池蝶蚌β-連環(huán)蛋白基因cDNA的克隆及表達(dá)特征分析

閆含笑 史建伍 盛軍慶 王軍花 洪一江

(南昌大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 南昌 330000)

池蝶蚌β-連環(huán)蛋白基因cDNA的克隆及表達(dá)特征分析

閆含笑 史建伍 盛軍慶 王軍花 洪一江

(南昌大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 南昌 330000)

為了解淡水貝類性別調(diào)控與分化機(jī)制, 課題組建立了池蝶蚌(Hyriopsis schlegelii)性腺轉(zhuǎn)錄組, 在轉(zhuǎn)錄組庫中, 存在β-連環(huán)蛋白(β-catenin)基因序列。實(shí)驗(yàn)對(duì)池蝶蚌β-catenin基因進(jìn)行驗(yàn)證, 采用RACE技術(shù)克隆其cDNA全長, 命名為Hsβ-catenin。該序列全長4386 bp, 5′-非編碼區(qū)為162 bp, 3′-非編碼區(qū)為1758 bp, 開放閱讀框?yàn)?466 bp, 編碼821個(gè)氨基酸; 該蛋白結(jié)構(gòu)域主要由12個(gè)ARM重復(fù)序列組成; 二級(jí)結(jié)構(gòu)中, α-螺旋占47.75%, β-折疊占1.22%, 隨機(jī)卷曲占51.04%; 三級(jí)結(jié)構(gòu)中含大量α-螺旋且為右手超螺旋, 構(gòu)成ARM結(jié)構(gòu)域; 系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明, Hsβ-catenin與軟體動(dòng)物聚為一支, 然后與昆蟲類聚為一支。實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測顯示, Hsβ-catenin在腸中表達(dá)量最高, 其次是斧足和精巢。Hsβ-catenin基因在12月齡和36月齡表達(dá)量較高, 且在36月齡表達(dá)量最高, 表明其可能參與池蝶蚌的性別調(diào)控與分化作用。

池蝶蚌; Hsβ-catenin; 組織表達(dá); 克隆; 序列分析; qRT-PCR

β-連環(huán)蛋白(β-catenin)是連環(huán)蛋白家族中的一個(gè)蛋白, 于1980年作為一種黏附因子被發(fā)現(xiàn)[1]。βcatenin有3個(gè)結(jié)構(gòu)域, N末端區(qū)包括多個(gè)絲氨酸、蘇氨酸殘基作為多種酶的磷酸化位點(diǎn); 中央?yún)^(qū)是最保守的區(qū)域, 含12—14個(gè)ARM結(jié)構(gòu)域(犰狳重復(fù)結(jié)構(gòu)域), 每個(gè)ARM結(jié)構(gòu)域形成呈三角形排列的3個(gè)環(huán)形結(jié)構(gòu), 這些結(jié)構(gòu)域因帶正電荷在超螺旋結(jié)構(gòu)中形成凹槽, 成為Wnt通路中許多信號(hào)分子的結(jié)合位點(diǎn); C末端區(qū)含有轉(zhuǎn)錄激活區(qū), 能夠激活下游靶基因的轉(zhuǎn)錄[2]。β-catenin蛋白廣泛存在于各類細(xì)胞中, 主要通過與其他分子形成復(fù)合物在不同組織結(jié)構(gòu)中起作用[3]; 在細(xì)胞中主要有2個(gè)作用, 一是與細(xì)胞膜上的鈣黏蛋白相互作用, 參與細(xì)胞間黏附, 二是作為Wnt信號(hào)通路中的關(guān)鍵信號(hào)分子調(diào)控細(xì)胞的生長、分化與凋亡[4]。依賴β-catenin的Wnt通路被稱為經(jīng)典Wnt通路, 多種Wnt通路上的信號(hào)分子與βcatenin結(jié)合形成破壞復(fù)合物, 細(xì)胞外分泌的Wnt配體作用于破壞復(fù)合物并使其降解, β-catenin濃度不斷上升, 進(jìn)而促進(jìn)Wnt蛋白的表達(dá); 而沒有Wnt配體時(shí), β-catenin不斷被磷酸化, 濃度下降, Wnt通路被阻斷[5]。β-catenin被發(fā)現(xiàn)通過Wnt通路對(duì)性別調(diào)控、癌癥的轉(zhuǎn)移侵襲、神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育等途徑起著重要作用。

