無菌果蠅模型的改進與酵母促進果蠅發(fā)育

胡坤坤，李玉娟，劉威,3，金珊

(1.湖北大學生命科學學院，湖北 武漢 430062；2.山西醫(yī)科大學汾陽學院科技中心，山西 汾陽 032200；3.山西醫(yī)科大學汾陽學院醫(yī)學檢驗系，山西 汾陽 032200)

無菌果蠅模型的改進與酵母促進果蠅發(fā)育

胡坤坤1,2，李玉娟2，劉威2,3，金珊1

(1.湖北大學生命科學學院，湖北 武漢 430062；2.山西醫(yī)科大學汾陽學院科技中心，山西 汾陽 032200；3.山西醫(yī)科大學汾陽學院醫(yī)學檢驗系，山西 汾陽 032200)

人等所有后生動物體內微生物數(shù)量多、種類復雜，給人們的研究帶來了很多的困難,建立無菌和悉菌的動物模型則是當前急迫之需，無菌果蠅模型日益受到重視.本實驗優(yōu)化無菌果蠅模型，發(fā)現(xiàn)威露士可以協(xié)助次氯酸和乙醇消毒，對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和白色念珠菌殺滅效率為99.999%,提高表面消毒能力，卵存活率從50%左右提高到67.3%.從而高效率地建立果蠅悉菌模型.在此基礎上研究酵母對該模型的影響，結果發(fā)現(xiàn)酵母能顯著地促進無菌果蠅的生長與發(fā)育.在營養(yǎng)條件匱乏(0.5%酵母)情況下，常規(guī)飼養(yǎng)果蠅蛹和成蟲羽化時間分別為6.0 d和11.7 d；無菌果蠅蛹和成蟲羽化時間分別為7.8 d和18.9 d，說明共生微生物可以促進果蠅的發(fā)育.本研究優(yōu)化了無菌果蠅操作過程，為實驗室建立悉生果蠅模型提供了便利，有利于研究宿主與微生物之間相互作用.

果蠅；無菌模型；悉生；發(fā)育；酵母

由于人體腸道結構復雜，同時腸道微生物種類廣、數(shù)量多以及功能復雜，如果直接用人進行研究有很多的困難，有的研究可能涉及到某種倫理問題.因此，選擇一種好的模式生物來研究腸道共生菌對宿主的影響很有必要.目前，大部分研究采用小鼠建立無菌模型.但是該模型具有操作復雜、代價高昂與容易污染等缺點.首先，需要在懷孕小鼠臨近產(chǎn)期運用剖腹產(chǎn)小鼠獲得無菌的小鼠，避免產(chǎn)道微生物的定植；其次，小鼠需要嚴格地在無菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)， 要求提供無菌的食物和空氣，確保小鼠清潔；最后，因為小鼠飼養(yǎng)周期和后代數(shù)量的限制以及小鼠無菌培養(yǎng)設備的昂貴，在一定程度上限制了對這方面的研究.最近，我們及其他實驗室利用黑腹果蠅(Drosophilamelanogaster)建立無/悉菌模型[5]，有可能是研究腸道細菌的一個優(yōu)秀宿主模型.

1969年，Bakula等首次建立和驗證了無菌果蠅模型[6].他們分別用HgCl2溶液、70%和95%乙醇溶液等聯(lián)合消毒法，除去卵表面所有的微生物，最終獲得了無菌果蠅.HgCl2溶液對環(huán)境不利，并且對果蠅神經(jīng)系統(tǒng)有毒害作用，后來被次氯酸溶液所代替[7].然而，我們實驗室在驗證該方法時發(fā)現(xiàn)其效率仍然不是很高，在保證卵存活條件之下除菌效果不理想.本實驗室在已有的基礎上增加一種消毒液—威露士(Walch)與次氯酸和乙醇聯(lián)合消毒，建立一種操作簡便、效率高的無菌果蠅的方法.使用這種方法獲取的無菌果蠅卵更加安全，而且消毒除菌后卵成活率非常高.

