人工老化對納羅克非洲狗尾草種子活力、生理生化指標(biāo)的影響

馬向麗， 何 超， 羅富成*， 許文花， 鄧菊芬， 韓 博， 段新慧， 張桓溥

(1. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院草學(xué)系， 云南 昆明 650201； 2. 成都蓉橙九天生物科技有限公司， 四川 成都 610217；3. 云南省草山飼料工作站， 云南 昆明 650225)

納羅克非洲狗尾草(Setariasphacelata‘Narok’) 于1983 年從澳大利亞引入云南，并于1997 年11 月被登記為引進(jìn)品種[1]，在我國南方地區(qū)推廣種植已超過30 年。作為特色優(yōu)良牧草，納羅克非洲狗尾草在南方的種植面積不斷擴(kuò)大，目前僅云南省就超過7 萬hm2，已成為我國南方暖溫帶至中亞熱帶草地生態(tài)建設(shè)的骨干品種。該草經(jīng)濟(jì)效益高，生長速度快，生長年限長，分蘗能力強(qiáng)，飼草粗蛋白質(zhì)含量高，家畜適口性好[2-6]，但種子產(chǎn)量低，質(zhì)量差，休眠嚴(yán)重，發(fā)芽率僅為10%左右[7-9]，這使得南方很多地區(qū)種子供需矛盾突出，嚴(yán)重制約了該優(yōu)質(zhì)牧草的推廣利用。

種子老化是指種子自然成熟后進(jìn)入衰老過程，生活力逐漸喪失。老化是種子貯藏中普遍存在的一種現(xiàn)象，是一個隨著種子貯藏時間的延長而發(fā)生和發(fā)展的、自然而不可避免的過程[10-11]。種子老化涉及眾多復(fù)雜的生理生化反應(yīng)過程[12-13]。普通貯藏條件下種子自然老化非常緩慢, 人工加速老化方法是由 Delouche于 1965年首創(chuàng)的種子質(zhì)量檢驗(yàn)方法[14]，通過高溫高濕法加速種子老化劣變，使種子活力差別加大，然后測定種子某些生理生化變化，揭示這些變化與種子生活力及活力之間的相互關(guān)系，了解種子劣變的內(nèi)在機(jī)理，預(yù)測種子的耐藏力和生長表現(xiàn)。人工加速老化研究主要集中于糧食作物、經(jīng)濟(jì)作物和蔬菜種子方面，并開展了大量的標(biāo)準(zhǔn)化工作[15-18]。在牧草方面，已用于草地早熟禾(PoapratensisL.)[19]、燕麥(AvenasativaL.)[20]、高羊茅(FestucaelataKeng ex E.Alexeev.)[21]、紅三葉(TrifoliumpratenseL.)[22]、草地雀麥(BromusjaponicasThunb.)[23]和多年生黑麥草(LoliumperenneL.)[24]等種類的研究。但在非洲狗尾草種子方面的研究并不多見，僅翁玲等[25]對非洲狗尾草種子人工加速老化條件進(jìn)行了篩選。

本文對收獲后未貯藏的非洲狗尾草種子進(jìn)行人工加速老化處理，測定了老化過程中種子發(fā)芽率、酶活性、貯藏物質(zhì)含量及萌發(fā)抑制物活性的變化，旨在闡明種子活力變化的內(nèi)在規(guī)律，了解種子發(fā)生劣變的機(jī)理。這對非洲狗尾草種子的合理貯藏和陳種子的利用有重要意義,也可為延緩貯藏中的劣變過程提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗(yàn)材料為種植于云南農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)科學(xué)實(shí)習(xí)基地的納羅克非洲狗尾草，種子成熟收獲后，隨機(jī)稱取清選好的凈種子4份，每份10.00 g，置于40±1℃、95%RH的條件下分別進(jìn)行1，2，3，4 d的加速老化。種子取出后在陰涼條件下干燥至原始含水量后備用[26]。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1種子活力指標(biāo)的測定 參考云南省地方標(biāo)準(zhǔn)《牧草種子檢驗(yàn)章程》[27]，采用紙上發(fā)芽法，每個處理取100粒種子置于(25±1)℃、24 h光照的人工氣候箱中發(fā)芽，計算種子發(fā)芽率和活力指數(shù)。計算公式如下：

