放射性碘化氟維司群對(duì)激素依賴性人乳腺癌治療作用研究

印國兵,曾 斌,劉 瑛,孫 璐

(1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院乳甲胰外科 400010；2.重慶醫(yī)科大學(xué)研究生院 400010)

放射性碘化氟維司群對(duì)激素依賴性人乳腺癌治療作用研究

印國兵1,曾 斌2△,劉 瑛2,孫 璐2

(1.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院乳甲胰外科 400010；2.重慶醫(yī)科大學(xué)研究生院 400010)

目的 探明碘化氟維司群對(duì)人乳腺癌細(xì)胞的生長抑制作用及對(duì)裸鼠重要臟器的影響。方法 明確碘化氟維司群對(duì)MCF-7細(xì)胞和MDA-MB-231細(xì)胞殺傷作用的不同；建立MCF-7細(xì)胞裸鼠移植瘤模型，采用不同方式給藥，觀察腫瘤、肝腎等重要臟器的情況。結(jié)果 MTT實(shí)驗(yàn)表明碘化氟維司群對(duì)MCF-7細(xì)胞和MDA-MB-231細(xì)胞具有相似的細(xì)胞毒作用，但前者稍強(qiáng)于后者，一過性接觸實(shí)驗(yàn)表明碘化氟維司群能夠與MCF-7細(xì)胞結(jié)合繼續(xù)發(fā)揮腫瘤抑制效應(yīng)，而在MDA-MB-231細(xì)胞則不然(P<0.05)；經(jīng)尾靜脈注射碘化氟維司群后，腫瘤部位有放射性濃聚，占到注射總量的(4.33±0.28)%，瘤體先縮小后增大，血液中的放射性占到注射總量的(20.76±2.54)%，肝腎等臟器也有放射性分布，其分布符合雌激素受體分布狀況；瘤體局部注射顯示強(qiáng)大的腫瘤殺傷作用，放射性分布基本局限于瘤體區(qū)域。結(jié)論 碘化氟維司群對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞有良好的抑制作用，是放療和內(nèi)分泌治療作用的疊加，且對(duì)裸鼠的一般狀況及重要臟器的影響是可控的。

碘化氟維司群;乳腺腫瘤;MCF-7;MDA-MB-23;腫瘤移植;生長抑制

乳腺癌大部分屬于激素依賴性腫瘤，體內(nèi)雌激素可特異性地與雌激素受體(estrogen receptors，ER)結(jié)合，通過受體后效應(yīng)對(duì)腫瘤細(xì)胞起抑制作用，具有高度的特異性。氟維司群是一種類固醇抗雌激素藥物，臨床上作為一類ER拮抗劑廣泛用于乳腺癌的治療，能較大程度地延緩腫瘤的生長，對(duì)于ER陽性晚期乳腺癌患者具有良好療效。131I主要依靠β射線發(fā)揮放射治療作用，射程以毫米計(jì)，對(duì)周圍組織的損傷小，若將具有放療作用的131I標(biāo)記到氟維司群分子上，其將與乳腺癌細(xì)胞ER結(jié)合，就可能實(shí)現(xiàn)131I對(duì)乳腺癌的靶向治療，而且是內(nèi)分泌治療和放射治療的結(jié)合，極有可能產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)，從而為乳腺癌治療提供新的方向。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株、裸鼠和主要試劑及其配制 MCF-7細(xì)胞和MDA-MB-231細(xì)胞(中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫)；21 d齡雌性BALB/C裸鼠(重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)；碘化氟維司群[1](131I-fulvestrant)采用改良氯胺T法于室溫、pH值7.5、反應(yīng)時(shí)間為5 min的條件下合成，于反應(yīng)體系中加入4 ℃冰雙蒸水促其析出為乳濁液，20 000 r/min 4 ℃低溫離心獲取沉淀，50 ℃烘干后精密稱質(zhì)量，以96%無水乙醇加4%二甲基亞砜(DMSO)溶解，放射比活度不低于10 μCi/μL；RMPI-1640培養(yǎng)液、無血清培養(yǎng)液(Hyclon公司)。

1.2 主要儀器設(shè)備 臺(tái)式離心機(jī)(KA-1000/TGL-16G，國產(chǎn))；恒溫烤箱(MIR160，日本)；真空干燥器(CHRIST/ALPHA1-2，德國)；微型旋渦混和器(VXH-3，上海)；放射性活度探測器(RM905a，北京)；紫外分光光度計(jì)(UV-265型，日本)。

