銀鯽卵母細(xì)胞體外誘導(dǎo)成熟技術(shù)的建立

李 志 汪 洋 周 莉 李熙銀 張曉娟 周 劍 桂建芳

(中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所淡水生態(tài)與生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 武漢 430072)

銀鯽卵母細(xì)胞體外誘導(dǎo)成熟技術(shù)的建立

李 志 汪 洋 周 莉 李熙銀 張曉娟 周 劍 桂建芳

(中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所淡水生態(tài)與生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 武漢 430072)

研究以銀鯽為材料, 根據(jù)銀鯽(Carassius auratus gibelio)卵母細(xì)胞生發(fā)泡(Germinal vesicle, GV)邊移程度及剝離GV中減數(shù)分裂前期染色體的凝集狀態(tài), 將銀鯽Ⅳ時(shí)相的卵母細(xì)胞分為GV0、GV1、GV2和GV3四個(gè)時(shí)期; 并進(jìn)一步比較了分別處于這4個(gè)時(shí)期銀鯽卵母細(xì)胞體外誘導(dǎo)培養(yǎng)的成熟率、卵裂率和孵化率。結(jié)果表明, GV1期之后的卵母細(xì)胞均可有效進(jìn)行體外誘導(dǎo)成熟, 可正常受精發(fā)育, 由于GV1期卵母細(xì)胞有較長(zhǎng)時(shí)間用于顯微操作, 因此GV1期卵母細(xì)胞被選為進(jìn)行體外誘導(dǎo)的最早時(shí)期的卵母細(xì)胞。以GV1期卵母細(xì)胞為研究材料, 摸索了銀鯽卵母細(xì)胞體外誘導(dǎo)成熟的適宜條件: 取GV1期的Ⅳ時(shí)相卵母細(xì)胞, 放置于pH 8.5、加有1 μg/mL孕酮激素(17α, 20β-dihydroxy-4-pregnen-3-one, DHP)的格氏平衡鹽溶液(Gey’s balanced salt solution, GBSS)中, 在23℃培養(yǎng)箱中體外誘導(dǎo)12h后, 將濾泡膜剝離后再進(jìn)行人工體外授精, 其所獲胚胎的孵化率可達(dá)55.5%。此外, 將體外轉(zhuǎn)錄合成的帶GFP標(biāo)簽的h2af1o mRNA注射到GV1期卵母細(xì)胞, 發(fā)現(xiàn)經(jīng)顯微操作和體外誘導(dǎo)后不僅可以通過GFP綠色熒光信號(hào)活體觀察GVBD、受精、卵裂和早期胚胎發(fā)育的全過程, 而且誘導(dǎo)成熟的卵子仍可正常受精和胚胎發(fā)育。研究建立的銀鯽卵母細(xì)胞體外誘導(dǎo)成熟技術(shù)為銀鯽和其他魚類卵母細(xì)胞發(fā)育過程研究及其相關(guān)基因和細(xì)胞顯微操作提供了技術(shù)平臺(tái)。

