小鼠pMSV-Slfn5-GFP 表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建及基因結(jié)構(gòu)分析*

況春燕,楊 藩

(1.貴州省人民醫(yī)院心內(nèi)科，貴陽(yáng) 550002； 2.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院/陜西省干細(xì)胞工程技術(shù)研究中心，陜西楊凌 712100)

論著·基礎(chǔ)研究

小鼠pMSV-Slfn5-GFP 表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建及基因結(jié)構(gòu)分析*

況春燕1,楊 藩2

(1.貴州省人民醫(yī)院心內(nèi)科，貴陽(yáng) 550002； 2.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院/陜西省干細(xì)胞工程技術(shù)研究中心，陜西楊凌 712100)

目的 構(gòu)建小鼠pMSV-Slfn5-GFP 基因重組表達(dá)質(zhì)粒及基因結(jié)構(gòu)分析。方法 提取小鼠肝臟組織中總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。PCR擴(kuò)增小鼠Slfn5編碼序列片段,并與pGEM-T Easy載體連接,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸埃希菌DH5α中。挑取陽(yáng)性克隆提取質(zhì)粒，經(jīng)限制性內(nèi)切酶HpaⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定。酶切鑒定正確的質(zhì)粒送Macrogen USA測(cè)序。測(cè)序正確的質(zhì)粒通過(guò)HindⅢ和XhoⅠ與pMSV-GFP連接,并命名為pMSV-Slfn5-GFP。通過(guò)UCSC(http://genome.ucsc.Edu/) 分析小鼠Slfn5及其家族基因組結(jié)構(gòu)，并通過(guò)NCBI確定Slfn5的蛋白結(jié)構(gòu)域。結(jié)果 Slfn5全長(zhǎng)基因序列克隆到表達(dá)載體pMSV-GFP中，酶切鑒定片段大小為2.65 kb。Slfn5的AAA_4蛋白結(jié)構(gòu)域由phylogeny.fr確定了該結(jié)構(gòu)在Slfn蛋白家族中的保守性。結(jié)論 成功構(gòu)建了小鼠pMSV-Slfn5-GFP全長(zhǎng)基因表達(dá)載體。

pMSV-Slfn5-GFP；構(gòu)建；基因結(jié)構(gòu)；分析

睡眠因子(Schlafen,Slfn)基因家族是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的一類新的細(xì)胞周期調(diào)節(jié)基因，該家族基因在小鼠中由10個(gè)成員組成(Slfn1、1L、2、3、4、5、8、9、10和14)[1-2]。Slfn5 是Slfn家族第三組的成員之一，它可影響多種細(xì)胞的生物學(xué)行為，但在不同的細(xì)胞中，其作用不同：(1)在NIH 3T3成纖維細(xì)胞中，通過(guò)異源性過(guò)表達(dá)Slfn5基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)并未受到影響[3]；(2)在人類惡性黑色素瘤細(xì)胞中，通過(guò)基因干擾的方法沉默Slfn5的表達(dá)，結(jié)果顯示其有雙重的作用，不僅促進(jìn)惡性黑色素瘤細(xì)胞的不依賴支持物的生長(zhǎng)和克隆形成能力，而且還增強(qiáng)該細(xì)胞在三維膠原中的侵襲能力[4]；筆者的前期研究，分離培養(yǎng)5～7 d的大鼠骨髓源性內(nèi)皮祖細(xì)胞，通過(guò)RT-PCR檢測(cè)Slfn5基因的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在EPCs細(xì)胞有Slfn5基因的表達(dá)，是否 Slfn5基因影響內(nèi)皮祖細(xì)胞的功能，目前仍不清楚。為了研究Slfn5基因?qū)?nèi)皮祖細(xì)胞功能的影響，需要構(gòu)建Slfn5基因的表達(dá)載體，本文獲得小鼠Slfn5全長(zhǎng)基因表達(dá)質(zhì)粒并對(duì)其基因的結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，為進(jìn)一步探討其在內(nèi)皮祖細(xì)胞的生物學(xué)作用打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料 大腸埃希菌DH5α，質(zhì)粒pMSV-GFP、反轉(zhuǎn)錄病毒包裝細(xì)胞Plat-E、小鼠293細(xì)胞由西奈山醫(yī)學(xué)院遺傳系實(shí)驗(yàn)室提供。載體pGEM-T Easy均購(gòu)自Promega公司?？俁NA提取試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、凝膠回收試劑盒、DNA marker均購(gòu)自天根公司；限制性內(nèi)切酶、T4 DNA 連接酶、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和Taq 聚合酶均購(gòu)自Fermentas公司；高保真DNA聚合(PhantaTMHS Super-Fidelity DNA Polymerase)購(gòu)自Vazyme公司；定量PCR Mix (Power 2×SYBR Real-time PCR Premixture)購(gòu)自Bioteke公司；脂質(zhì)體 (Lipofectamine 2000)、Opti-MEM和DMEM培養(yǎng)基均購(gòu)自Invitrogen公司；非必需氨基酸 (NEAA)、L-谷氨酰胺 (L-Glu)、β-巰基乙醇 (β-ME) 購(gòu)自Gibco 公司；胎牛血清(FBS) 購(gòu)自Hyclone公司；PCR 引物由美國(guó)Macrogen公司合成。