表1 不同劑量碘化氟維司群對(duì)A、C組MCF-7細(xì)胞在不同時(shí)間點(diǎn)的抑制作用值，n=3)

表2 不同劑量碘化氟維司群對(duì)B、D組MDA-MB-231細(xì)胞在不同時(shí)間點(diǎn)的抑制作用值，n=3)

1.4 人乳腺癌MCF-7細(xì)胞裸鼠移植瘤的建立[2-3]MCF-7細(xì)胞制成2×106個(gè)/mL單細(xì)胞懸液，于21 d齡BALB/C雌性裸鼠右肩皮下注射0.5 mL，飼養(yǎng)于清潔級(jí)屏障系統(tǒng)內(nèi)設(shè)的獨(dú)立通氣籠具。

1.5 尾靜脈注射碘化氟維司群后核素在體內(nèi)分布及對(duì)移植瘤、各臟器的影響。

1.5.1 荷瘤裸鼠全身發(fā)射型計(jì)算機(jī)斷層(ECT)顯像及各主要臟器離體檢查放射性活度 經(jīng)尾靜脈注射碘化氟維司群 200 μCi(0.1 mL)，1 h后全身麻醉后行ECT掃描，檢測時(shí)間為300 s。2 h后先摘除眼球取血1 mL，然后處死裸鼠，即刻取出重要臟器稱質(zhì)量，上機(jī)檢測血液及各臟器放射強(qiáng)度。

1.5.2 尾靜脈注射碘化氟維司群后移植瘤的變化及各臟器的影響 9只荷瘤裸鼠分為3組，經(jīng)體表測量皮下移植瘤體積(長×寬×高)后，A、B、C 3組分別經(jīng)尾靜脈注射溶于含67%乙醇的碘化氟維司群200 μCi(約50 μL)、400 μCi(約100 μL)、100 μL 67%乙醇，每周測量腫瘤體積1次，并每天觀察裸鼠一般狀況，4周后處死，取重要臟器行蘇木素-伊紅(HE)染色，光鏡下觀察。

1.6 瘤體注射碘化氟維司群后移植瘤的變化 3只荷瘤裸鼠，經(jīng)瘤體內(nèi)及瘤體基底部多點(diǎn)注射碘化氟維司群200 μCi，24 h麻醉后行ECT掃描，1周后觀察腫瘤變化。

2 結(jié) 果

2.1 MTT法檢測不同濃度碘化氟維司群對(duì)人腺癌細(xì)胞的抑制作用 A組中各兩兩比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，抑制作用明顯，見表1；B組中各兩兩比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2；B組與A組同等條件下的值相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；C組抑制作用弱于碘化氟維司群持續(xù)存在的A組;D組作用1 h后碘化氟維司群與MDA-MB-231細(xì)胞脫離接觸，中斷放射性損傷，各組生長抑制作用變得微弱，與B組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1.4.1 qRT-PCR檢測全血中Tim-3、TGF-β、Smad3、Smad7、Foxp3 mRNA的表達(dá)

2.2 動(dòng)物模型的建立 15只需建立移植瘤模型的裸鼠，14只在接種后4～6周成功長出移植瘤，一次成功率為93.33%，1只未長出，復(fù)種2×106個(gè)/mL MCF-7細(xì)胞后4周亦成功長出移植瘤。直徑1 cm左右時(shí)即可用于實(shí)驗(yàn)。

2.3 經(jīng)尾靜脈注射碘化氟維司群后核素在體內(nèi)的分布狀況 碘化氟維司群注射入裸鼠體內(nèi)后2 h，核素在血液中的量最大，達(dá)到總放射劑量的(20.76±2.54)%，其余臟器占比均較低，見表3。

2.4 荷瘤裸鼠全身ECT顯像 可見腫瘤核素顯像，但胸腹部臟器顯像亦明顯，甲狀腺顯像不明顯，見圖1。

2.5 經(jīng)尾靜脈注射碘化氟維司群后移植瘤的變化及其對(duì)各臟器的影響 A組腫瘤體積在兩周內(nèi)逐步縮小，但第3周開始恢復(fù)增大趨勢；B組前3周均逐步縮小，第4周恢復(fù)增大；C組則維持持續(xù)增大的趨勢,兩兩比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表4。