銀鯽; 卵母細(xì)胞成熟; 體外誘導(dǎo); 生發(fā)泡; 顯微注射

卵母細(xì)胞是高度分化的細(xì)胞, 它的發(fā)育、成熟和受精是生命發(fā)生的開端[1,2]。對(duì)其母源關(guān)鍵因子的研究將揭示調(diào)控這些生命發(fā)生基本過程的分子機(jī)制, 但由于這些母源因子是在卵母細(xì)胞體內(nèi)成熟階段發(fā)揮作用, 因此對(duì)它們的研究需要突破卵母細(xì)胞體外成熟技術(shù)。在大多數(shù)脊椎動(dòng)物中, 卵母細(xì)胞在進(jìn)入減數(shù)分裂期, 會(huì)停滯于第一次減數(shù)分裂期的雙線期, 此時(shí)細(xì)胞核明顯變大, 稱為“生發(fā)泡Germinal vesicle, GV)期”[3]。在促性腺激素作用下, 卵母細(xì)胞可恢復(fù)第一次減數(shù)分裂, 發(fā)生生發(fā)泡破裂(Germinal vesicle broken down, GVBD)而成熟[5,6]。卵母細(xì)胞的體外成熟(in vitro maturation, IVM), 是指將卵巢中處于未成熟的生發(fā)泡期或生發(fā)泡破裂前期的卵母細(xì)胞, 在體外加入誘導(dǎo)物質(zhì)經(jīng)過適宜的條件培養(yǎng), 促使它們完成減數(shù)分裂, 人工誘導(dǎo)成熟,并具備受精及胚胎發(fā)育的能力[7,8]。此項(xiàng)技術(shù)在哺乳動(dòng)物中的研究較為多見, 是卵母細(xì)胞減數(shù)分裂、成熟、受精和早期胚胎發(fā)育研究的重要技術(shù)之一。在斑馬魚、鰻、泥鰍等少數(shù)魚類中也開展了相關(guān)研究[8—10], 結(jié)果均表明孕酮激素(17α, 20β-dihydroxy-4-pregnen-3-one, DHP)是體外誘導(dǎo)成熟最有效的荷爾蒙激素, 而且不同魚類卵母細(xì)胞的最適宜的體外誘導(dǎo)成熟系統(tǒng)存在差異[11—13]。譬如, 斑馬魚卵母細(xì)胞最適宜的誘導(dǎo)系統(tǒng)是在90%Leibovitz L-15(L-15)培養(yǎng)基(含0.5 mg/L的BSA, pH 9.0)中培養(yǎng)270min[8]; 鰻卵母細(xì)胞的體外培養(yǎng)液是格氏培養(yǎng)體系(pH 8.2), 不加BSA, 并在體外培養(yǎng)成熟前3—6h加入了前列腺素2a (PGF2a)[9]; 泥鰍卵母細(xì)胞是在75%L-15培養(yǎng)基(pH 9.0)中加入20%鯉卵巢液和人絨毛膜促性腺激素(Human Chorionic Gonadotropin, HCG)處理[10]。在上述研究中, 體外培養(yǎng)的卵母細(xì)胞的成熟度都是以其大小達(dá)到一定尺寸為標(biāo)準(zhǔn)[13], 均沒有從卵母細(xì)胞的生發(fā)泡和染色體的狀態(tài)進(jìn)行評(píng)判。

銀鯽(Carassius auratus gibelio)是一種廣泛分布于亞歐大陸的多倍體魚類[14,15], 被證明經(jīng)歷了兩輪連續(xù)的多倍化歷程[16], 且具有雌核生殖、兩性生殖和類雜種生殖等多重生殖方式[17,18]。這些特性使其成為一種開展發(fā)育遺傳學(xué)研究的獨(dú)特對(duì)象[19,20]。本實(shí)驗(yàn)室已鑒定出一批與銀鯽卵子發(fā)生、卵母細(xì)胞成熟、受精和早期胚胎發(fā)育相關(guān)的重要基因, 并進(jìn)行了表達(dá)特征研究和初步的功能分析, 為研究脊椎動(dòng)物生殖方式及其調(diào)控機(jī)制提供了重要線索[21—27],但一些涉及卵母細(xì)胞早期發(fā)育的相關(guān)基因的功能研究需要在卵母細(xì)胞減數(shù)成熟前進(jìn)行顯微操作, 并體外誘導(dǎo)成熟, 進(jìn)行授精和發(fā)育。因此, 迫切需要建立適宜的銀鯽卵母細(xì)胞顯微注射和體外誘導(dǎo)成熟技術(shù)。目前, 有關(guān)銀鯽卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)技術(shù)的研究報(bào)道較少, 且僅僅培養(yǎng)到GVBD期, 僅以第一極體排出作為卵母細(xì)胞成熟的形態(tài)學(xué)標(biāo)志[28—30]。因此, 目前已報(bào)道的銀鯽卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)技術(shù)還不足以進(jìn)行母源因子及胚胎早期發(fā)育相關(guān)基因的功能研究, 仍然存在著很多技術(shù)問題需要解決。譬如, 如何解決平行實(shí)驗(yàn)中選擇卵母細(xì)胞發(fā)育時(shí)相一致性; 進(jìn)行顯微操作后的卵母細(xì)胞能否體外誘導(dǎo)成熟、能否受精和孵化。