池蝶蚌(Hyriopsis schlegelii)是優(yōu)質(zhì)的淡水珍珠育珠蚌, 在生長過程中存在雌雄同體現(xiàn)象, 但成熟后性別為單性[6]; β-catenin被發(fā)現(xiàn)在青鳉中具有誘導(dǎo)卵巢發(fā)育甚至使性腺性逆轉(zhuǎn)的作用[7], 我們?cè)诔氐鲂韵俎D(zhuǎn)錄組中也發(fā)現(xiàn)有β-catenin, 是否同樣對(duì)池蝶蚌的性別分化有調(diào)控作用?因此本研究對(duì)池蝶蚌β-catenin基因進(jìn)行克隆, 分析其結(jié)構(gòu)特征及在不同組織和不同年齡性腺中的表達(dá)量, 以為其功能分析奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

體質(zhì)健壯池蝶蚌由江西省撫州市國家級(jí)池蝶蚌良種場提供, 養(yǎng)于實(shí)驗(yàn)室水族箱中, 水溫18—25℃, 每天換已曝氣自來水2次。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

RNA的提取和cDNA的合成 經(jīng)液氮研磨后池蝶蚌組織利用Trizol試劑盒(Invitrogen, USA)一步法提取總RNA, RNA濃度和純度用核酸測定儀(Nanodrop 2000)測定, 并用DNaseⅠ(TaKaRa, Japan)消化處理總RNA以消除基因組DNA的殘留, 最后采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性。使用Super ScriptTMⅢ Reverse Transcriptase Kit反轉(zhuǎn)體系合成cDNA, 備用。

池蝶蚌β-catenin cDNA的克隆 依據(jù)本實(shí)驗(yàn)室已有的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)設(shè)計(jì)上、下游引物, 擴(kuò)增出β-catenin 基因的中間片段。50 μL PCR反應(yīng)體系為: cDNA模版1 μL, Ex Taq酶0.5 μL, 10×Ex Taq buffer 5 μL, dNTP(2.5 mmol/L)5 μL, 上下游引物各1 μL, ddH2O 36.5 μL。PCR反應(yīng)條件為: 94℃預(yù)變性5min; 94℃ 30s, 59℃ 30s, 72℃ 30s, 35個(gè)循環(huán); 72℃延伸10min。設(shè)計(jì)RACE PCR的5′端引物(GSP1和GSP2)和3′端引物(GSP3和GSP4)(表 1)。用特異性引物和通用引物UPM(Long:Short=1:5)為兩側(cè)引物、cDNA為第一輪模版進(jìn)行PCR擴(kuò)增; 用特異性引物和通用引物NUP作為兩側(cè)引物, 將擴(kuò)增產(chǎn)物稀釋10—50倍作為模版進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增,獲得PCR產(chǎn)物。25 μLPCR反應(yīng)體系: cDNA模版1 μL, Ex Taq酶0.3 μL, 10×Ex Taq buffer 2.5 μL, dNTP (2.5 mmol/L)1.2 μL, 上下游引物各1 μL, ddH2O 18 μL。反應(yīng)條件: 94℃預(yù)變性5min; 94℃ 30s, 59℃30s, 72℃ 30s, 35個(gè)循環(huán); 72℃延伸10min。將PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)后, 用瓊脂糖凝膠回收試劑盒(OMEGA公司)回收、純化, 并與pMD19-T載體連接, 轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞E. coli DH5α中, 于LB平板(含Amp+)培養(yǎng), 陽性克隆經(jīng)PCR鑒定后送至上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序。獲得的序列經(jīng)MEGA軟件分析確定為Hsβ-catenin基因。利用ORF finder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)查找此cDNA序列的最大開放閱讀框(ORF), 對(duì)翻譯所得氨基酸序列進(jìn)行一、二、三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測分析, 利用MEGA軟件構(gòu)建分子系統(tǒng)樹。

