外源性信號素3A信號通路對轉化生長因子- β1誘導肺癌細胞侵襲、增殖的影響

羅燕，徐崇明，段麗群

(湖北省腫瘤醫(yī)院 胸部放療科，湖北 武漢 430079)

外源性信號素3A信號通路對轉化生長因子- β1誘導肺癌細胞侵襲、增殖的影響

羅燕，徐崇明，段麗群

(湖北省腫瘤醫(yī)院 胸部放療科，湖北 武漢 430079)

目的：探討外源性信號素3A(Sema 3A)信號通路對轉化生長因子- β1(TGF- β1)誘導的肺癌A549細胞侵襲、增殖的影響及可能作用機制。方法：將肺癌A549細胞分為3組，即空白對照組、TGF- β1誘導組(TGF- β1組)、Sema 3A預處理組(Sema 3A+TGF- β1組)。空白對照組細胞正常培養(yǎng)；TGF- β1組加入5 μg·L-1TGF- β1；Sema 3A+TGF- β1組首先加入10 μmol·L-1Sema 3A，預處理40～50 min后再加入5 μg·L-1TGF- β1。檢測細胞增殖、侵襲能力和E- cadherin、Akt、P- Akt蛋白表達。結果：Sema 3A+TGF- β1組細胞Sema 3A mRNA相對表達水平顯著高于空白對照組和TGF- β1組(均P<0.05)。培養(yǎng)36 h～72 h內，TGF- β1組細胞增殖率顯著高于Sema 3A+TGF- β1組和空白對照組(均P<0.05)，Sema 3A+TGF- β1組細胞增殖率顯著高于空白對照組(均P<0.05)。TGF- β1組穿透濾膜細胞數(shù)顯著高于Sema 3A+TGF- β1組和空白對照組(均P<0.05)，Sema 3A+TGF- β1組穿透濾膜細胞數(shù)顯著高于空白對照組(P<0.05)。TGF- β1組E- cadherin蛋白表達顯著低于Sema 3A+TGF- β1組和空白對照組(均P<0.05)，P- Akt蛋白顯著高于Sema 3A+TGF- β1組和空白對照組(均P<0.05)；Sema 3A+TGF- β1組E- cadherin蛋白表達顯著低于空白對照組(P<0.05)，P- Akt顯著高于空白對照組(P<0.05)。結論：Sema 3A能夠抑制TGF- β1誘導肺癌細胞侵襲、增殖的效應，其機制可能與抑制Akt磷酸化、上調E- cadherin表達有關。

肺癌；外源性信號素3A；信號通路；轉化生長因子- β1；Akt磷酸化

侵襲和轉移是影響肺癌復發(fā)和死亡的主要原因之一[1- 2]。探討影響肺癌侵襲轉移的信號路徑，能夠為肺癌基因治療的分子作用靶點提供依據(jù)。研究[3]證實,上皮-間充質轉化(epithelial- mesenchymal transition, EMT)與惡性腫瘤多種生物學行為密切相關，也是腫瘤細胞侵襲、轉移的始動因素。信號素3A(semaphorin 3A, Sema 3A)屬于信號素家族成員之一，能夠抑制PI3K和Akt磷酸化而抑制軸突的導向作用[4]。最近一項研究[5]顯示，Sema 3A能夠抑制非小細胞肺癌發(fā)生EMT，使肺癌細胞遷移能夠減弱，從而抑制肺癌的發(fā)生和發(fā)展。本研究首先用外源性Sema 3A對A549細胞進行預處理，再通過轉化生長因子- β1(transforming growth factor- β1, TGF- β1)誘導肺癌細胞株A549發(fā)生EMT，觀察Sema 3A對A549細胞侵襲、遷移的影響及可能的作用機制，旨在為肺癌的基因治療提供依據(jù)，現(xiàn)將研究成果總結如下。