本研究借鑒其他魚類體外成熟的培養(yǎng)系統(tǒng), 并根據(jù)銀鯽卵母細(xì)胞自身的特點(diǎn), 利用前期在實(shí)驗(yàn)室建立的生發(fā)泡剝離技術(shù), 建立了一種適合銀鯽卵母細(xì)胞顯微操作和體外誘導(dǎo)成熟技術(shù)。首先, 參照Lodde等[31]的研究將銀鯽IV時(shí)相的卵母細(xì)胞細(xì)分為GV0、GV1、GV2和GV3四個(gè)發(fā)育時(shí)期, 并對(duì)每個(gè)時(shí)期的卵母細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)的成熟率、卵裂率和孵化率的比較, 確定了可以進(jìn)行體外誘導(dǎo)成熟的最早卵母細(xì)胞的發(fā)育時(shí)期為GV1期; 接著, 通過對(duì)不同培養(yǎng)條件下GV1期的卵母細(xì)胞的卵裂率和孵化率的分析, 確定了體外誘導(dǎo)銀鯽卵母細(xì)胞最適合的培養(yǎng)條件。此外, 對(duì)GV1期卵母細(xì)胞顯微注射GFP-zfh2af1o mRNA后, 在適宜體外培養(yǎng)條件下, 進(jìn)行體外誘導(dǎo)成熟、授精, 并通過熒光示蹤觀察外源基因的表達(dá)情況。本研究建立的方法可為銀鯽卵母細(xì)胞減數(shù)分裂和成熟相關(guān)基因的功能研究提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

銀鯽雌性個(gè)體取自中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所官橋?qū)嶒?yàn)基地。在3月上旬到4月下旬之間的繁殖季節(jié), 選取不同發(fā)育程度的雌性個(gè)體的卵巢用于分離卵母細(xì)胞。體外誘導(dǎo)卵母細(xì)胞成熟后, 選取成熟的興國(guó)紅鯉(Cyprinus carpio var. Singuonensis)為雄性親本, 每次采集新鮮的精液用于授精。

1.2 主要試劑及培養(yǎng)液配制

卵母細(xì)胞培養(yǎng)液格氏平衡鹽溶液(Gey’s balanced salt solution, GBSS)[29](7.25 g NaCl、0.41 g NaH2PO4、0.38 g KCl、0.95 g HEPES、1.0 g葡萄糖、0.147 g CaCl2、0.23 g MgSO4、0.1 g 1000 U青霉素、0.1 g硫酸鏈霉素, 配制1 L)分別配置成pH為7.5、8.0、8.5、9.0和9.5的梯度, 過濾除菌, 放置4℃冰箱備用。其中CaCl2和MgSO4需要配置母液, 按照MgSO4、CaCl2的順序依次往卵母細(xì)胞培養(yǎng)液格氏平衡鹽溶液中滴加, 以免產(chǎn)生沉淀。90%的L-15培養(yǎng)液按照Seki等[8]描述配置。每種培養(yǎng)液中均加入1 μg/mL孕酮激素。

1.3 適合體外誘導(dǎo)的銀鯽Ⅳ時(shí)相卵母細(xì)胞發(fā)育階段的篩選

在繁殖季節(jié), 多數(shù)銀鯽卵母細(xì)胞處于Ⅳ時(shí)相,此時(shí)相的卵母細(xì)胞直徑在1—1.2 mm左右。為了細(xì)分銀鯽Ⅳ時(shí)相卵母細(xì)胞發(fā)育階段, 我們首先在無菌條件下用鑷子將銀鯽不同個(gè)體的卵巢取出后, 分別轉(zhuǎn)移至預(yù)熱至23℃的GBSS和L-15卵母細(xì)胞培養(yǎng)液中, 接著從中分離10顆左右的卵母細(xì)胞, 用透明液(甲醇∶乙酸=3∶1)在解剖鏡下檢查核(生發(fā)泡)的邊移情況。根據(jù)生發(fā)泡的位置將把銀鯽Ⅳ時(shí)相卵母細(xì)胞分為GV0、GV1、GV2和GV3四個(gè)時(shí)期[31],同時(shí)利用本實(shí)驗(yàn)室已建立的生發(fā)泡剝離技術(shù), 取對(duì)應(yīng)時(shí)期卵母細(xì)胞的生發(fā)泡, 參照Zhang等[18,32]描述的方法對(duì)染色體進(jìn)行DAPI染色, 并在激光共聚焦顯微鏡(Zeiss LSM710, 德國(guó))下進(jìn)行觀察和拍照。由于來自銀鯽同一個(gè)體的卵母細(xì)胞發(fā)育程度均一,因此我們可以根據(jù)上述分析結(jié)果獲得具有活性的、發(fā)育一致的分別處于GV0、GV1、GV2和GV3時(shí)相的卵母細(xì)胞。接著, 利用實(shí)驗(yàn)室前期的銀鯽卵母細(xì)胞的體外誘導(dǎo)方法[30]對(duì)4個(gè)時(shí)期的卵母細(xì)胞分別進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng), 并統(tǒng)計(jì)成熟率, 每4h統(tǒng)計(jì)一次。