1.2 方法

1.2.1 Slfn5編碼序列的克隆與載體構(gòu)建 參照天根的血液/細(xì)胞/組織基因組RNA提取試劑盒從小鼠肝臟組織中提取總RNA。從NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) 中下載小鼠Slfn5編碼序列(CDS)并設(shè)計(jì)帶有酶切位點(diǎn)HpaⅠ和XhoⅠ的上下游引物,引物序列為Slfn5-xho1-F CCG CTC GAG ATG AGT TTC CTG GAG GAT TTG G;Slfn5-hpa1-R AGT TAA CTG GCA TCT TCC TAT CAA AAC ACA,并擴(kuò)增2.7 kb CDS片段。產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒進(jìn)行回收，并與pGEM-T Easy載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸埃希菌DH5α中。挑取陽(yáng)性克隆提取質(zhì)粒，經(jīng)限制性內(nèi)切酶HpaⅠ和XhoⅠ雙酶切鑒定。酶切鑒定正確的質(zhì)粒送美國(guó)Macrogen公司測(cè)序。測(cè)序正確的質(zhì)粒通過(guò)HindⅢ和XhoⅠ與pMSV-GFP連接,并命名為pMSV-Slfn5-GFP。引物序列為Slfn5-xho1-F CCG CTC GAG ATG AGT TTC CTG GAG GAT TTG G;Slfn5-hpa1-R AGT TAA CTG GCA TCT TCC TAT CAA AAC ACA。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)與感染 Plat-E和293細(xì)胞用含有10% FBS的DMEM培養(yǎng)液，在37 ℃、含有5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。按照Lipofectine 2000使用說(shuō)明書，首先將pMSV-Slfn5-GFP 轉(zhuǎn)入Plat-E細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后18 h在換成新鮮培養(yǎng)液。并在轉(zhuǎn)染后48、72、96 h收取細(xì)胞培養(yǎng)液中上清液存放于4 ℃冰箱中。將收集的培養(yǎng)液上清液用45 nm的濾器過(guò)濾并按照上清液與細(xì)胞培養(yǎng)液1∶1的比例感染小鼠內(nèi)皮祖細(xì)胞，并在感染12 h后換液。為了提高感染效率將在換液后12 h進(jìn)行第2次感染并換液。

1.2.3 熒光定量PCR 按照天根總RNA提取試劑盒說(shuō)明書提取組織總RNA，按照RevertAidTMFrist Strand cDNA Synthesis Kit 相關(guān)說(shuō)明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，并設(shè)計(jì)qSlfn和qGAPDH引物。熒光定量PCR 反應(yīng)體系如下：2×SYBR Green Mix 10 μL，25 mmol/L dNTPs 1 μL，上、下游引物各0.5 μL (10 pmol/L)，模板 cDNA 1 μL，去離子水7 μL，共20 μL。每個(gè)樣本設(shè)3個(gè)重復(fù)。反應(yīng)條件為：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)；95 ℃ 5 s，60 ℃退火階段收集熒光信號(hào)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列Slfn5-xho1-F CCG CTC GAG ATG AGT TTC CTG GAG GAT TTG G;Slfn5-hpa1-R AGT TAA CTG GCA TCT TCC TAT CAA AAC ACA。

1.2.4 小鼠Slfn5編碼序列克隆及生物學(xué)分析 本研究通過(guò)UCSC(http://genome.ucsc.edu/)分析小鼠Slfn5及其家族基因組結(jié)構(gòu)，并通過(guò)NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)確定Slfn5的AAA_4蛋白結(jié)構(gòu)域。

2 結(jié) 果

2.1 Slfn基因簇結(jié)構(gòu)分析 通過(guò)對(duì)小鼠Slfn家族基因在基因組中的定位分析發(fā)現(xiàn)，10個(gè)Slfn基因成簇分布于11Qc,且長(zhǎng)度約為1 mbp(82.95～83.30 mbp)。這其中包含了2個(gè)非編碼基因Slfn5os和假基因Slfn10-ps。Slfn5os(Schlafen 5,opposite strand)是位于對(duì)應(yīng)鏈上的Slfn5序列， Slfn5位于Slfn5os下游(圖1A)。蛋白序列分析發(fā)現(xiàn)， Slfn5編碼884個(gè)氨基酸且含有4個(gè)保守的結(jié)構(gòu)域。其中的AAA-4結(jié)構(gòu)域位于第188和320氨基酸之間。該結(jié)構(gòu)域在Slfn家族中很保守(圖1B)。進(jìn)一步對(duì)Slfn家族全長(zhǎng)蛋白序列分析發(fā)現(xiàn)Slfn5蛋白與Slfn1、Slfn3、Slfn4和Slfn2同源性較高，但是與Slfn8和Slfn9差異較大。