活力指數(shù)=幼苗單株干重×發(fā)芽指數(shù)

1.2.2種子生理生化指標(biāo)的測定 種子抗氧化酶活性和貯藏物質(zhì)含量按孫群[28]的方法，其中SOD活性采用氮藍(lán)四唑法(NBT法)，POD活性采用愈創(chuàng)木酚法，CAT活性采用紫外吸收法，可溶性糖含量采用蒽酮比色法，可溶性蛋白含量采用考馬斯亮藍(lán)G-250法，MDA含量采用硫代巴比妥酸法測定。各指標(biāo)重復(fù)3次。

1.2.3種子萌發(fā)抑制物活性的測定 參考王炎等[29]的方法，分別稱取各處理種子5.00 g，用研缽磨碎后加入適量蒸餾水，放入錐形瓶內(nèi)，置于25℃恒溫箱浸提24 h，過濾浸提液，殘渣再浸提2次，定容至50 mL，于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

參考趙敏等[30]的方法進(jìn)行白菜種子萌發(fā)試驗(yàn)，受試白菜種子為‘水漲趴BC-1’號，純度≥90.0%，凈度≥95.0%，水份≤8.0%。以蒸餾水澆灌萌發(fā)白菜種子為對照(CK)，人工老化前后納羅克非洲狗尾草種子蒸餾水浸提液澆灌萌發(fā)白菜種子為各處理，在鋪有2 層濾紙的培養(yǎng)皿(d=90 mm)中，加入6 mL蒸餾水或各處理種子粗提液，于25℃下恒溫培養(yǎng)，對照及各處理均重復(fù)3 次，每皿100 粒白菜子，24 h統(tǒng)計發(fā)芽率，48 h統(tǒng)計胚芽和胚根長。相對發(fā)芽率、相對胚芽長、相對胚根長由測量值除以對照值乘100%計算而得。

1.2.3數(shù)據(jù)分析 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行方差分析，采用Excel作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 人工老化對種子活力的影響

2.1.1人工老化對種子發(fā)芽率的影響 隨著老化處理時間的延長，納羅克非洲狗尾草種子發(fā)芽率呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(圖1)。短期老化處理(1～2 d)可顯著提高種子發(fā)芽率(P<0.05)。其中，以老化處理1 d時種子的發(fā)芽率最高(23.3%)，是對照(老化0 d)的1.52倍(P<0.05)，與處理2 d的種子發(fā)芽率差異不顯著。老化4 d后的種子發(fā)芽率僅為12.33%，為各處理中最低，比對照下降了19.57%(P<0.05)。

圖1 不同老化時間對納羅克非洲狗尾草種子發(fā)芽率的影響Fig.1 Effect of different artificial aging timeon germination percentage of 'Narok' seeds

2.1.2人工老化對種子活力指數(shù)的影響 納羅克非洲狗尾草種子經(jīng)老化處理后，種子活力指數(shù)先升高后降低(圖2)，短期老化處理(1～2 d)能顯著提高種子活力(P<0.05)。處理1 d后種子活力指數(shù)達(dá)到最高值0.005，是對照(老化0 d)的1.72倍(P<0.05)，但與處理2 d的無顯著差異，隨著老化時間的延長，種子活力指數(shù)下降，至處理3 d后僅為0.0018，與對照相比下降了40.06%(P<0.05)。