1.4 銀鯽卵母細(xì)胞體外誘導(dǎo)成熟條件的優(yōu)化

選取處于GV1期的卵母細(xì)胞, 放置于6 mL的GBSS和L-15培養(yǎng)液的平皿(直徑30 mm、高度0.17 mm)中進(jìn)行培養(yǎng), 以每毫升培養(yǎng)10顆卵母細(xì)胞為宜。分別配制pH為7.5、8.0、8.5、9.0和9.5五個(gè)梯度, 每種梯度都加入1 μg/mL的DHP, 23℃培養(yǎng)誘導(dǎo)卵母細(xì)胞體外成熟。在體外誘導(dǎo)8h后開始每隔1 h進(jìn)行成熟率的統(tǒng)計(jì)。

1.5 體外誘導(dǎo)卵母細(xì)胞卵裂率和孵化率的統(tǒng)計(jì)

卵母細(xì)胞經(jīng)體外誘導(dǎo)后, 選透明的卵母細(xì)胞用尖鑷子剝?nèi)V泡膜(圖 1)。連續(xù)在誘導(dǎo)培養(yǎng)液中剝離50顆卵母細(xì)胞后, 參照干法授精[33]完成體外受精;待受精卵發(fā)育至二胞期, 選分裂比較均勻的卵子統(tǒng)計(jì)卵裂率, 并追蹤至出苗期統(tǒng)計(jì)孵化率。誘導(dǎo)16h后停止每組的成熟統(tǒng)計(jì)和授精工作。

1.6 GV1期卵母細(xì)胞的顯微注射、體外誘導(dǎo)成熟和人工授精

首先按照本實(shí)驗(yàn)室已報(bào)道的方法體外轉(zhuǎn)錄合成了帶GFP標(biāo)簽的h2af1o mRNA[25,34], 接著按照每顆卵1—2 nL的劑量, 將GFP-zfh2af1o mRNA顯微注射到處于GV1期的卵母細(xì)胞中。注射針尖開口小于0.5 μm[35]。處于GV1期的卵母細(xì)胞膜薄而透明,核膨大明顯可見, 可以精確地注射到核的區(qū)域或附近。注射后的卵母細(xì)胞放置在pH為8.5加有1 μg/mL DHP的卵母細(xì)胞培養(yǎng)液GBSS中, 在23℃培養(yǎng)箱中體外誘導(dǎo)12h后, 剝離濾泡膜, 進(jìn)行人工授精。其受精卵完全脫膜[35]后直接在熒光顯微鏡下追蹤, 觀察并拍照。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

成熟率=透明的卵母細(xì)胞數(shù)/體外誘導(dǎo)的總卵母細(xì)胞數(shù)×100%; 卵裂率=觀察到分裂均勻二胞的胚胎/經(jīng)過人工授精的總胚胎數(shù)×100%; 孵化率=孵出的魚苗數(shù)/經(jīng)過人工授精的總胚胎數(shù)×100%; 3次實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS軟件進(jìn)行單因素方差分析, 數(shù)據(jù)間比較用Tukey’s法進(jìn)行, 并利用GraphPad Prism 6作圖軟件繪制曲線或柱狀圖來顯示, 取P＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 不同發(fā)育階段Ⅳ時(shí)相卵母細(xì)胞體外誘導(dǎo)成熟的比較