表 1 PCR相關(guān)引物序列Tab. 1 Primers used for PCR

qRT-PCR分析 采用qRT-PCR技術(shù)檢測Hsβ-catenin基因的組織轉(zhuǎn)錄差異性及不同年齡、不同性別中性腺組織的表達(dá)差異性。根據(jù)得到的Hsβ-catenin cDNA全長序列, 設(shè)計(jì)熒光定量PCR引物(表 1)進(jìn)行qRT-PCR。對(duì)于組織表達(dá)實(shí)驗(yàn), 隨機(jī)選取6只成熟池蝶蚌, 雌、雄各3只采取相同組織混合法分別提取池蝶蚌卵巢、精巢、心臟、外套膜、腸、腎、肝、血和斧足各組織總RNA, 通過1%瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)RNA完整性。將RNA反轉(zhuǎn)為cDNA模板; 不同年齡、不同性別池蝶蚌Hsβcatenin表達(dá)實(shí)驗(yàn)方案: 選取1—4齡雌、雄性池蝶蚌各3只, 取各年齡雌、雄性腺, 按上述方法獲得cDNA模板。根據(jù)熒光定量試劑盒(嵌合檢測法, Takara)進(jìn)行qRT-PCR檢測。20 μL PCR反應(yīng)體系為: SYBR10 μL, 上、下游引物各0.4 μL, H2O 8.2 μL。每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)平行, 以蒸餾水代替模板作為陰性對(duì)照。反應(yīng)條件為: 95℃預(yù)變性5min; 94℃ 30s, 58℃ 30s, 72℃ 30s, 40個(gè)循環(huán); 72℃延伸10min。以上實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次, SPSS軟件分析Hsβ-catenin mRNA在池蝶蚌中的表達(dá)情況, 組織表達(dá)和不同年齡性腺表達(dá)均進(jìn)行單因素方差統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 池蝶蚌Hsβ-catenin 基因cDNA全長及其分析

池蝶蚌Hsβ-catenin 基因cDNA全長 將測序結(jié)果用MEGA軟件處理后拼接成完整的cDNA序列, 全長4386 bp(登錄號(hào)為KY126093), 其中5′端非編碼區(qū)162 bp, 3′端非編碼區(qū)1758 bp, ORF框2466 bp, 共編碼821個(gè)氨基酸。將拼接后的cDNA序列與實(shí)驗(yàn)室已有的轉(zhuǎn)錄組序列進(jìn)行比對(duì), 二者基本相同, 證明了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

Hsβ-catenin蛋白結(jié)構(gòu)域分析 通過瑞士生物信息學(xué)研究所ExPASy服務(wù)器的SMART程序(http://smart.embl-heidelberg.de/)分析池蝶蚌Hsβcatenin蛋白結(jié)構(gòu)域, 可知池蝶蚌Hsβ-catenin蛋白主要由12個(gè)ARM結(jié)構(gòu)域組成。ARM結(jié)構(gòu)是各物種中β-catenin蛋白的中央保守區(qū), 從而驗(yàn)證了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

Hsβ-catenin二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測 通過PredicProtein在線軟件(http://www.predictprotein.org/)對(duì)池蝶蚌Hsβ-catenin的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測。預(yù)測可知二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋占47.75%, 分布比較均勻且大量分布; β-折疊占1.22%, 在各處均有分布, 總量較少; 隨機(jī)卷曲占51.04%, 在兩端分布較多。根據(jù)蛋白表面暴露面積是否超過16%為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)蛋白進(jìn)行親水性和疏水性預(yù)測, 親水性蛋白含量約為49.09%, 疏水性蛋白含量約為50.91%。

Hsβ-catenin三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測 通過瑞士生物信息所ExPASy服務(wù)器的SWISS-MODEL程序(http://swissmodel.expasy.org/)對(duì)池蝶蚌Hsβ-catenin的三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(圖 1)。圖中含大量α-螺旋且為右手螺旋, 每3個(gè)α-螺旋排列在一起形成1個(gè)超螺旋, 即ARM結(jié)構(gòu)域, 中間區(qū)域共形成12個(gè)ARM重復(fù)區(qū)域; 圖中還包括少量β-折疊及大量無規(guī)則卷曲。三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果與二級(jí)結(jié)構(gòu)一致。

圖 1 Hsβ-catenin的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig. 1 The tertiary structure prediction of Hsβ-catenin

