xiàn)率達(dá)94.89%。第一主成分包括相對地上干重和相對鉀積累量；第二主成分包括相對根冠比和相對根長；第三主成分包括相對鉀利用率。這樣，把原來5個單項(xiàng)指標(biāo)轉(zhuǎn)換為3個新的相互獨(dú)立的綜合指標(biāo)。

表7 各綜合指標(biāo)的系數(shù)及貢獻(xiàn)率Table 7 Coefficient of comprehensive indicates and proportion

2.5 不同種類山羊草耐低鉀基因型的鑒定結(jié)果

根據(jù)因子得分值，由公式(1)分別求出9種山羊草所有因子的隸屬函數(shù)值U(x)(表7)。再根據(jù)3個綜合指標(biāo)貢獻(xiàn)率大小，由公式(2)分別求出各綜合指標(biāo)的權(quán)重[19]。利用綜合指標(biāo)評價公式(3)求出綜合評價值D。根據(jù)各綜合指標(biāo)的指標(biāo)系數(shù)及各單項(xiàng)指標(biāo)的相對值，分別計(jì)算出每種山羊草的3個綜合指標(biāo)的得分值C(x)(表8)。

綜合評價值(D值)反映了各材料耐低鉀能力的大小，數(shù)值越大，表明耐低鉀脅迫能力越強(qiáng)。結(jié)果顯示：雙角山羊草、偏凸山羊草、粗厚山羊草、擬斯卑爾托山羊草、尾狀山羊草、粘果山羊草、易變山羊草、歐山羊草、小傘山羊草的D值分別為0.383，0.898，0.327，0.516，0.007，0.682，0.338，0.346，0.655。由此可知，耐低鉀脅迫能力強(qiáng)弱順序?yàn)椋浩股窖虿?粘果山羊草>小傘山羊草>擬斯卑爾托山羊草>雙角山羊草>歐山羊草>易變山羊草>粗厚山羊草>尾狀山羊草。

表8 9種山羊草的公因子得分值C(x)、隸屬函數(shù)值U(x)、綜合評價值DTable 8 The values of component score C(x), subordinative function U(x) and comprehensive evaluation D of 9 different genotypes of Aegilops

3 討論

隸屬函數(shù)分析是一種在多指標(biāo)測定的基礎(chǔ)上對材料進(jìn)行綜合評價的方法，將其應(yīng)用于植物耐低鉀種質(zhì)的的篩選，更具科學(xué)性和可靠性。植物體是一個統(tǒng)一的有機(jī)體，所測的生理指標(biāo)可能性質(zhì)相同或相互關(guān)聯(lián)，如果使用單個指標(biāo)來評價某種植物的耐低鉀性質(zhì)則會對結(jié)果造成偏差。山羊草耐低鉀脅迫是一個復(fù)雜的、受多因素影響的數(shù)量性狀。不同山羊草的耐低鉀機(jī)制不盡相同，同時，不同山羊草對某一具體指標(biāo)的耐低鉀性質(zhì)反映也不盡相同，因此，單一指標(biāo)難以準(zhǔn)確全面的反映其耐低鉀性的強(qiáng)弱。本研究選用主成分分析法將原來個數(shù)較多的且彼此關(guān)系錯綜復(fù)雜的指標(biāo)轉(zhuǎn)換為新的、個數(shù)較少的且彼此獨(dú)立的綜合指標(biāo)[23-25]。這些綜合指標(biāo)既能多方面的反映原生理指標(biāo)的信息，又能將差異不十分明顯的各個原指標(biāo)的信息集中表現(xiàn)出來。之后，在綜合指標(biāo)的基礎(chǔ)上，運(yùn)用隸屬函數(shù)法進(jìn)行綜合評價得到的結(jié)果更加可靠。