為了確定可以進(jìn)行體外誘導(dǎo)成熟的銀鯽卵母細(xì)胞的發(fā)育時(shí)期, 我們首先根據(jù)生發(fā)泡向受精孔遷移的位置和減數(shù)分裂前期染色體的凝集狀態(tài), 將銀鯽Ⅳ時(shí)相卵母細(xì)胞分為GV0、GV1、GV2和GV3期; 接著我們將分別處于4個(gè)時(shí)期的卵母細(xì)胞按照孫敏等[30]描述的方法進(jìn)行體外誘導(dǎo)培養(yǎng), 統(tǒng)計(jì)卵母細(xì)胞的成熟率、卵裂率和孵化率。如圖 2所示, 處于GV0期的卵母細(xì)胞, 生發(fā)泡位于卵母細(xì)胞中部或稍邊移(圖 2A, GV0), 減數(shù)分裂前期染色體處于未凝聚狀態(tài)(圖 2B, GV0); 體外誘導(dǎo)培養(yǎng)8h成熟率為零, 培養(yǎng)10h開始發(fā)生GVBD, 培養(yǎng)到12h有14.3%的卵母細(xì)胞成熟, 但進(jìn)行人工授精的胚胎卵裂率較低(＜10%), 當(dāng)增加培養(yǎng)時(shí)間至16h, 成熟率可達(dá)到63.16%, 卵裂率有37.5%, 繼續(xù)培養(yǎng)到24h, 成熟率和分裂率已有所下降, 均沒有胚胎能正常孵化出膜(圖 2C, GV0)。處于GV1期的銀鯽卵母細(xì)胞, 生發(fā)泡開始膨大, 明顯邊移(圖 2A, GV1), 減數(shù)分裂前期染色體開始濃縮變粗(圖 2B, GV1); 體外誘導(dǎo)4h開始發(fā)生GVBD, 成熟率約有64.5%, 卵裂率約有30%, 但求未見可孵化的胚胎, 隨著培養(yǎng)時(shí)間增加,成熟率和卵裂率也不斷提高, 培養(yǎng)到8h, 開始出現(xiàn)有少量孵化胚胎, 其孵化率約3%, 體外誘導(dǎo)培養(yǎng)12h后有大約30.6%的胚胎可以孵化出膜, 繼續(xù)培養(yǎng)到16h, 成熟率和分裂率也開始下降, 孵化率僅有7.8%(圖 2C, GV1)。當(dāng)銀鯽卵母細(xì)胞發(fā)育到GV2期, 生發(fā)泡更靠近卵孔(圖 2A, GV2), 減數(shù)分裂前期染色體進(jìn)一步的凝聚變粗(圖 2B, GV2); 體外誘導(dǎo)成熟時(shí)間有所縮短, 成熟率、卵裂率和孵化率都有所提高(圖 2C, GV2)。處于GV3期的卵母細(xì)胞的生發(fā)泡已靠近受精孔, 核膜已融合(圖 2A, GV3),減數(shù)分裂前期染色體濃縮的更粗更短(圖 2B, GV3); 卵母細(xì)胞發(fā)育越靠后, 到GVBD時(shí)期所用的時(shí)間越短, 卵裂率和孵化率越高。以培養(yǎng)12h為例,在GV3期的卵母細(xì)胞成熟率、卵裂率、孵化率分別提高到88.5%、68.7%和42.5%(圖 2C, GV3)。上述結(jié)果表明, GV1期之后的卵母細(xì)胞均可以有效進(jìn)行體外誘導(dǎo)成熟, 并可正常受精發(fā)育, 孵化出苗; 由于GV1期在體外時(shí)間較長(zhǎng), 有利操作, 我們一般選GV1期作為體外誘導(dǎo)的最佳時(shí)期的卵母細(xì)胞。

圖 1 體外誘導(dǎo)成熟銀鯽卵母細(xì)胞在解剖鏡下剝離濾泡膜的過程

2.2 最佳培養(yǎng)液和最佳誘導(dǎo)時(shí)間的確定

為了篩選適合銀鯽卵母細(xì)胞體外誘導(dǎo)的培養(yǎng)液, 我們配制了pH分別為7.5、8.0、8.5、9.0和9.5的GBSS和L-15培養(yǎng)液, 對(duì)GV1期銀鯽卵母細(xì)胞進(jìn)行體外誘導(dǎo), 并對(duì)誘導(dǎo)成熟的卵母細(xì)胞進(jìn)行授精和胚胎發(fā)育狀態(tài)觀察。誘導(dǎo)13h后的結(jié)果表明, 在pH 8.5的GBSS培養(yǎng)液中, 銀鯽GV1期卵母細(xì)胞的平均成熟率、卵裂率和孵化率分別為91.3%、74.6%和42.5%, 均高于其他pH梯度的GBSS培養(yǎng)液中的結(jié)果(圖 3A)。在pH 9.0的L-15培養(yǎng)液中, 銀鯽GV1期卵母細(xì)胞的平均成熟率、卵裂率和孵化率分別為89.3%、71.0%和25.3%, 均高于其他pH梯度的結(jié)果(圖 3B)。對(duì)這2種不同培養(yǎng)液之間的比較表明, pH 8.5的GBSS培養(yǎng)液更適合銀鯽卵母細(xì)胞體外誘導(dǎo), 其誘導(dǎo)成熟率和卵裂率略高于pH 9.0的L-15培養(yǎng)液的結(jié)果, 且孵化率顯著高于pH 9.0的L-15培養(yǎng)液的結(jié)果(P＜0.05)。