1 材料與方法

1.1 材料

肺癌細胞株A549購自中國科學院細胞資源中心，二甲基亞砜(DMSO)、溴化乙錠、胎牛血清、MTT染料、DMEM培養(yǎng)基、RPMI- 1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司，胰蛋白酶、β- 肌動蛋白(β- actin)購自美國Sigma公司，RIPA裂解液、BCA蛋白定量檢測試劑盒、SDS- PAGE凝膠配制試劑盒、SDS- PAGE轉膜液、電泳液購自蘇州碧云天公司，TGF- β1購自上海吉凱基因化學技術有限公司，小鼠來源Sema 3A多克隆抗體、β- actin抗體、辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠二抗購均購自北京天根生化科技有限公司，Prime Script?反轉錄試劑盒、PrimeScript?RT Enzyme MixⅠ、RT Primer Mix、SYBR?Premix EX Taq TMⅡ購自寶生物工程(大連)有限公司，E- 鈣黏蛋白(E- cadherin)多克隆抗體購自美國Invitrogen公司，Phospho- Akt(P- Akt)、Akt抗體購自美國Cell Signaling Technology公司，Transwell小室購自美國Costar公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 將A549細胞接種于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，37 ℃、體積分數(shù)5%CO2條件下培養(yǎng)。取生長旺盛期細胞，胰蛋白酶消化，待細胞間隙增大、細胞收縮變圓時將消化液棄去，加入培養(yǎng)基終止消化。培養(yǎng)基將細胞重懸，并接種于培養(yǎng)瓶中體積分數(shù)5%CO2條件下繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.2 細胞分組及處理 將細胞分為空白對照組、TGF- β1誘導組(TGF- β1組)和Sema 3A預處理組(Sema 3A+TGF- β1組)。取各組對數(shù)生長期細胞，空白對照組在含0.5%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)；TGF- β1組在DMEM培養(yǎng)基(含0.5%胎牛血清)中加入5 μg·L-1TGF- β1；Sema 3A+TGF- β1組首先向DMEM培養(yǎng)基中加入10 μmol·L-1Sema 3A，預處理40～50 min后再加入5 μg·L-1TGF- β1。各組細胞均在培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h后進行實驗。

1.2.3 MTT法檢測細胞增殖能力 取對數(shù)生長期細胞，以每孔1.0×107個細胞接種于96孔板中，分別于0、12、24、36、48、60、72 h向每孔加入10 μl MTT(質量濃度為5 g·L-1)溶液，培養(yǎng)4 h后將培養(yǎng)基棄去，再向每孔中加入150 μl DMSO，充分振蕩，置于酶標儀上，通過測量各時段450 nm處吸光度值評價細胞增殖能力。

1.2.4 Transwell法檢測細胞侵襲能力 取對數(shù)生長期細胞，用不含血清的培養(yǎng)基將濃度調整為每孔1.0×109個細胞，Transwell上室每孔植入150 μl細胞，下室加入600 μl含有20%胎牛血清的RPMI- 1640培養(yǎng)基，每組分別設置6個復孔，細胞培養(yǎng)48 h，待培養(yǎng)結束后將Transwell小室濾膜用4%多聚甲醛固定，輕輕拭去表面細胞，結晶紫染色10 min，PBS沖洗3次，顯微鏡下觀察穿透濾膜的細胞數(shù)。

1.2.5 RT- PCR檢測Sema 3A mRNA表達 取對數(shù)生長期細胞，參考RNA提取試劑盒說明書提取總RNA，取5 μg總RNA，按照Prime Script?反轉錄試劑盒說明書進行逆轉錄，逆轉錄產物置于冰箱4 ℃保存。采用RT- PCR檢測細胞Sema 3A mRNA表達，操作參考SYBR?Premix EX Taq TMⅡ試劑盒說明書，引物委托上海生工生物工程有限公司合成，Sema 3A引物序列上游為5′- GAGAAGCAGCATGAGGTGTATTGGA- 3′，下游為5′- GGATGTAGTTGAGGCACTCTGTCTG- 3′；β- actin引物序列上游為5′- CCAGCAAGAGCACAAGAGGAAGAG- 3′，下游為5′- GGTCTACATGGCAACTGTGAGGAG- 3′。以β- actin作為內參照，檢測Sema 3A mRNA相對表達量。

1.2.6 蛋白質印跡法(Western blotting)檢測E- cadherin、Akt、P- Akt蛋白表達 向細胞中加入100 μl細胞裂解液充分裂解，4 ℃離心20 min(15 000 r·min-1)，吸取上清液，煮沸使蛋白變性。SDS- PAGE電泳分離蛋白，并轉移至PVDF膜上，電轉后脫脂牛奶封閉2 h，分別加入E- cadherin抗體、AKT抗體、p- AKT抗體、β- actin抗體，4 ℃孵育過夜。PBS沖洗3次，再按照1∶1 000加入二抗，室溫下振蕩孵育2 h，PBS沖洗3次。ECL顯色，凝膠成像分析儀采集圖像，測定目的條帶灰度值，目的蛋白相對表對量為樣本條帶與β- actin條帶灰度值比值。

1.3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件包進行數(shù)據(jù)處理，計量資料用均數(shù)±標準差表示，多組間比較采用單因素方差(One- way ANOVA)分析，之后兩兩比較采用SNK-q檢驗，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 細胞形態(tài)變化

空白對照組細胞呈橢圓形，細胞間排列緊密；經TGF- β1誘導后，TGF- β1組細胞變成梭形，細胞間連接不明顯，呈離散狀態(tài)；給予Sema 3A處理后，Sema 3A+TGF- β1組細胞恢復橢圓形，細胞間存在連接。見圖1。