2.2 Hsβ-catenin基因的系統(tǒng)發(fā)育分析

在NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/ orfig.cgi)上查找各物種β-catenin 基因的cDNA序列,利用MEGA軟件分析可得到Hsβ-catenin基因的分子進(jìn)化樹(圖 2), 由圖可知, 該基因序列比較保守,同源性較高。池蝶蚌Hsβ-catenin 基因與軟體動(dòng)物的同源性很高, 構(gòu)成一個(gè)分支, 其中與合浦珠母貝(Pinctada martensii)、櫛孔扇貝(Azumapecten farreri)和太平洋牡蠣(Crassostrea gigas)同源性最高,雜斑蓮花青螺(Lottia luchuana)、海蝸牛(Aplysia californica)和大西洋舟螺(Crepidula fornicata Linnaeus)次之; 與昆蟲類的同源性也很高, 如毛翼蟲(Chaetopterus variopedatus)、杜氏闊沙蠶(Platynereis dumerilii)和大斑蝶(Danaus plexippus); 與人類和魚類的同源性相對(duì)較低。

2.3 池蝶蚌Hsβ-catenin組織表達(dá)分析

用熒光定量PCR技術(shù)檢測池蝶蚌Hsβ-catenin在成熟個(gè)體9個(gè)組織中的表達(dá)(圖 3)。由圖可知, Hsβ-catenin 在各組織中均有表達(dá), 表達(dá)量從高到低為: 腸、斧足、精巢、肝、卵巢、心臟、外套膜、腎和血, 相對(duì)Hsβ-actin表達(dá)量分別為: 8.44、4.43、3.05、2.22、1.84、1.00、0.92、0.64和0.06, 表明其在生物體各組織中具有多種生物學(xué)功能, 且在成熟池蝶蚌中精巢表達(dá)量高于卵巢, 推測Hsβ-catenin在性腺發(fā)育成熟后更多地參與其他生物學(xué)功能。

圖 2 不同物種β-catenin基因分子進(jìn)化樹Fig. 2 The phylogenetic tree of β-catenin合浦珠母貝Pinctada martensii (AKJ32471.1)；櫛孔扇貝Azumapecten Farreri (AFU35436.1)；太平洋牡蠣Crassostrea gigas (NP_001292224.1)；池蝶蚌 Aplysia californica (NP_00119 1600.1)；雜斑蓮花青螺Lottia luchuana (XP_009048556.1)；大西洋舟螺Crepidula fornicata Linnaeus (ADI48180.1)；白氏文昌魚Branchiostoma belcheri (BAD12593.1)；意蜂Apis mellifera (NP_001172034.1)；內(nèi)華達(dá)古白蟻Zootermopsis nevadensis (KDR13423.1)；雙斑蟋Gryllus bimaculatus (BAD00045.1)；大斑蝶Danaus plexippus (EHJ72882.1)；嗜鳳梨果蠅Drosophila ananassae (XP_001966028.1)；人類Homo sapiens (CAA61107.1)

2.4 池蝶蚌Hsβ-catenin在不同年齡性腺中的表達(dá)分析

池蝶蚌在5月齡出現(xiàn)性腺, 12月齡雌雄可辨, 36月齡性腺成熟。檢測Hsβ-catenin在不同年齡、不同性腺中的表達(dá)情況(圖 4), 結(jié)果顯示其在3齡(約36月齡)中的表達(dá)最高, 1齡(約12月齡)表達(dá)量次之, 2齡(約24月齡)和4齡(約48月齡)表達(dá)量最少; 在1到3齡中卵巢的表達(dá)量顯著高于精巢的表達(dá)量, 而到4齡時(shí)精巢反而略高于卵巢。