圖 2 銀鯽Ⅳ時(shí)相卵母細(xì)胞不同發(fā)育階段(GV0、GV1、GV2和GV3)生發(fā)泡偏移情況(A)、減數(shù)分裂前期染色體狀態(tài)(B)和其體外誘導(dǎo)的成熟、卵裂和孵化能力(C)Fig. 2 Germinal vesicle (GV) migration (A), DAPI-stained premeiotic chromosome spread (B) and the in vitro abilities to induce maturation, fertilization and hatching (C) of gibel carp oocytes at GV0, GV1, GV2 and GV3 stagesA. 白色星號(hào)指示生發(fā)泡, 黑色箭頭指向卵孔; 比例尺=0.5 mm; B. 比例尺=20 μm。C. 橫坐標(biāo)為體外誘導(dǎo)時(shí)間A. Germinal vesicle (GV) and micropyle are indicated by white asterisks and black arrows, respectively. Scale bar=0.5 mm; B. Scale bar =20 μm; C. Abscissa denotes in vitro induction time

接著, 我們選擇pH 8.5的GBSS培養(yǎng)液, 對(duì)銀鯽GV1期卵母細(xì)胞進(jìn)行體外誘導(dǎo)成熟, 觀察并統(tǒng)計(jì)不同誘導(dǎo)時(shí)間后銀鯽卵母細(xì)胞的平均成熟率、卵裂率和孵化率。如圖 4所示, 在體外誘導(dǎo)4.5h后, 生發(fā)泡開始破裂, 卵母細(xì)胞開始透明; 誘導(dǎo)8h后, 超過90%的卵母細(xì)胞的生發(fā)泡都已破裂。3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明, 誘導(dǎo)8h至16h之間的成熟率沒有顯著性差異, 均高達(dá)90%; 但不同誘導(dǎo)時(shí)間的卵裂率和孵化率差異顯著, 誘導(dǎo)12h后卵裂率和孵化率均是最高的, 分別為81.2%和55.5%。誘導(dǎo)8h后的卵裂率僅有4.4%, 孵化率為0; 誘導(dǎo)16h后卵裂率為26.5%, 孵化率為3.4% (圖 4)。以上結(jié)果表明, 銀鯽GV1期卵母細(xì)胞體外誘導(dǎo)成熟的適宜條件是在pH 8.5的GBSS培養(yǎng)液中誘導(dǎo)12h。

2.3 體外誘導(dǎo)卵母細(xì)胞的顯微操作及其發(fā)育過程的示蹤觀察

圖 3 處于GV1期的銀鯽卵母細(xì)胞在不同pH(pH 7.5—9.5)的GBSS培養(yǎng)液(A)和L-15培養(yǎng)液(B)中體外誘導(dǎo)的成熟率、卵裂率和孵化率的比較結(jié)果(*P＜0.05)Fig. 3 The maturation rate (%), cleavage rate (%) and hatching rate (%) of gibel carp GV1 oocytes in vitro in GBSS cell-culture medium (A) and L-15 (B) cell-culture medium with different pH 7.5—9.0 (*P＜0.05)

圖 4 銀鯽GV1期卵母細(xì)胞在GBSS培養(yǎng)液(pH 8.5)中體外誘導(dǎo)不同時(shí)間的成熟、分裂及孵化能力的比較Fig. 4 The ability of gibel carp GV1 oocytes to mature, fertilize, and hatch after cultured in GBSS medium (pH 8.5) for 8—16h相同顏色柱子上不同的字母表示差異顯著(P＜0.05)Values with different subscripts within the same color criterion were significantly different (P＜0.05)

為了進(jìn)一步評(píng)價(jià)銀鯽卵母細(xì)胞體外誘導(dǎo)成熟的顯微操作能力及其相關(guān)技術(shù), 我們將體外轉(zhuǎn)錄合成的帶GFP標(biāo)簽的h2af1o mRNA[23,25]注射到GV1期卵母細(xì)胞, 然后在GBSS培養(yǎng)液(pH 8.5, 含1 μg/mL DHP)中體外誘導(dǎo)成熟, 經(jīng)授精直到胚胎發(fā)育, 利用其表達(dá)產(chǎn)物定位于染色質(zhì)可示蹤細(xì)胞核的特性[23,25],用其綠色熒光來示蹤評(píng)價(jià)顯微操作效果及其發(fā)育全過程。如圖 5所示, 在顯微注射后(圖 5A)體外誘導(dǎo)2h時(shí), 核區(qū)開始出現(xiàn)綠色熒光信號(hào)(圖 5B); 誘導(dǎo)4h后, 胚泡破裂, 綠色熒光信號(hào)擴(kuò)散到動(dòng)物極(圖 5C);誘導(dǎo)12h后, 剝離濾泡膜進(jìn)行人工授精, 待發(fā)育至一胞期時(shí), 綠色熒光信號(hào)開始集中于細(xì)胞核(圖 5D);由于綠色熒光標(biāo)示出細(xì)胞核, 發(fā)育至二胞期(圖 5E)、八胞期(圖 5F)、256胞期(圖 5G)、以致囊胚期(圖 5H)的胚胎清晰可辨。上述結(jié)果表明, 體外誘導(dǎo)的卵母細(xì)胞不僅可以通過熒光信號(hào)活體觀察GVBD、受精、卵裂和早期胚胎發(fā)育的全過程, 而且經(jīng)過顯微操作后的卵母細(xì)胞, 仍可以正常被誘導(dǎo)減數(shù)分裂成熟以及正常受精和胚胎發(fā)育。