1 材料與方法

1.1 實驗材料 實驗中所用果蠅品系為野生型黑腹果蠅OregonR(OR).果蠅體內混合菌來自常規(guī)飼養(yǎng)果蠅的腸道.

1.2 試劑與儀器 消毒劑威露士Walch(廣州威萊)；高活性干酵母(安琪酵母股份有限公司)；次氯酸鈉(Sigma)；紫外-可見分光光度儀(島津，UV-1800)；37 ℃恒溫培養(yǎng)箱(新苗，GNP9080BS-Ⅲ)；25 ℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱(恒豐，WS-01Y).

1.3 果蠅的培養(yǎng)和培養(yǎng)基成分 果蠅在25 ℃，濕度50%條件下培養(yǎng).果蠅培養(yǎng)基為酵母-玉米瓊脂培養(yǎng)基，成分如下(1 000 mL)：dd H2O 1 000 mL，瓊脂13 g，CaCl20.83 g，蔗糖31.6 g，葡萄糖63.2 g，玉米粉77.7 g，酵母粉24 g.果蠅收卵所用葡萄汁-酵母培養(yǎng)基成分(1 000 mL)：dd H2O 750 mL，葡萄汁250 ml，瓊脂30 g，蔗糖12 g.收卵時在培養(yǎng)基表面涂抹適量的酵母膏.

1.5 卵孵化率 將消毒后卵轉移到高壓滅菌后的果蠅食物上，用透氣不透菌的塞子密封玻璃管，放置到清潔培養(yǎng)箱內培養(yǎng)，第二天計數(shù)卵孵化率.

1.6 果蠅發(fā)育時間的測定 將CR (Conventionally Reared)、GF (Germ-Free)和GF + 混合菌3組卵，按照無菌和悉菌模型建立方法，分別接種到酵母濃度不同培養(yǎng)基(0.25%、0.5%、1.0%、2.5%、5.0%)中，記錄每天成蛹和羽化果蠅的數(shù)量，計算果蠅在不同酵母濃度下成蛹和羽化的天數(shù).

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計和分析 試驗中所有結果均重復3次及以上，對收卵后卵表面的細菌數(shù)量、卵成活率、果蠅蛹和成蟲發(fā)育平均時長進行統(tǒng)計，并將每組數(shù)據(jù)平均后采用t檢驗(studentt-test)，檢驗其差異度.

2 結果

2.1 消毒液的除菌效果的比較 本研究參考已有建立無菌果蠅的方法，結果發(fā)現(xiàn)該方法在我們實驗室不夠理想.無菌果蠅模型建立需要滿足兩個要求：其一，要有效地去除果蠅卵體表所有的微生物；其二，胚胎要保持較高的存活率.因此我們分別研究了次氯酸和乙醇消毒效果.結果顯示，75%乙醇消毒能力弱，對胚胎損傷小,處理15 min，卵存活率為17.3%(圖1A)，而次氯酸消毒能力強，但毒性強，對果蠅胚胎損傷較大，處理5 min卵存活率為0%(圖1B).因此，該方法在本實驗室得到活的無菌果蠅胚胎幾率比較低.為了解決上述問題，嘗試利用威露士溶液協(xié)助消毒卵.威露士溶液殺菌主要成分為對氯間二甲基苯酚，可引起革蘭氏陽性、陰性菌以及霉菌表面蛋白質變性，以殺滅這些微生物.結果顯示，使用僅有威露士的溶液處理果蠅胚胎3次，每次1 min，除菌效果一般.但對果蠅胚胎損傷最小，處理15 min，卵存活率高達為38.1% (圖1C).上述結果表明，單獨使用任何一種消毒液均不能有效地除菌.