圖 3 Hsβ-catenin在各組織中的表達(dá)量

圖 4 Hsβ-catenin在不同年齡、不同性腺中的表達(dá)量

3 討論

本研究首次獲得池蝶蚌Hsβ-catenin基因的cDNA全長, 并對(duì)其結(jié)構(gòu)特征和蛋白功能進(jìn)行預(yù)測分析。由池蝶蚌Hsβ-catenin蛋白的結(jié)構(gòu)域預(yù)測可知, 其主要由12個(gè)ARM結(jié)構(gòu)域組成, 序列高度保守,有典型的N末端區(qū)和C末端區(qū), 與各種貝類甚至其他物種同源性較高, 預(yù)測結(jié)果與ARM重復(fù)序列的性質(zhì)相同。ARM重復(fù)序列是約有40個(gè)氨基酸的串聯(lián)重復(fù)序列, 通過在果蠅中起信號(hào)傳導(dǎo)的作用首次被發(fā)現(xiàn), 動(dòng)物的ARM蛋白在細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞骨架的調(diào)節(jié)等多種生命活動(dòng)中起作用, 并參與βcatenin、腺瘤樣息肉(APC)的腫瘤抑制蛋白和核運(yùn)輸因子importin α等蛋白的構(gòu)建[8]。ARM結(jié)構(gòu)高度保守, 僅有右手超螺旋結(jié)構(gòu), 普遍存在于真核細(xì)胞中, 如在擬南芥中起著細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)功能的ARM重復(fù)序列對(duì)生長發(fā)育和繁殖起著重要作用[9]。β-catenin包含3個(gè)區(qū)域, 各司其職, 第一個(gè)區(qū)域?yàn)镹末端區(qū), 含有GSK-β一致性的磷酸化位點(diǎn); 第二個(gè)區(qū)域?yàn)橹醒雲(yún)^(qū), 含有ARM重復(fù)序列, 能夠與鈣黏素、APC (Adenomatous polyposis coli)和TCF/LEF (T-cell Factor/Lymphoid Enhancing Factor)相互作用;第三個(gè)區(qū)域?yàn)镃末端區(qū), 含有轉(zhuǎn)錄激活區(qū), 對(duì)靶基因激活是所需的[10]。我們推測在經(jīng)典Wnt通路中, 池蝶蚌β-catenin蛋白ARM結(jié)構(gòu)域中央?yún)^(qū)可以與APC和其他信號(hào)分子結(jié)合形成破壞復(fù)合物, N末端區(qū)的磷酸化位點(diǎn)可與GSK-3β作用, 使破壞復(fù)合物中的β-catenin不斷被磷酸化, 無法進(jìn)入細(xì)胞核中起作用; 當(dāng)Wnt蛋白分泌時(shí), GSK-3β不能磷酸化βcatenin, 從而抑制降解復(fù)合物的形成, 導(dǎo)致胞漿中的β-catenin不被降解并進(jìn)入細(xì)胞核, 中央?yún)^(qū)與核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子LEF/TCF家族成員結(jié)合, 而C末端的轉(zhuǎn)錄激活區(qū)促進(jìn)下游靶基因表達(dá)。

在非洲爪蟾胚胎中, β-catenin出現(xiàn)在所有細(xì)胞中, 參與細(xì)胞間黏附功能, 特別在形態(tài)發(fā)生活躍的區(qū)域如囊胚和原腸胚的邊緣區(qū)有β-catenin高水平表達(dá); 在原基細(xì)胞基團(tuán)之間也發(fā)現(xiàn)β-catenin高水平表達(dá), 說明其參與生物發(fā)育過程[11]。β-catenin可以與FHL2相互作用促進(jìn)小鼠肌細(xì)胞的分化[12], Wnt經(jīng)典通路的激活可以誘導(dǎo)小鼠腎單位的分化和腎的形成[13]。在人類[14]、果蠅[15]、非洲爪蟾[11]、羅非魚[16]等物種中也都具有的廣泛表達(dá)的特點(diǎn)。本研究表明, 池蝶蚌β-catenin在腸、斧足、精巢、肝、卵巢、心臟、外套膜、腎和血9個(gè)組織中均有表達(dá),而不是僅作為性別決定和性別調(diào)控基因大量出現(xiàn)在精巢和卵巢中, 表明其在生物體中廣泛存在且可在不同組織中參與各種生理功能。根據(jù)在外套膜、斧足、腎及各細(xì)胞中的表達(dá)情況及其堿基序列的高度保守性, 我們推測, 其可能參與池蝶蚌肌細(xì)胞的分化與腎的形成, 并參與各組織內(nèi)細(xì)胞間黏連等各種生理活動(dòng), 這與其他物種有功能類似; 但另一方面Hsβ-catenin在池蝶蚌各組織的表達(dá)量相對(duì)較低, 推測是由于Wnt信號(hào)通路在各組織中廣泛存在。