圖1 3組細胞形態(tài)變化(×200)

2.2 Sema 3A mRNA表達

RT- PCR檢測結果顯示，Sema 3A+TGF- β1組細胞Sema 3A mRNA相對表達水平顯著高于空白對照組和TGF- β1組(均P<0.05)，空白對照組Sema 3A mRNA相對表達水平又顯著高于TGF- β1組(P<0.05)，見圖2。

與TGF- β1組比較，aP<0.05; 與空白對照組比較，bP<0.05

圖2 3組細胞Sema 3A mRNA表達

2.3 細胞增殖和侵襲能力

MTT實驗結果(圖3A)顯示，培養(yǎng)36～72 h TGF- β1組細胞增殖率顯著高于Sema 3A+TGF- β1組和空白對照組(均P<0.05)，Sema 3A+TGF- β1組細胞增殖率顯著高于空白對照組(P<0.05)。Transwell實驗結果(圖3B)顯示，TGF- β1組穿透濾膜細胞數(shù)顯著高于Sema 3A+TGF- β1組和空白對照組(均P<0.05)，Sema 3A+TGF- β1組穿透濾膜細胞數(shù)顯著高于空白對照組(P<0.05)。

2.4 E- cadherin、Akt、P- Akt蛋白表達

A.細胞增殖能力檢測結果; B.細胞侵襲能力檢測結果。與TGF- β1組比較，aP<0.05；與空白對照組比較，bP<0.05

圖3 細胞增殖和侵襲能力

Western blotting實驗結果顯示，TGF- β1組E- cadherin蛋白表達顯著低于Sema 3A+TGF- β1組和空白對照組(均P<0.05)，P- Akt蛋白顯著高于Sema 3A+TGF- β1組和空白對照組(均P<0.05)；Sema 3A+TGF- β1組E- cadherin蛋白表達顯著低于空白對照組(P<0.05)，P- Akt顯著高于空白對照組(P<0.05)；TGF- β1組、Sema 3A+TGF- β1組、空白對照組Akt蛋白表達比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖4。

與TGF- β1組比較，aP<0.05；與空白對照組比較，bP<0.05

圖4 3組細胞E- cadherin、Akt、P- Akt蛋白表達水平

3 討 論

EMT是以細胞連接蛋白下調為基礎的生物學過程，并參與了腫瘤細胞的侵襲和轉移。Sema 3A屬于軸突生長抑制因子，具有誘導神經毒性的作用，參與神經細胞凋亡。近年來研究[6]顯示，Sema 3A能夠抑制腫瘤細胞發(fā)生EMT，阻止腫瘤細胞的增殖和遷移功能。在EMT過程中，緊密連接蛋白表達下調，蛋白激酶裂解基底膜，導致肌動蛋白骨架發(fā)生重組，細胞間黏附能力降低。另外EMT還會促進應力纖維的形成，增強細胞遠處侵襲轉移的能力[7]。EMT能夠被分化因子和生長因子激活，其中TGF- β1被認為是EMT的始動因素。本研究對肺癌A549細胞株給予TGF- β1誘導，結果顯示TGF- β1組細胞呈梭形，細胞間連接不明顯，呈離散狀態(tài)。提示TGF- β1能夠誘導A549細胞發(fā)生EMT，通過改變細胞的形態(tài)和細胞間連接，使A549細胞遷移能力增強。鄧陶然等[8]報道,TGF- β1能夠減弱細胞間的黏附作用，導致細胞處于離散狀態(tài)，使非小細胞肺癌獲得侵襲和遷移能力。Huang等[9]也證實,TGF- β1是非小細胞化療耐藥、預后不佳的獨立危險因素。

動物實驗[10]證實，Sema 3A對多巴胺神經元等細胞具有神經毒性，在神經細胞發(fā)生損傷時誘導細胞凋亡。Sema 3A通過與神經纖毛蛋白1結合，拮抗血管內皮生長因子的活性，導致腫瘤新生血管受阻，從而降低腫瘤微血管密度，抑制腫瘤細胞的生長和發(fā)展。本研究結果顯示，在TGF- β1誘導A549細胞前用Sema 3A預處理，細胞離散狀態(tài)受到抑制，細胞重新恢復緊密的連接，提示Sema 3A能夠抑制由TGF- β1誘導的EMT過程。MTT實驗和Transwell實驗結果顯示，Sema 3A預處理能夠明顯抑制A549細胞的增殖和侵襲能力。Kaczmarek等[11]報道,Sema 3A能夠阻斷肌動蛋白的重組，抑制張力絲的形成，使細胞間的黏附能力增加，抑制細胞的遷移和侵襲能力。Sema 3A能夠介導免疫應答反應，通過激活T淋巴細胞分泌多種細胞因子，發(fā)揮細胞毒作用抑制腫瘤細胞的生長[12]。另外,Sema 3A還能誘導巨噬細胞蛋白骨架延伸，并與血管內皮生長因子競爭性結合單核細胞，促進腫瘤生長相關巨噬細胞由誘導腫瘤生長轉化為抗腫瘤作用[13]。