圖1 3種不同消毒劑的消毒效果(卵表面菌數(shù)和卵存活率)的比較 A 75%乙醇; B 次氯酸；C 威露士(1∶30，威露士/水)；D 對氯間二甲基苯酚分子結

2.2 果蠅胚胎無菌操作的優(yōu)化 如圖1所示，雖然HClO溶液消毒效果最好，但其毒性最大，容易引起胚胎死亡.本研究進一步摸索不同濃度的HClO溶液與75%乙醇、威露士聯(lián)合消毒除菌的效果，結果表明，HClO溶液的濃度為原試劑濃度的40%以上時，經(jīng)過1 min消毒處理后就能保證卵表面無菌(圖2)，果蠅胚胎的存活率為67.3%，遠高于3種消毒液單獨除菌后卵的存活率，說明改進的消毒方法對胚胎毒性比較小(圖2).因此，本研究增加了使用威露士聯(lián)合消毒方法，并且找到HClO最適濃度，從而建立了一套高效的無菌果蠅胚胎的技術和方法.

圖2 不同濃度次氯酸與威露士、乙醇共處理后卵表面菌數(shù)和卵存活

2.3 酵母促進果蠅發(fā)育 在自然界中，果蠅喜食腐爛的水果.這些水果含有大量的酵母菌，同時酵母也是實驗室飼養(yǎng)果蠅的主要食物之一.因此，在構建無菌果蠅基礎上進一步研究滅菌后酵母濃度對無菌果蠅發(fā)育與生長的影響.本研究運用上面無菌果蠅技術，分別建立無菌果蠅、常規(guī)飼養(yǎng)果蠅和無菌果蠅卵補加果蠅混合菌，探究不同濃度的酵母食物對它們發(fā)育的影響.如圖3所示，在營養(yǎng)條件充足(酵母濃度高于2.5%)的情況下，GF、CR和GF+CR菌3種果蠅發(fā)育幾乎沒什么差異.例如：酵母的濃度為5%時，CR果蠅蛹發(fā)育平均時長為(4.5±0.2)d，成蟲為(8.8±0.3)d，GF果蠅蛹發(fā)育平均時長為(5.1±0.2)d，成蟲為(9.0±0.2)d(P>0.05)，無明顯差異.但是在營養(yǎng)條件匱乏(酵母濃度小于1%)的情況下，CR果蠅發(fā)育周期比無菌果蠅短.例如：在酵母的濃度為0.5%時，CR果蠅蛹發(fā)育平均時長為(6.5±0.3)d，成蟲為(11.8±0.1)d，而GF果蠅蛹發(fā)育平均時長為(18.5±0.8)d(P<0.001)，成蟲為(19.5±1.3)d(P<0.001).結果說明酵母能夠促進果蠅蛹和成蟲出現(xiàn)，并且在這6種不同濃度酵母飼養(yǎng)的條件下，GF+CR菌的果蠅蛹和成蟲的發(fā)育與CR果蠅之間沒有明顯差異(P>0.05)，混合菌可以挽救GF果蠅發(fā)育遲緩，排除了試劑毒導致果蠅發(fā)育遲緩的可能性.

圖3 不同酵母濃度對CR、GF、GF+CR蛹和成蟲發(fā)育周期的影響a: CR、GF、GF+CR菌在不同濃度酵母下蛹發(fā)育周期；B: CR、GF、GF+CR菌在不同濃度酵母下成蟲發(fā)育周

3 討論

最近，對宿主和共生微生物菌群之間的研究已經(jīng)取得了突破[8-9].但是由于腸道微生物數(shù)量多、種類復雜以及作用廣泛等原因，該領域仍然有很多關鍵性的問題尚未解決[10].20世紀后葉，隨著宿主動物與其腸道微生物全基因組測序技術的發(fā)展，元基因組和薈萃分析等技術的興起，使得在分子水平上研究腸道微生物對宿主的影響成為可能.因為人和一些高等哺乳動物結構和功能上的復雜性，研究腸道微生物對宿主的影響上有諸多不便，因而選擇合適的模式生物來研究腸道微生物對宿主的影響已成為趨勢.