β-catenin是一種親卵巢、抗精巢的信號(hào)分子,對(duì)性別決定機(jī)制起著一定的作用并可導(dǎo)致性逆轉(zhuǎn)。為了研究β-catenin是否可以阻斷睪丸的發(fā)育通路, 在小鼠XY型性細(xì)胞中激活β-catenin的表達(dá), 結(jié)果顯示XY型小鼠雄性發(fā)育通路被阻斷, 并造成雄性到雌性的性逆轉(zhuǎn)[17]。目前一些β-catenin對(duì)性腺?zèng)Q定和分化作用的研究認(rèn)為, 哺乳動(dòng)物尚未分化的性腺的發(fā)育方向是由R-spondin 1、Wnt 4和β-catenin等信號(hào)分子介導(dǎo)的雌性信號(hào)通路和由Sry和Sox9等信號(hào)分子介導(dǎo)的雄性信號(hào)通路相互競爭決定的,性腺最終朝著競爭占優(yōu)勢的一方發(fā)育[16]。我們對(duì)不同性別和不同年齡池蝶蚌中Hsβ-catenin基因的表達(dá)量也進(jìn)行了分析, 結(jié)果發(fā)現(xiàn), 12月齡雌雄可辨時(shí)卵巢中表達(dá)量較高, 36月齡的成熟卵巢中表達(dá)量最高。由此推測, Hsβ-catenin可能在池蝶蚌雌性性別決定與分化過程中起著調(diào)控作用。另外一個(gè)有趣現(xiàn)象是第一次性成熟后的卵巢完成了性腺分化, Hsβ-catenin表達(dá)量反而略低于精巢, 因此我們推測其可能不再行使性腺分化調(diào)控功能。

[1]Muercheer, Wen B. New progresses of β-catenin in colon cancer [J]. Journal of North Sichuan Medical College, 2011, 26(6): 554—558 [木爾扯爾, 文彬. 結(jié)腸癌中βcatenin研究的新進(jìn)展. 川北醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 2011, 26(6): 554—558]

[2]Tan Y, Jiang N, Sun X. The research progress of β-catenin in ovarian cancer and chemoresistance [J]. Maternal and Child Health Care of China, 2015, 30(21):3746—3749 [譚影, 姜寧, 孫信. β-catenin在卵巢癌及化療耐藥中的研究進(jìn)展. 中國婦幼保健, 2015, 30(21): 3746—3749]

[3]Li H L. Cloning of genes Wnt4, β-catenin, Dax1, and their correlation to the gonadal development in scallop Chlamys farreri [D]. Ocean University of China. 2013 [李海龍. 櫛孔扇貝(Chlamys farreri)Wnt4, β-catenin及Dax1基因的克隆及其與性腺發(fā)育相關(guān)性的研究. 中國海洋大學(xué). 2013]

[4]He H. The research progress of β-catenin [J]. Practical Clinical Medicine, 2010, 11(10): 120—123 [何歡. βcatenin的研究進(jìn)展. 實(shí)用臨床醫(yī)學(xué), 2010, 11(10): 120—123]

[5]Azzolin L, Panciera T, Soligo S, et al. YAP/TAZ incorporation in the β-Catenin destruction complex orchestrates the Wnt response [J]. Cell, 2014, 158(1): 157—170

[6]Wang B H. Study on development of the gonad of Hyriopsis schlegelii [D]. Nanchang University. 2010 [王濱花. 池蝶蚌性腺發(fā)育的觀察. 南昌大學(xué). 2010]

[7]Yu X G, Wu L M, Liu G, et al. Function in the ovary differentiation of R-spondins gene from teleost fish [C]. The 2012 Symposium of Chinese Society for Oceanology and Limnology and China Ichthyology Society. 2012 [于祥國, 吳利敏, 劉剛, 等. R-spondins基因在硬骨魚類卵巢分化中的作用研究. 中國海洋湖沼學(xué)會(huì)、中國動(dòng)物學(xué)會(huì)魚類學(xué)分會(huì)2012年學(xué)術(shù)研討會(huì). 2012]

[8]Hatzfeld M. The armadillo family of structural proteins [J]. International Review of Cytology, 1999, (186): 179—224

[9]Coates J. Armadillo repeat proteins: beyond the animal kingdom [J]. Trends in Cell Biology, 2003, 13(9): 463—471