2.6 一般狀況及主要臟器光鏡下的形態(tài)學(xué)變化 各組裸鼠均能耐受尾靜脈注射干預(yù)因子的作用，未出現(xiàn)死亡；A、B組給藥次日開始有食欲缺乏、少動(dòng)表現(xiàn)，持續(xù)約3 d后恢復(fù)正常；C組無明顯異常表現(xiàn)。給藥4周通過對(duì)移植瘤和臟器HE染色的觀察顯示，肝、肺、腎、甲狀腺、心、小腸等組織均未出現(xiàn)明顯損傷，而腫瘤組織則表現(xiàn)出細(xì)胞壞死。

2.7 瘤體注射碘化氟維司群后移植瘤的變化和核素顯像結(jié)果

2.7.1 移植瘤的變化 瘤體局部注射碘化氟維司群后，3只裸鼠一般狀況無明顯改變，顯示良好的耐受性，MCF-7細(xì)胞移植瘤均出現(xiàn)大面積壞死，顯示碘化氟維司群對(duì)裸鼠移植瘤的強(qiáng)大殺傷作用。給藥后72 h處死裸鼠，取腫瘤組織行HE染色觀察，可見大面積腫瘤細(xì)胞核消失，并失去細(xì)胞形態(tài)，成為無定形的均勻紅染組織，但在鄰近正常組織處尚可查見少數(shù)殘存的MCF-7細(xì)胞。

表3 各主要組織器官放射性活度(離體)測量值

圖1 荷瘤裸鼠全身ECT顯像

表4 各組干預(yù)后腫瘤體積隨時(shí)間(周)變化

a:P<0.05，兩兩比較

2.7.2 瘤體局部注射后ECT全身掃描結(jié)果 可見核素基本局限在腫瘤部位，未向全身其他部位擴(kuò)散，見圖2。

圖2 瘤體局部注射碘華氟維司群的ECT全身掃描結(jié)果

3 討 論

ER是預(yù)測乳腺癌內(nèi)分泌治療反應(yīng)和判斷乳癌預(yù)后一個(gè)重要標(biāo)志，陽性者內(nèi)分泌治療反應(yīng)和預(yù)后均好于陰性者[4]。多項(xiàng)研究表明，MCF-7細(xì)胞ER-α呈現(xiàn)過度表達(dá)或可誘導(dǎo)過度表達(dá)[5-8]。

鈉碘同向轉(zhuǎn)運(yùn)體(NIS)利用細(xì)胞跨膜鈉離子濃度梯度作為驅(qū)動(dòng)力將碘轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)[9-11]，而乳腺癌細(xì)胞能表達(dá)NIS[12]，因此為碘放射治療乳腺癌提供新的可能。

MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)在碘化氟維司群作用下，兩種乳癌細(xì)胞均受到生長抑制，一過性接觸實(shí)驗(yàn)表明兩種乳腺癌細(xì)胞生長抑制作用均減弱，MCF-7細(xì)胞的生長抑制仍然明顯強(qiáng)于MDA-MB-231細(xì)胞，推測為不論ER-α表達(dá)的情況如何，只要培養(yǎng)環(huán)境中存在一定劑量的放射性，則MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞均會(huì)受到放射損傷，表現(xiàn)生長抑制，當(dāng)去除了培養(yǎng)液中的放射性物質(zhì)后，MDA-MB-231細(xì)胞因無攝取碘化氟維司群的能力而完全脫離放射環(huán)境，但MCF-7細(xì)胞以其ER與碘化氟維司群的特異結(jié)合，從而繼續(xù)承受放射損傷，其對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用是放射治療與內(nèi)分泌治療的疊加效應(yīng)。

MCF-7細(xì)胞ER-α呈現(xiàn)過表達(dá)[5-8]，同時(shí)，ER-α呈現(xiàn)全身廣泛分布的特點(diǎn)[13-15]。氟維司群不良反應(yīng)少，因而被視為乳腺癌內(nèi)分泌治療的“純拮抗劑”，甚至有報(bào)道稱其能下調(diào)ER的表達(dá)，潛在機(jī)制尚不清楚[16-18]。