不同的試驗(yàn)方法得出的結(jié)論可能會有差異，本試驗(yàn)采用的方法為營養(yǎng)液培養(yǎng)，該方法的優(yōu)點(diǎn)是培養(yǎng)過程容易控制，其他常用方法還有大田試驗(yàn)、盆栽試驗(yàn)等，但是這些方法很難控制單一元素的缺乏研究，對山羊草耐低鉀種質(zhì)篩選而言不可行，而采用營養(yǎng)液培養(yǎng)法更為簡單有效，因此可以作為山羊草耐低鉀種質(zhì)篩選的首選方法[9, 26]。根據(jù)山羊草苗期生長的表型觀察，僅有個別材料在低鉀條件下表型與對照差異不明顯，其余材料同對照相比均表現(xiàn)出莖短細(xì)弱，葉色暗淡且沒有光澤，并出現(xiàn)倒伏。其病狀首先出現(xiàn)在老葉上，表現(xiàn)為缺綠斑點(diǎn)，有些甚至呈燒焦?fàn)?，呈現(xiàn)出明顯的缺鉀癥狀。這些特征與其他作物在低鉀處理下的變化一致[27-29]。

通過對9種山羊草在低鉀脅迫條件下相應(yīng)指標(biāo)的測定，利用隸屬函數(shù)加權(quán)平均法，得到耐低鉀性度量值(D值)。研究結(jié)果表明，偏凸山羊草的耐低鉀能力最強(qiáng)，尾狀山羊草耐低鉀能力最弱。種質(zhì)間耐低鉀的差異具有可比性，同時也可根據(jù)需求將其劃分為不同的耐低鉀類型。這樣，既考慮了各指標(biāo)間的相互關(guān)系，又考慮到各指標(biāo)的重要性，從而使得出的結(jié)論與實(shí)際結(jié)果較為接近。

小麥?zhǔn)俏覈饕Z食作物之一，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中占有重要的地位。隨著社會的發(fā)展，小麥的產(chǎn)量越來越受到民眾的關(guān)注。生產(chǎn)上，為了提高小麥產(chǎn)量，人們大量的施用鉀肥，這不僅增加了生產(chǎn)成本，而且還加劇了鉀礦資源的消耗。由于小麥耐低鉀育種材料有限，因此通過育種方法直接選育可應(yīng)用于生產(chǎn)的小麥耐低鉀品種困難較大。因此本研究擬通過研究山羊草的耐低鉀脅迫特性，篩選和鑒定出耐低鉀山羊草種質(zhì)(偏凸山羊草)，后續(xù)希望進(jìn)一步研究其耐低鉀脅迫抗性基因，并通過基因工程等手段將耐低鉀脅迫抗性基因轉(zhuǎn)入到小麥中，從而改善小麥耐低鉀的性質(zhì)，獲得耐低鉀的小麥育種材料，直接或間接培育耐低鉀小麥品種。

4 結(jié)論

本研究以9種不同基因型山羊草為供試材料，采用改進(jìn)的Hoagland培養(yǎng)液及砂培盆栽的方法，設(shè)低鉀和正常供鉀兩個水平，地上部干重、鉀積累量和鉀利用效率可以作為苗期耐低鉀種質(zhì)篩選的重要指標(biāo)；通過主成分分析將5個單項(xiàng)指標(biāo)轉(zhuǎn)化為3個相互獨(dú)立的綜合指標(biāo)，并利用隸屬函數(shù)法進(jìn)行耐低鉀性狀綜合評價，得出耐低鉀強(qiáng)弱順序?yàn)椋浩股窖虿?粘果山羊草>小傘山羊草>擬斯卑爾托山羊草>雙角山羊草>歐山羊草>易變山羊草>粗厚山羊草>尾狀山羊草，這與苗期表型觀察結(jié)果基本相一致。本研究初步建立了山羊草耐低鉀種質(zhì)的評價指標(biāo)，分析了9種山羊草的耐低鉀特性，為進(jìn)一步研究山羊草的耐低鉀分子機(jī)制，以及育種上利用耐低鉀山羊草種質(zhì)提供了材料和理論依據(jù)。