3 討論

卵母細(xì)胞成熟是相當(dāng)復(fù)雜的生理過程, 包括細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)成熟, 但在體外誘導(dǎo)成熟過程中, 卵母細(xì)胞的發(fā)育程度和培養(yǎng)條件都可能造成細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)發(fā)育不同步而使卵母細(xì)胞的成熟受到影響[5—8]。在適宜培養(yǎng)條件下, 只有具備恢復(fù)減數(shù)分裂能力的卵母細(xì)胞才能夠成熟[4,5], 因此, 選擇合適發(fā)育程度的卵母細(xì)胞和適宜培養(yǎng)條件非常重要。

目前, 關(guān)于銀鯽卵母細(xì)胞體外誘導(dǎo)培養(yǎng)的報(bào)道不多。Wang等[28]報(bào)道在GBSS培養(yǎng)液加入0 .5 μg/mL的DHP, 24℃培養(yǎng)20h可以誘導(dǎo)66.7%的銀鯽卵母細(xì)胞發(fā)生GVBD。而孫敏等[30]將分離的銀鯽Ⅳ期卵母細(xì)胞在GBSS培養(yǎng)液(pH 7.4—7.7, 含1 μg/mL的DHP)中, 22—23℃體外培養(yǎng)6h后有90%的銀鯽卵母細(xì)胞發(fā)生GVBD。由此可見在這些銀鯽卵母細(xì)胞體外誘導(dǎo)成熟的報(bào)道中, 基于卵母細(xì)胞大小選擇IV時(shí)相卵母細(xì)胞進(jìn)行體外誘導(dǎo)到GVBD的時(shí)間存在較大的差異[28—30], 這可能跟所選擇的IV時(shí)相卵母細(xì)胞本身發(fā)育階段不同有關(guān)。而且, 誘導(dǎo)減數(shù)分裂成熟的判斷是基于細(xì)胞學(xué)觀察GVBD的發(fā)生[36], 并沒有進(jìn)行受精和孵化能力的驗(yàn)證[8,28—30]。為了建立可重復(fù)的適合銀鯽卵母細(xì)胞顯微操作和體外誘導(dǎo)成熟的技術(shù), 本研究首先通過卵母細(xì)胞的GV邊移程度和減數(shù)分裂前期染色體凝集狀態(tài)之間的關(guān)系, 將銀鯽IV時(shí)相卵母細(xì)胞進(jìn)一步分為GV0、GV1、GV2和GV3四個(gè)時(shí)期。在此基礎(chǔ)上, 對(duì)每個(gè)時(shí)期的卵母細(xì)胞分別進(jìn)行體外培養(yǎng), 結(jié)果表明GV1期之后的卵母細(xì)胞均可以有效進(jìn)行體外誘導(dǎo)成熟和受精, 且發(fā)育越靠后的卵母細(xì)胞, 到GVBD時(shí)所用的時(shí)間越短, 卵裂率和孵化率越高。因此, 卵母細(xì)胞發(fā)育程度是卵母細(xì)胞體外誘導(dǎo)獲得高成熟率、高卵裂率和高孵化率的重要條件之一[10]。該研究為銀鯽卵母細(xì)胞選擇上提供了依據(jù), 增加了實(shí)驗(yàn)的可重復(fù)性。