靜脈注射碘化氟維司群后，裸鼠移植瘤的生長表現(xiàn)先抑制后恢復(fù)增長的趨勢，推測抑制作用是由于碘化氟維司群的放療和內(nèi)分泌治療雙重作用的結(jié)果；后期的恢復(fù)增長與藥物在體內(nèi)的濃度下降有關(guān)，包括放射性碘的衰變和氟維司群的生物代謝兩方面。荷瘤裸鼠早期表現(xiàn)納差、少動(dòng)，腫瘤有生長抑制表現(xiàn)且鏡下可觀察到腫瘤組織壞死，但對(duì)各臟器的形態(tài)學(xué)檢查未發(fā)現(xiàn)明顯臟器損傷。推測原因在于腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞對(duì)射線的敏感程度不同，腫瘤細(xì)胞更易遭受放射損傷，且損傷修復(fù)能力不如正常組織細(xì)胞。

瘤體局部注射碘化氟維司群后腫瘤大面積壞死，僅臨近正常組織處可查見少許殘留癌灶，ECT掃描顯示核素集中于腫瘤部位，未向全身擴(kuò)散。推測由于碘化氟維司群維持了氟維司群水溶性差的特性，局部注射后，碘化氟維司群在局部析出成為結(jié)晶，造成局部高放射劑量的環(huán)境，可充分發(fā)揮其放射性殺滅腫瘤細(xì)胞的作用；另外，結(jié)晶體雖然不能進(jìn)入血液循環(huán)，但其在組織間隙發(fā)生物理位置變遷仍有可能，因而能夠在更大的局部范圍內(nèi)發(fā)揮抗癌作用。

綜上，碘化氟維司群對(duì)雌激素依賴性人乳腺癌細(xì)胞具有良好的生長抑制作用，其作用機(jī)制包括：(1)碘化氟維司群攜帶的131I對(duì)MCF-7細(xì)胞的放射性損傷；(2)碘化氟維司群與ER結(jié)合，阻斷雌激素對(duì)MCF-7細(xì)胞的支持作用；(3)碘化氟維司群下調(diào)ER的表達(dá)。因而，筆者認(rèn)為放射性碘化氟維司群可能成為臨床治療雌激素依賴性乳腺癌的一個(gè)新藥，是放射治療與內(nèi)分泌治療的協(xié)同治療手段。

[1]印國兵，劉長安．以氟維司群為載體的放射性碘對(duì)激素依賴性乳腺癌治療作用研究[D]．重慶：重慶醫(yī)科大學(xué)，2012．

[2]Wang L,Mi C,Wang W.Establishment of lymph node metastasis of MDA-MB-231 breast cancer model in nude mice.[J].Zhonghua Yi Xue Za Zhi,2015,95(23):1862-1865.

[3]Nofiele JT,Cheng HL.Establishment of a Lung metastatic breast tumor xenograft model in nude rats[J].PLoS One,2014,9(5):e97950-97950.

[4]Giacinti L,Giacinti C,Gabellini C,et al.Scriptaid effects on breast cancer cell lines[J].J Cell Physiol,2012,227(10):3426-3433.

[5]Liu L,Ma H,Tang Y,et al.Discovery of estrogen receptor α modulators from natural compounds in Si-Wu-Tang series decoctions using estrogen-responsive MCF-7 breast cancer cells[J].Bioorg Med Chem Lett,2012,22(1):154-163.

[6]Ko YM,Wu TY,Wu YC,et al.Annonacin induces cell cycle-dependent growth arrest and apoptosis in estrogen receptor-α-related pathways in MCF-7 cells[J].J Ethnopharmacol,2011,137(3):1283-1290.

[7]Mendoza RA,Enriquez MI,Mejia SM,et al.Interactions between IGF-I,estrogen receptor-α (ERα),and ERβ in regulating growth/apoptosis of MCF-7 human breast cancer cells[J].J Endocrinol,2011,208(1):1-9.

[8]Hong W,Chen L,Li J,et al.Inhibition of MAP kinase promotes the recruitment of corepressor SMRT by tamoxifen-bound estrogen receptor alpha and potentates tamoxifen action in MCF-7 cells[J].Biochem Biophys Res Commun,2010,396(2):299-303.

[9]Renier C,Do J,Reynaneyra A,et al.Regression of experimental NIS-expressing breast cancer brain metastases in response to radioiodide/gemcitabine dual therapy[J].Oncotarget,2016,7(34):54811-54824.