因為黑腹果蠅生活史短、個體小、易飼養(yǎng)、繁殖快、染色體少、突變型多以及表型明顯等特點，已成為研究人員普遍選擇的模式生物之一.果蠅腸道內定植的微生物相對簡單，容易建立無/悉生果蠅，能為研究提供一個特別的模型[7].首先，果蠅受精卵表面包被著絨毛膜和卵黃膜的外殼，這層結構能夠阻止外界微生物進入內部胚胎，即使通過產(chǎn)道時胚胎仍然為無菌狀態(tài)，并且一直保持到幼蟲孵化(25 ℃，產(chǎn)卵后12 h以內).但是自然分娩的哺乳動物經(jīng)過產(chǎn)道出生，難免會有微生物的存在.其次，果蠅體外產(chǎn)卵，有利于建立無菌模型.收集果蠅12 h之內產(chǎn)下的卵，通過體表消毒法去除表面的微生物，然后接種在高壓滅菌的食物中，即可建立無菌模型.再者，果蠅腸道結構與人有很大的相似性[11].人腸道由小腸、大腸和直腸三大段組成，果蠅腸道同樣分為前腸、中腸和后腸；并且在腸道結構上也很相似，均包括腸粘膜、腸絨毛、分泌細胞和肌肉層等.最后，果蠅腸道微生物與人腸道微生物有很高的保守型和通用性.在人體腸道中主要優(yōu)勢菌群為厚壁菌門和擬桿菌門[2].研究已經(jīng)確定厚壁菌門也是果蠅腸道菌落代表，主要包括乳桿菌科和腸球菌科[12].因此，相比較大型哺乳動物，無/悉生果蠅具有重要的科研價值，可作為一個很好的工具用于探索微生物和宿主之間的關系，更深入地了解腸道微生物的功能.本研究改進了GF果蠅操作步驟，提高了建立無/悉生果蠅的概率，從而解決了無菌動物來源問題，有助于本領域科研發(fā)展.

因為環(huán)境的不同，果蠅卵表面的細菌種類和數(shù)量也會不同.之前的文獻報道，他們是只采用乙醇和次氯酸消毒，我們實驗室在驗證建立果蠅無菌體系的時候發(fā)現(xiàn)，該方法有時候能夠得到無菌卵，但是對于有些果蠅培養(yǎng)環(huán)境中含有較多易形成孢子的革蘭氏陽性菌時，該方法有時候不能夠消毒徹底，得不到無菌卵，所以我們加上了一種消毒試劑——威露士.威露士的主要成分為對氯間二甲苯酚，對氯間二甲苯酚化學性質穩(wěn)定，在室溫下性質穩(wěn)定.是一種廣譜的防霉抗菌劑，對多數(shù)革蘭氏陽性、陰性菌，真菌，霉菌都有殺滅功效.我們在此基礎上，改變了次氯酸和乙醇濃度和處理時間，能夠更有效地獲得無菌卵的同時也保證了卵較高的成活率.

對氯間二甲苯酚即4-氯-3,5-二甲基苯酚是酚類化合物的一種衍生物，通過使蛋白質變性達到殺菌效果.對多數(shù)革蘭氏陽性、陰性菌，真菌，霉菌都有殺滅功效，但它對細菌的抑制力要強于霉菌[13].1)苯環(huán)上的鹵原子是比較穩(wěn)定的，一般不會發(fā)生取代或消去反應(除非間位上有硝基).2)苯環(huán)上的甲基可以用高錳酸鉀氧化成—COOH,然后高溫與NH3反應生成酰胺，通過霍夫曼酰胺降解得到苯胺，苯胺氧化就可以得到硝基苯.3)酚羥基很不穩(wěn)定，一般需要保護，或是最后生成羥基.

果蠅腸道內定植的微生物相對簡單和容易建立無菌和悉生果蠅，它為我們提供了一個特別的模型.本研究改進了GF果蠅操作步驟，這個模型相對比較簡單，容易操作，并且果蠅也很適合用來研究關于腸道微生物相關的一些信號通路和分子機制，從而能夠使腸道微生物比較有挑戰(zhàn)性的一個難題得以簡化.我們用不同濃度酵母食物來統(tǒng)計GF、CR和GF+CR菌蛹和成蟲發(fā)育的天數(shù)，腸道微生物可以促進宿主的發(fā)育，這也提示我們，腸道微生物可能通過調控宿主某些基因直接或者間接地參與調控宿主身體的發(fā)育.而果蠅，染色體結構相對簡單，全基因組測序已經(jīng)完成[14]，并且通過這么多年的人工突變和篩選，現(xiàn)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)很多便于表型標記的遺傳操作和分子標記等等.更重要的是，如增強子陷阱技術、定點同源重組技術、雙組分異位基因表達系統(tǒng)、嵌合體分析技術及基因定點敲除技術等都可以在果蠅上使用[15]，甚至有些技術只能夠在果蠅上使用.果蠅作為一種研究信號通路的工具所具有的優(yōu)勢不言而喻.