A：Slfn相關(guān)基因在第11號(hào)染色體上的額定位。B：Slfn蛋白及AAA_4結(jié)構(gòu)域在Slfn家族蛋白中的同源比對(duì)

圖1 Slfn基因結(jié)構(gòu)分析

2.2 Slfn5組織表達(dá)分析 通過(guò)對(duì)小鼠序列表達(dá)標(biāo)簽(EST)分析發(fā)現(xiàn),小鼠Slfn5表達(dá)具有組織特異性。具體來(lái)說(shuō)神經(jīng)組織和腺體高表達(dá)Slfn5(圖2A)。通過(guò)設(shè)計(jì)針對(duì)Slfn5全序列的特異引物，成功從腺體組織中擴(kuò)增得到Slfn5(圖2B)。

A：Slfn5序列表達(dá)標(biāo)簽分布分析；B：Slfn5在腺體組織中的表達(dá)檢測(cè)(1、2表示腺體組織)

圖2 Slfn5組織表達(dá)分析

2.3 Slfn5表達(dá)載體構(gòu)建 將擴(kuò)增得到Slfn5通過(guò)酶切插入到pMSV-GFP逆轉(zhuǎn)錄病毒載體中(圖3A)。雙酶切鑒定發(fā)現(xiàn)成功地將2.65 kb的序列成功插入到了目標(biāo)載體(圖3B)。

A：Slfn5通過(guò)酶切插入到pMSV-GFP逆轉(zhuǎn)錄病毒載體中；B:雙酶切鑒定發(fā)現(xiàn)將2.65 kb的序列成功插入到目標(biāo)載體

圖3 pMSV-Slfn5-GFP表達(dá)載體構(gòu)建

2.4 Slfn5基因結(jié)構(gòu)分析 本研究通過(guò)UCSC(http://genome.ucsc.edu/)分析小鼠Slfn5及其家族基因組結(jié)構(gòu)，并通過(guò)NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) 確定了Slfn5的AAA_4蛋白結(jié)構(gòu)域由phylogeny.fr(http://www.phylogeny.fr/)確定了該結(jié)構(gòu)在Slfn蛋白家族中的保守性。

3 討 論

本研究有3個(gè)發(fā)現(xiàn)：(1)成功構(gòu)建小鼠Slfn5表達(dá)載體；(2)發(fā)現(xiàn)Slfn5在神經(jīng)組織及腺體組織中有高表達(dá)；(3)Slfn基因簇結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)Slfn5編碼884個(gè)氨基酸且含有4個(gè)保守的結(jié)構(gòu)域，其中Slfn5的AAA_4蛋白結(jié)構(gòu)域由phylogeny.fr確定了該結(jié)構(gòu)在Slfn蛋白家族中的保守性。

Slfn基因家族盡管包含了許多成員，但在不同的物種之間，各個(gè)成員的表達(dá)不同,其作用也不盡相同。是否Slfn家族在小鼠及人類有相同的功能或其功能有物種的專一性，目前仍不清楚。幾個(gè)小鼠的Slfn基因，包括Slfn1、Slfn2、Slfn3在細(xì)胞增殖和分化上發(fā)揮關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用[5-7],Slfn2在免疫細(xì)胞靜止?fàn)顟B(tài)下發(fā)揮重要作用[8]，而Slfn4參與髓細(xì)胞生成的調(diào)控[9]。Slfn5在小鼠及人類有表達(dá)[1-2]。人類Slfn5包含有一個(gè)RNA/DNA解鏈酶基序，而在Slfn組1成員中未見此結(jié)構(gòu)[10]。有研究報(bào)道，Slfn5在干擾素誘導(dǎo)下,在人類的黑色素瘤細(xì)胞及腎癌細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，并且負(fù)性調(diào)節(jié)人類惡性黑色素瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和侵襲能力[4],而在鼠類的惡性黑色素瘤細(xì)胞并無(wú)類似的作用[11]。此外，Slfn5參與腎癌細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)及侵襲能力的調(diào)控，并且Slfn5的表達(dá)與腎癌患者的存活呈正相關(guān)[12]。目前，Slfn5的組織表達(dá)特異性及其是否參與血管細(xì)胞的生物學(xué)行為的調(diào)控，目前均少見報(bào)道。