PI3K/Akt信號通路是與腫瘤進展、侵襲密切相關的信號通路，PI3K被激活并產生磷脂產物，進一步激活Akt并介導下游級聯(lián)反應，因此PI3K/Akt也是聯(lián)系細胞外信號和細胞內應答的重要橋梁信號路徑[14]。Sema 3A能夠通過第10號染色體同源丟失性磷酸酯酶-張力蛋白參與調節(jié)PI3K/Akt信號通路。Vadasz等[15]報道,Sema 3A與Plexin A特異性結合，抑制Ras，鈍化PI3K/Akt信號通路。PI3K/Akt信號通路被激活后，活化的Akt第Ser- 136位點發(fā)生磷酸化，并釋放Bcl- 2蛋白，發(fā)揮細胞凋亡作用。Akt磷酸化能夠下調E- cadherin蛋白表達，使腫瘤細胞黏附力降低，增強腫瘤細胞的遷移能力[16- 17]。本研究結果顯示,Sema 3A預處理后能夠抑制P- Akt蛋白表達,增加E- cadherin蛋白表達，說明Sema 3A可能通過鈍化PI3K/Akt信號通路，抑制Akt磷酸化，并上調E- cadherin表達，增強A549細胞侵襲、增殖抑制能力。

綜上所述，Sema 3A能夠抑制TGF- β1誘導的侵襲、增殖作用，其機制可能與抑制Akt磷酸化、上調E- cadherin表達有關。

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Effect of semaphorin 3A signaling pathway on invasion and proliferation of lung cancer cells induced by transforming growth factor- β1

LUO Yan,XU Chong- ming,DUAN Li- qun

(DepartmentofChestRadiotherapy,HubeiProvinceTumorHospital,Wuhan430079,China)

Objective: To explore the effect of semaphorin 3A (Sema 3A) signaling pathway on invasion and proliferation of lung cancer cells induced by transforming growth factor - β1 (TGF- β1) and its mechanisms. Methods: The lung cancer A549 cells were divided into three groups: blank control group (control), TGF- β1 induced group (TGF- β1), 3A Sema pretreatment group (Sema 3A+TGF- β1). The control group was cultured with normal cultured, 5 μg·L-1TGF- β1 was added in TGF- β1 group, 10 μmol·L-1of Sema 3A was firstly added and pretreated for 40- 50 min and then 5 μg·L-1of TGF- β1 added in the Sema 3A+TGF- β1 group. Cell proliferation, invasion ability and the expression level of E- cadherin, Akt, P- Akt protein was measured. Results: After Sema 3A pretreatment, the Sema 3A+TGF- β1 group cells were round or oval. Sema 3A mRNA relative expression level in Sema 3A+TGF- β1 group were significantly higher than that in the control group and the TGF- β1 group(P<0.05). In 36- 72 h, the proliferation rate of TGF- β1 group was significantly higher than in Sema 3A+TGF- β1 group and the control group(P<0.05), the proliferation rate in Sema 3A+TGF- β1 group was significantly higher than that in the control group(P<0.05). The migrated cells number was significantly higher than that in Sema 3A+TGF- β1 group and the control group(P<0.05),migrated cell number in Sema 3A+TGF- β1 group was significantly higher than that in the control group(P<0.05). The expression of E- cadherin protein was significantly lower than that in Sema 3A+TGF- β1 group and the control group, P- Akt protein was significantly higher than that in Sema 3A+TGF- β1 group and the control group(P<0.05). E- cadherin protein in Sema 3A+TGF- β1 group was significantly lower than that in the control group, P- Akt protein was significantly higher than that in the control group(P<0.05). Conclusion: Sema 3A can inhibit invasion and proliferation induced by TGF- β1, the mechanism may be related to the inhibition of Akt phosphorylation and up regulation of E- cadherin expression.

lung cancer; semaphorin 3A; signal pathway; transforming growth factor- β1; Akt phosphorylation

2016- 12- 13

2017- 05- 04

羅燕(1979-)，女，湖北武漢人，住院醫(yī)師，醫(yī)學博士。E- mail:luoyan197904@163.com

羅燕,徐崇明,段麗群.外源性信號素3A信號通路對轉化生長因子- β1誘導肺癌細胞侵襲、增殖的影響[J].東南大學學報：醫(yī)學版，2017，36(4)：609- 614.

R734.2

A

1671- 6264(2017)04- 0609- 06

10.3969/j.issn.1671- 6264.2017.04.023