[10]Chatterjee S,Thaker N,De A.Combined 2-deoxy glucose and metformin improves therapeutic efficacy of sodium-iodide symporter-mediated targeted radioiodine therapy in breast cancer cells[J].Breast Cancer,2015,7:251-265.

[11]Poole VL,Mccabe CJ.Iodide transport and breast cancer[J].J Endocrinol,2015,227(1):R1-12.

[12]Kelkar MG,Senthilkumar K,Jadhav S,et al.Enhancement of human Sodium iodide symporter gene therapy for breast cancer by HDAC inhibitor mediated transcriptional modulation[J].Sci Rep,2016,6(18):19341.

[13]Jan KC,Ku KL,Chu YH,et al.Tissue distribution and elimination of estrogenic and anti-inflammatory catechol metabolites from sesaminol triglucoside in rats[J].J Agric Food Chem,2010,58(13):7693-7700.

[14]Younes M,Honma N.Estrogen receptor β[J].Arch Pathol Lab Med,2011,135(1):63-66.

[15]Ur Rahman MS,Cao J.Estrogen receptors in gastric cancer:Advances and perspectives[J].World J Gastroenterol,2016,22(8):2475-2482.

[16]James R,Thriveni K,Krishnamoorthy L,et al.Clinical outcome of adjuvant endocrine treatment according to Her-2/neu status in breast cancer [J].Indian J Med Res，2011,133(1):70-75.

[17]Mishra AK,Abrahamsson A,Dabrosin C.Fulvestrant inhibits growth of triple negative breast cancer and synergizes with tamoxifen in ERa positive breast cancer by up-regulation of ERβ [J].Oncotarget,2016,7(35):56876-56888.

[18]Fernandes SA,Gomes GR,Siu ER,et al.The anti-oestrogen fulvestrant (ICI 182,780) reduces the androgen receptor expression,ERK1/2 phosphorylation and cell proliferation in the rat ventral prostate[J].Int J Androl,2011,34(5 Pt 1):486-500.

The growth inhibition effect of131I-fulvestrant on the human breast cancer cells*

YinGuobing1,ZengBin2△,LiuYing2,SunLu2

(1.DepartmentofBreast,ThyroidPancreaticSurgery,theSecondAffiliatedHospitalofChongqingMedicalUniversity,Chongqing400010,China;2.GraduateSchoolofChongqingMedicalUniversity,Chongqing400010,China)

Objective To elucidate the inhibitory effect of131I-fulvestrant on the growth of human breast cancer cells and the effect on the important organs.Methods MTT assay was used to clarify the difference in killing effects of the131I-fulvestranton on MCF-7 cells and MDA-MB-231 cells.Breast cancer MCF-7 cell xenografts in nude mice was establishied,and two different administration methods of the131I-fulvestrant in the MCF-7 cell to nude mice were given respectively.Organs and tumours of nude mice were observed.Results MTT assay demonstrated that131I-fulvestrant had similar cytotoxicity against MCF-7 cells and MDA-MB-231 cells,and the former was slightly stronger.Transient contact experiments showed that131I-fulvestrant could play a tumor suppressor effect on MCF-7 cells continually,but MDA-MB-231 cells wasn′t.After the injection of131I-fulvestrant via caudal vein,the radioactivity concentration on tumor site accounted for (4.33±0.28)% of the total injection,and the volume of the tumor reduced before gradually increasing again.Radioactivity in the blood accounted for (20.76±2.54)% of the total injection.Qrgans like liver and kidney also showed radioaction distribution.Its distribution was accorded with the distribution of estrogen receptor.Local injection of131I-fulvestrant got powerful killing effect on the tumor,and the distribution of the radioaction was mainly confined within the tumor.Conclusion131I-fulvestrant has a good inhibitory effect on MCF-7 breast cancer cells,which is a superposition of radiotherapy and endocrine therapy,and it is controllable on the general condition and important organs of nude mice.

131I-fulvestrant;breast neoplasms;MCF-7;MDA-MB-23;neoplasm transplantation;growth inhibition

重慶市自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(cstc2012jjA10042)；重慶市衛(wèi)生局科研基金資助項(xiàng)目(2011-2-175)。

印國兵(1974-)，副主任醫(yī)師，博士，主要從事乳腺甲狀腺腫瘤治療研究。

△通信作者，E-mail:719501555@qq.com。

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.23.002

R73.33，R73.36

A

1671-8348(2017)23-3173-04

2017-03-18

2017-04-26)

·論 著·