之前，人們對腸道微生物功能的認知和研究主要集中在以下3個方面——營養(yǎng)作用、免疫調節(jié)及其抗感染功效[16].腸道微生物幫助人體消化食物、提供某些人體必需的營養(yǎng)，并參與和調控免疫反應[17-18].隨著認知的深入，腸道菌群的特征與演變、腸道菌群與宿主的生理和疾病關系、糞菌移植、腸道微生物與宿主間信號識別與傳遞等領域也取得了一定的進展[19]，但離我們完全解開腸道微生物的作用還相距甚遠.近年來，隨著對人體共生微生物研究的深入，特別是在人基因組和宏基因組計劃的完成及精準醫(yī)療(Precision Medicine)等概念提出的情況下，人們發(fā)現(xiàn)微生物可能對一些器官的活動(如大腦)及心理活動和情緒(抑郁癥等方面)的調控有著重要的影響[20-22]，并且腸道微生物與某些疾病(如肥胖癥、自生免疫疾病等)直接相關[23-24].所以，果蠅-細菌模型在研究這些問題上可以作為一個優(yōu)秀的工具，來探索微生物和宿主之間關系，更深入地解析腸道微生物的功能,特別是利用無菌果蠅來揭示大腦與腸道功能等相關方面的研究.

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(責任編輯 游俊)

The modification of germ-freeDrosophilamodel and the effectsof yeast on the development of hosts

HU Kunkun1,2, LI Yujuan2, LIU Wei2,3, JIN Shan1

(1.College of Life Sciences, Hubei University, Wuhan 430062, China;2.Science and Technology Center, Fenyang College of Shanxi Medical University, Fenyang 032200, China;3.Department of Medical Laboratory Science, Fenyang College of Shanxi Medical University, Fenyang 032200, China)

All metazoan including human inhabit a large number of microorganisms. The complexity and diversity of bacterial community restricts us to explore the underlying mechanism of the relationship of microbes and hosts. Therefore, it is necessary to use germ-free and/or gnotobiotic animal model in research, and fruit flyDrosophilaacted as this excellent model, due to its amenability to genetic study, lower microbiota complexity, and the easiness in manipulating germ free flies. At first, we optimized the protocol of germ-freeDrosophilamodel, and found that Walch solution cooperated with chloride and ethanol solution to remove the microbes on the surface of eggs, the eradication efficiency toEscherichiacoli,StaphylococcusaureusandCandidaalbicanswas 99.999%, and efficiently generated germ-freeDrosophilamodel, eggs survival rate increased from about 50% to 67.3%. Based on this model, we investigated the potential roles of yeast on hosts, and found that yeasts were required to promote the development of fruit flies in a dose-dependent manner. In the condition of poor nutrition (0.5% yeast) cases, conventional breeding ofDrosophilapupae and eclosion time were 6.9 d and 11.7 d. sterileDrosophilapupae and eclosion time were delayed to 7.8 d and 18.9 d. Indicated symbiotic microbes were required to promote the development ofDrosophila. In conclusion, the optimized protocol of germ-freeDrosophilamodel contributed to our knowledge of interaction of microbes and hosts.

Drosophilamelanogaster; germ-free model; gnotobiotic; development; yeast

2016-12-22

國家自然科學基金(31501175)、山西醫(yī)科大學汾陽學院人才引進科研啟動基金(1423)資助

胡坤坤(1991-)，男，碩士生，E-mail：1197787891@qq.com；金珊，通信作者，E-mail：jinshan20032003@126.com

1000-2375(2017)05-0468-06

Q344+.3

A

10.3969/j.issn.1000-2375.2017.05.006