[10]Akiyama T. Wnt/beta-catenin signaling [J]. Cytokine & Growth Factor Reviews, 2000, 11(4): 273—282

[11]Fagotto F, Gumbiner B M. Beta-catenin localization during Xenopus embryogenesis: accumulation at tissue and somite boundaries [J]. Development, 1994, 120(12): 3667—3679

[12]Martin B, Schneider R, Janetzky S, et al. The LIM-only protein FHL2 interacts with β-catenin and promotes differentiation of mouse myoblasts [J]. Journal of Cell Biology, 2002, 159(1): 113—122

[13]Kuure S, Popsueva A, Jakobson M, et al. Glycogen synthase kinase-3 inactivation and stabilization of beta-catenin induce nephron differentiation in isolated mouse and rat kidney mesenchymes [J]. Journal of the American Society of Nephrology, 2007, 18(4): 1130—1139

[14]Riggleman B, Wieschaus E, Schedl P. Molecular analysis of the armadillo locus: uniformly distributed transcripts and a protein with novel internal repeats are associated with a Drosophila segment polarity gene [J]. Genes & Development, 1989, 3(1): 96—113

[15]Helmbrecht K, Kispert A, Von W R, et al. Identification of a Wnt/beta-catenin signaling pathway in human thyroid cells [J]. Endocrinology, 2001, 142(12): 5261—5266

[16]Wu F R. Moleeular cloning, expression and characterization of several genes (Rspo1, β-catenin and TSP-1)involved in ovarian differentiation and development in Tilapia [D]. Southwest University. 2010 [吳風(fēng)瑞. 羅非魚卵巢分化和發(fā)育相關(guān)基因Rspo1、β-catenin和TSP-1的克隆、表達(dá)和功能鑒定. 西南大學(xué). 2010]

[17]Maatouk D M, Dinapoli L, Alvers A, et al. Stabilization of β-catenin in XY gonads causes male-to-female sex-reversal [J]. Human Molecular Genetics, 2008, 17(19): 2949—2955

THE STRUCTURAL FEATURE AND EXPRESSION ANALISIS OF HSβ-CATENIN cDNA AND PROTEIN FROM HYRIOPSIS SCHLEGELII

YAN Han-Xiao, SHI Jian-Wu, SHENG Jun-Qing, WANG Jun-Hua and Hong Yi-Jiang
(The College of Life Science, Nanchang University, Nanchang 330000, China)

In order to explore the mechanism of sexual development of freshwater shellfish, we established a gonadal transcriptome of Hyriopsis schlegelii. Based on the transcriptome library, this study investigated the β-catenin. The fulllength cDNA was cloned by RACE PCR, which named Hsβ-catenin. The full length of Hsβ-catenin cDNA was 4386 bp that contained an open reading frame (ORF) of 2466 bp coding a protein of 821 amino acids. The protein was mainly composed of 12 ARM repeat sequences. In the secondary structure, the α-helix accounted for 47.75% and the β-folding accounted for 1.22% were predicted. The tertiary structure had many α-helixs, namely ARM domain. Hsβ-catenin gene was clustered with homologous genes from soft animal in the phylogenetic tree. Hsβ-catenin expressed highly in intestine and modestlyin foot and testis. The expression level of Hsβ-catenin was high at the age of 12-month-old (gender differentiation) and 36-month-old (gonad mature), indicated that it might be involved in sexual development.

Hyriopsis schlegelii; Hsβ-catenin; Tissue expression; Clone; Sequence analysis; qRT-PCR

Q344+1

A

1000-3207(2017)05-0972-05

10.7541/2017.121

2016-10-19;

2017-01-14

國家自然科學(xué)基金(31660337); 江西省教育廳項(xiàng)目(GJJ150166)資助 [Supported by the National Natural Science Foundation of China (31660337); the Fund Project of Jiangxi Provincial Education Department (GJJ150166)]

閆含笑(1993—), 女, 山東臨沂人; 碩士研究生; 主要研究方向?yàn)樗飳W(xué)。E-mail: yanhanxiao1993@163.com

洪一江(1963—), 教授; 主要研究方向?yàn)樗a(chǎn)動(dòng)物細(xì)胞與遺傳育種。E-mail: yjhong2008@163.com