2.2 人工老化對種子保護(hù)酶系統(tǒng)的影響

2.2.1人工老化對種子SOD活性的影響 人工老化處理能顯著提高納羅克非洲狗尾草種子SOD活性(P<0.05)，且增加效果隨老化時間的延長先增高后降低(圖3)，呈現(xiàn)出3個時期，驟升期：0～2 d，平穩(wěn)期：2～3 d，下降期：3～4 d。老化處理第3 天SOD活性達(dá)到最高值(3348.358 U·g-1FW·h-1)，是對照(老化0 d)的 2.66倍，與處理2 d差異不顯著。隨著老化程度的進(jìn)一步加深，SOD活性快速下降，至老化4 d時僅為2096.514 U·g-1FW·h-1，但仍比對照高出66.24%(P<0.05)。

圖2 不同老化時間對納羅克非洲狗尾草種子活力指數(shù)的影響Fig.2 Effect of different artificial aging time on vigor index of ‘Narok’ seeds

圖3 不同老化處理時間對納羅克非洲狗尾草種子保護(hù)酶活性的影響Fig.3 Effect of different artificial aging time on the activities of protective enzymes of ‘Narok’ seeds

2.2.2人工老化對種子POD活性的影響 隨著老化時間的延長，納羅克非洲狗尾草種子POD活性呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(圖3)，老化1～2 d種子POD活性有所提高(P<0.05)，老化處理1 d時，種子POD活性達(dá)到最高(2 870.667 U·g-1FW·min-1)，為對照(2 099.333 U·g-1FW·min-1)的1.37倍(P<0.05)，與老化處理2 d無顯著差異。隨著種子老化程度的進(jìn)一步加深，POD活性快速下降，老化3～4 d POD活性呈降低趨勢(P<0.05)。老化處理4 d后，POD活性降至最低(1 687.333 U·g-1FW·min-，)，顯著低于對照(P<0.05)。

2.2.3人工老化對種子CAT活性的影響 隨老化時間的延長，納羅克非洲狗尾草種子CAT活性呈現(xiàn)出先升高后降低再升高的趨勢(圖3)。短期老化處理(1～2 d)能顯著提高種子CAT活性(P<0.05)。其中，老化1～2 d的種子CAT活性持續(xù)增加，至第2天時已達(dá)183.693 U·g-1·min-1，較對照(老化0 d)提高33.26%(P<0.05)。老化3 天時種子CAT活性降至84.427 U·g-1·min-1，僅為對照的60.78%(P<0.05)，3 天后種子CAT活性又開始回升， 4 天時為139.972 U·g-1·min-1，與對照無顯著差異。

2.3 人工老化對種子貯藏物質(zhì)含量的影響

2.3.1人工老化對種子可溶性糖含量的影響 經(jīng)老化處理后，納羅克非洲狗尾草種子可溶性糖含量較對照均有增加(圖4，P<0.05)，且隨著老化時間的延長，呈現(xiàn)先升高(P<0.05)后基本穩(wěn)定的趨勢。其中，老化初期(0～2 d)可溶性糖的含量急速上升，至處理第2 天時達(dá)到16.26%，是對照的1.98 倍(P<0.05)。隨后種子的可溶性糖含量略有起伏但變化不大，處理2～4 d差異不顯著。

圖4 不同老化時間對納羅克非洲狗尾草種子可溶性糖含量的影響Fig.4 Effect of different artificial aging time on soluble sugar content of 'Narok' seeds

2.3.2人工老化對種子可溶性蛋白含量的影響 隨人工老化處理時間的延長，納羅克非洲狗尾草種子可溶性蛋白含量表現(xiàn)為先升高后降低再升高的趨勢(圖5)。老化1 d、3 d種子可溶性蛋白含量與對照無顯著差異，老化2 d、4 d種子可溶性蛋白含量明顯增加，較對照分別提高31.9%和31.3%(P<0.05)，但兩者之間無顯著差異。

圖5 不同老化時間對納羅克非洲狗尾草種子可溶性蛋白含量的影響Fig.5 Effect of different artificial aging time on soluble protein content of ‘Narok’ seeds

2.4 人工老化對種子抗逆性的影響

人工老化處理下納羅克非洲狗尾草種子丙二醛含量呈上升趨勢(圖6，P<0.05)，且老化處理時間越長，丙二醛含量越高。至老化4天后，丙二醛含量達(dá)到0.190 μmol·g-1·FW-1，是對照(老化0 d)的2.44倍(P<0.05)。