圖 5 GFP-zfh2af1o mRNA顯微注射到GV1期卵母細(xì)胞體外誘導(dǎo)成熟, 受精和胚胎發(fā)育的熒光示蹤

體外誘導(dǎo)卵母細(xì)胞減數(shù)分裂成熟后, 不僅需要通過GVBD來判斷卵母細(xì)胞是否成熟[28—30], 更重要的是需要驗(yàn)證這些體外誘導(dǎo)成熟的卵母細(xì)胞是否具有受精能力和孵化出苗的能力[8]。在本實(shí)驗(yàn)中,通過統(tǒng)計(jì)卵母細(xì)胞體外誘導(dǎo)成熟率、卵裂率和孵化率發(fā)現(xiàn), 在GBSS(pH 8.5)培養(yǎng)液中誘導(dǎo)8—16h成熟率無顯著性差異, 但不同誘導(dǎo)時(shí)間的卵裂率和孵化率差異顯著, 其中誘導(dǎo)12h后卵裂率和孵化率均是最高的, 表明該誘導(dǎo)時(shí)間是卵母細(xì)胞體外誘導(dǎo)核質(zhì)同步成熟的最佳時(shí)間點(diǎn)。在該時(shí)間點(diǎn)之前卵母細(xì)胞雖然已經(jīng)透明但未達(dá)到核質(zhì)同步成熟, 誘導(dǎo)時(shí)間太長(zhǎng)可能導(dǎo)致卵子過熟, 從而影響受精能力和孵化能力。因此, 本研究在卵母細(xì)胞體外誘導(dǎo)成熟的判斷標(biāo)準(zhǔn)上, 不僅通過GVBD的發(fā)生來判斷卵母細(xì)胞的成熟, 又進(jìn)一步通過受精和孵化能力的比較建立了判斷銀鯽卵母細(xì)胞體外誘導(dǎo)核質(zhì)同步成熟的時(shí)間和條件。

本研究建立了銀鯽卵母細(xì)胞體外誘導(dǎo)成熟的適宜條件: 分離處于GV1期的卵母細(xì)胞, 對(duì)其顯微注射后放置于加有1 μg/mL DHP的GBSS溶液(pH 8.5)中, 在23℃培養(yǎng)箱中體外誘導(dǎo)12h, 即可獲得核質(zhì)同步成熟的銀鯽卵母細(xì)胞。本研究可為分析魚類卵母細(xì)胞早期發(fā)育相關(guān)基因的功能提供技術(shù)平臺(tái)。

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DEVELOPMENT OF IN VITRO MATURATION TECHNOLOGY FOR GIBEL CARP OOCYTES

LI Zhi, WANG Yang, ZHOU Li, LI Xi-Yin, ZHANG Xiao-Juan, ZHOU Jian and GUI Jian-Fang
(State Key Laboratory of Freshwater Ecology and Biotechnology, Institute of Hydrobiology, Chinese Academy of Sciences, Wuhan 430072, China)

In vitro oocytes maturation is a key and efficient technology for gene and cellular micromanipulation in oocytes of fish. In this study, we used gibel carp oocytes as studying materials to develop an efficient in vitro induction maturation technology. Based on previously established germinal vesicle (GV) isolation and premeiotic chromosome preparation methods , four different stage oocytes including GV0, GV1, GV2 and GV3 were firstly distinguished by GV migration and premeiotic chromosome condensation status, and the maturation rate (%), cleavage rate (%) and hatching rate (%) were analyzed. GV1, GV2 and GV3 oocytes had the capacity for in vitro induction maturation, and GV1 oocytes were the optimal stage oocytes because they have longer time for micromanipulation. We found that the optimal induction conditions for GV1 oocytes in vitro were 12 hours at 23℃ in pH 8.5 Gey’s balanced salt solution(GBSS) with 1 μg/ml DHP (17α, 20β-dihydroxy-4-pregne-3-one), by which up to 55.5% hatching rate was reached from these stripped follicle membrane oocytes. Moreover, we injected the GFP-zfh2af1o mRNA into the GV1 oocytes, and found that the whole process of in vitro maturation, fertilization and embryo development of the micromanipulated GV1 oocytes could be tracked by the expression of GFP, and normal fertilization and embryo development could be produced from the induced mature eggs. Therefore, we established an efficient platform for studying oocyte development and gene and cellular micromanipulation in this fish.

Gibel carp; Oocyte; In vitro maturation; Germinal vesicle; Micromanipulation

Q-366

A

1000-3207(2017)05-0984-08

10.7541/2017.123

2016-07-08;

2016-11-04

中國(guó)科學(xué)院戰(zhàn)略性先導(dǎo)科技專項(xiàng)(XDA08030201)資助 [Supported by the Strategic Priority Research Program of Sciences (XDA08030201)]

李志(1980—), 女, 河南周口人; 實(shí)驗(yàn)師; 主要從事魚類發(fā)育遺傳研究。E-mail: lizhi@ihb.ac.cn

桂建芳, E-mail: jfgui@ihb.ac.cn