筆者的前期研究發(fā)現(xiàn)，Slfn5在小鼠的內(nèi)皮祖細(xì)胞有表達(dá)，為了研究Slfn5是否調(diào)節(jié)內(nèi)皮祖細(xì)胞的生物學(xué)行為，本研究設(shè)計(jì)構(gòu)建了小鼠Slfn5的表達(dá)載體。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)獲得小鼠Slfn5的全長(zhǎng)基因，為研究Slfn5在小鼠的功能提供新的可靠依據(jù)。本研究從小鼠肝臟組織中提取了總RNA，并將其進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA,并設(shè)計(jì)帶有酶切位點(diǎn)HpaⅠ和XhoⅠ的上下游引物,利用引物從cDNA中擴(kuò)增出Slfn5的全長(zhǎng)2.65 kb的基因序列，并與pGEM-T Easy載體連接，經(jīng)轉(zhuǎn)化到大腸埃希菌DH5α中形成克隆后，挑取陽(yáng)性克隆進(jìn)行雙酶切鑒定。鑒定正確的質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序,經(jīng)過(guò)測(cè)序發(fā)現(xiàn)得到的Slfn5與網(wǎng)上公布的序列NM_183201一致。測(cè)序正確的質(zhì)粒通過(guò)HindⅢ和XhoⅠ與pMSV-GFP連接,質(zhì)粒構(gòu)建成功。同時(shí),也通過(guò)UCSC(http://genome.ucsc.edu/)分析小鼠Slfn5及其家族基因組結(jié)構(gòu)，并通過(guò)NCBI分析Slfn5的AAA_4蛋白結(jié)構(gòu)域由phylogeny.fr(http://www.phylogeny.fr/)確定了該結(jié)構(gòu)在Slfn蛋白家族中的保守性。Slfn5組織表達(dá)分析。此外，還通過(guò)對(duì)小鼠EST分析發(fā)現(xiàn),小鼠Slfn5表達(dá)具有組織特異性,其在神經(jīng)組織及腺體組織高表達(dá)，通過(guò)設(shè)計(jì)Slfn5全序列的特異引物，成功從腺體組織中擴(kuò)增得到Slfn5。目前，國(guó)際上對(duì)Slfn5的作用研究極其有限，通過(guò)本實(shí)驗(yàn)獲得Slfn5的全長(zhǎng)基因系列，并對(duì)其結(jié)構(gòu)及其組織表達(dá)進(jìn)行分析，可為進(jìn)一步研究其在血管系統(tǒng)及神經(jīng)組織及腺體組織中的生物學(xué)效應(yīng)打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

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Construction of pMSV-Slfn5-GFP plasmid and analysis of gene structure in mice*

KuangChunyan1,YangFan2

(1.DepartmentofCardioloy,GuizhouProvincialPeople′sHospital,Guiyang,Guizhou550002,China;2.ShaanxiProvincialCenterforStemCellsEngineeringandTechnologyResearch,CollegeofVeterinaryMedicine,NorthwestAgricultureandForestScienceandTechnologyUniversity,Yangling,Shaanxi712100,China)

Objective To perform mouse pMSV-Slfn5-GFP gene recombinant expression plasmid construction and gene structure analysis.Methods Total RNA was extracted from mouse liver and turned into cDNA by reverse transcription.Mouse Slfn5 coding sequence (CDS) fragment was amplified by PCR and connected with the pGEM-T Easy vector.The connected product was transferred the E.coli DH5α.The positive clones were selected for extracting plasmid,which was identified by double enzyme of restriction endonucleaseHpaⅠ andXhoⅠ.Then correct plasmid identified by enzyme digestion was sequenced by Macrogen USA.Then correct plasmid by sequencing was connected with pMSV-GFP byHindⅢ andXboⅠ,which was named as pMSV-Slfn5-GF.UCSC (http://genome.ucsc.Edu /) was used to analyze mouse Slfn5 and its family genomic structure.Slfn5 protein structural domain was determined by NCBI.Results Slfn5 full-length gene sequence was cloned into the expression vector pMSV-GFP,the fragment size was about 2.65 kb by enzyme digestion identification.The conservatism of AAA_4 protein domain in Slfn5 protein family was determined by phylogeny.fr.Conclusion Mouse full-length gene pMSV-Slfn5-GFP expression vector is successfully constructed.

pMSV-Slfn5-GFP； construction； gene structure； analysis

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.22.003

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81560056)。 作者簡(jiǎn)介：況春燕(1976-)，副主任醫(yī)師，博士，主要從事冠心病，血管損傷和修復(fù)的研究。

Q331

A

1671-8348(2017)22-3033-03

2017-02-22

2017-04-10)