圖6 不同老化時間對納羅克非洲狗尾草種子丙二醛含量的影響Fig.6 Effect of different artificial aging time onmalondialdehyde content of ‘Narok’ seeds

2.5 種子粗提液對白菜種子萌發(fā)的影響

不同人工老化時間的種子蒸餾水粗提液對白菜種子萌發(fā)的影響如表1所示。由表1可知，經(jīng)老化處理的納羅克非洲狗尾草種子粗提液對白菜種子萌發(fā)均有抑制作用，且隨著老化時間的增加，抑制效果先減弱后增強(qiáng)。短期人工老化處理后(老化1～2 d)的種子粗提液對白菜發(fā)芽的抑制作用較處理前低(P<0.05)。其中，抑制作用最弱的是老化1 d種子的粗提液，此時白菜相對發(fā)芽率高達(dá)93.93%(P<0.01)。隨著種子老化程度的加深，種子粗提液對白菜發(fā)芽的抑制效果增強(qiáng)，處理第3 d和第4 d白菜相對發(fā)芽率僅為76.11%和70.85%，與對照差異極顯著(P<0.01)。

表1 種子蒸餾水粗提液對白菜種子萌發(fā)的影響Table 1 Effect of crude extract form ‘Narok’seeds distilled water on the germination percentage of cabbage seeds

注：同列不同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)

Note：Different lower case letters in the same column indicate significant difference at the 0.05 level, Different capital letters indicate significant difference at the 0.01 level

2.6 人工老化種子活力與生理生化指標(biāo)的相關(guān)性分析

從表2可以看出，老化處理后的種子發(fā)芽率與POD活性呈極顯著正相關(guān)關(guān)系(P<0.01)，與SOD活性呈顯著正相關(guān)關(guān)系(P<0.05)，與CAT活性、可溶性糖含量呈正相關(guān)關(guān)系；與萌發(fā)抑制物活性呈極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系(P<0.01)，與可溶性蛋白，丙二醛含量呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。種子活力指數(shù)與POD、CAT活性呈極顯著正相關(guān)關(guān)系(P<0.01)，與SOD呈正相關(guān)關(guān)系；與萌發(fā)抑制物活性呈極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系(P<0.01)，與可溶性糖，可溶性蛋白含量呈負(fù)相關(guān)

關(guān)系。剔除無顯著統(tǒng)計學(xué)意義的變量后，建立的種子活力指數(shù)線性回歸模型為：

Y=0.303X1- 0.685X2(R2=0.806，P<0.05，N=15)

式中：

Y——發(fā)芽率；

X1——CAT活性;

X2——萌芽抑制物活性;

R2——復(fù)相關(guān)系數(shù)平方；

N——樣本數(shù)。

表2 老化處理種子活力與生理生化指標(biāo)相關(guān)性分析Table 2 Correlation analysis between seed vigor and physiological and biochemical index of ‘Narok’ seeds

注: *表示相關(guān)性顯著(P<0.05)；**表示相關(guān)性極顯著(P<0.01)

Note：* indicate significant correlation at the 0.05 level,; ** indicate significant correlation at the 0.01 level

3 討論

短期人工加速老化可打破種子休眠，提高種子活力。在人工控制的高溫高濕環(huán)境下加速種子老化，是一種比較種子活力與抗逆性的常用方法。很多植物種子經(jīng)人工老化處理后出現(xiàn)發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)等種子活力指標(biāo)下降的情況[31-33]。本研究表明，納羅克非洲狗尾草種子在短期老化處理后(老化1～2 d)，發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)有所增加(P<0.05)，處理3 d時差異不顯著，處理4 天后活力較對照顯著降低(P<0.05)。出現(xiàn)這種不尋常的變化，可能是由于該草種子存在嚴(yán)重休眠，而高溫高濕處理可能會打破種子休眠。翁玲等[25]早在2013年對納羅克非洲狗尾草種子的人工老化條件進(jìn)行過探討，表明老化促進(jìn)了非洲狗尾草種子發(fā)芽，與本試驗(yàn)結(jié)果有一定的相似性。但由于其選用的種子質(zhì)量較差，原始狀況不一致，最終沒有篩選出非洲狗尾草種子老化的適宜溫度及時間。聶朝相等[34]對結(jié)縷草(ZoysiajaponicaSteud)種子進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，高溫處理一段時間后，均能不同程度地破除種子的休眠與硬實(shí)，提高種子發(fā)芽率。吳琳[35]對菠菜種子的研究證實(shí)，高溫處理能有效使其木栓化的厚壁組織變得疏松，增強(qiáng)內(nèi)果肉的透性，促進(jìn)種子萌發(fā)，提高種子發(fā)芽率。蔣龍等[36]對狗尾草種子進(jìn)行堆捂處理，種子的溫度和濕度都會提高，此時種子的質(zhì)量較好。本試驗(yàn)結(jié)果證明，適當(dāng)?shù)娜斯だ匣幚?高溫高濕法)能提高納羅克非洲狗尾草種子的活力，此發(fā)現(xiàn)將為破除此牧草的休眠提供新思路。

萌發(fā)抑制物是指可以推遲和抑制植物種子發(fā)芽的物質(zhì)，由它們所誘導(dǎo)的休眠在自然界相當(dāng)普遍，萌發(fā)抑制物存在于種子的各個部位[48]。前人研究表明，納羅克非洲狗尾草種子屬于綜合休眠，可能存在萌發(fā)抑制物[8-9]。本試驗(yàn)采用強(qiáng)極性的蒸餾水浸泡用研磨研碎的種子，能將大多數(shù)萌發(fā)抑制物質(zhì)從樣品中提取出來，通過提取物對萌發(fā)指示植物白菜種子發(fā)芽的抑制效果，來揭示種子中萌發(fā)抑制物質(zhì)的活性變化，結(jié)果表明，萌發(fā)抑制物活性呈先減小后增大的趨勢。表明適當(dāng)?shù)睦匣幚?1～2 d)會使萌發(fā)抑制物導(dǎo)致的休眠逐漸消失，與種子活力呈負(fù)相關(guān)。張秋菊等[49]研究表明，返魂草(SeneciocannabifoliusLess.)種子通過50℃溫水浸種能去除大部分內(nèi)源抑制物質(zhì)，與本研究結(jié)果一致。

人工老化處理過程中，納羅克非洲狗尾草種子可能存在休眠破除和老化劣變兩種生理變化。結(jié)合種子發(fā)芽試驗(yàn)，推測在種子人工老化處理過程中，可能存在著兩種生理變化：(1)休眠破除；(2)老化劣變。這兩種生理“作用力”在老化處理過程中可能單獨(dú)施加，也可能同時存在，前者使種子活力提升，后者使種子活力下降，種子表現(xiàn)出的活力提高或降低，可能是他們拮抗后的合力。這也許能解釋為何種子一方面表現(xiàn)出老化的特質(zhì)，即丙二醛不斷升高；同時一方面表現(xiàn)出種子活力上升的特質(zhì)即種子發(fā)芽率、活力指數(shù)升高，抗氧化酶系統(tǒng)活性提高上升，貯藏物質(zhì)不斷累積，萌發(fā)抑制物活性的降低。這種推測是否正確，還需進(jìn)行下一步研究驗(yàn)證。

4 結(jié)論

短期人工加速老化(1～2 d)有助于打破納羅克非洲狗尾草種子的休眠，提高種子活力，加速老化3 d后種子活力下降。人工老化處理能顯著提高納羅克非洲狗尾草種子保護(hù)酶活性；老化處理后，納羅克非洲狗尾草種子貯藏營養(yǎng)物質(zhì)(可溶性糖、可溶性蛋白質(zhì))和丙二醛含量顯著增加，萌發(fā)抑制物活性先減小后增大。