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    多西他賽對乳腺癌細(xì)胞中Cav-1表達(dá)及細(xì)胞增殖的影響

    2017-09-12 09:18:25尹良偉劉基巍
    關(guān)鍵詞:細(xì)胞株載體通路

    李 穎,尹良偉,劉基巍,劉 鵬

    (1. 大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 腫瘤一科, 遼寧 大連 116011;2. 大連醫(yī)科大學(xué)附屬大連市中心醫(yī)院 腫瘤內(nèi)科三病房, 遼寧 大連 116021)

    論 著

    多西他賽對乳腺癌細(xì)胞中Cav-1表達(dá)及細(xì)胞增殖的影響

    李 穎1,尹良偉2,劉基巍1,劉 鵬2

    (1. 大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 腫瘤一科, 遼寧 大連 116011;2. 大連醫(yī)科大學(xué)附屬大連市中心醫(yī)院 腫瘤內(nèi)科三病房, 遼寧 大連 116021)

    目的 研究多西他賽對乳腺癌細(xì)胞中Cav-1(Cav-1)表達(dá)及細(xì)胞增殖的影響。方法 通過Real-time PCR和Western-blot檢測不同濃度多西他賽作用下乳腺癌細(xì)胞MCF-7中Cav-1的表達(dá)情況;野生型MCF-7細(xì)胞株為對照組,通過基因轉(zhuǎn)染技術(shù)建立Cav-1 過表達(dá)的MCF-7細(xì)胞株(轉(zhuǎn)染組)及空載體的MCF-7細(xì)胞株(空載體組),利用CCK-8比色法分析多西他賽對各組細(xì)胞增殖的影響。通過Western-blot分別檢測多西他賽作用下各組細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白Bax和Bcl-2的表達(dá)情況以及PI3K/AKT 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活化情況。結(jié)果 在5~40 μg/mL濃度范圍內(nèi),隨著多西他賽作用濃度的增大,MCF-7細(xì)胞中Cav-1的蛋白表達(dá)量逐漸增加。不同濃度多西他賽對MCF-7細(xì)胞的增殖均有明顯的抑制作用;在同一濃度多西他賽作用下,轉(zhuǎn)染Cav-1組細(xì)胞的增殖抑制率明顯高于對照組和空載體組(P<0.01)。與對照組和空載體組相比,20 μg/mL多西他賽作用后轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中Bax的表達(dá)升高(P<0.01),而Bcl-2的表達(dá)降低(P<0.01),并且磷酸化AKT (p-AKT)蛋白的表達(dá)水平下降(P<0.01),而對照組和空載體組之間Bax、Bcl-2以及p-AKT蛋白的表達(dá)則無明顯差異(P>0.05)。結(jié)論 多西他賽可以通過促進(jìn)Cav-1的表達(dá)影響PI3K/AKT 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,進(jìn)而調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)抑制MCF-7 細(xì)胞的增殖。

    Cav-1;多西他賽;乳腺癌細(xì)胞;細(xì)胞增殖;基因治療

    多西他賽(Docetaxel)作為新一代人工半合成的紫杉類抗腫瘤藥物,目前已廣泛用于一線和二線局部晚期以及復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移乳腺癌的治療,明顯改善了乳腺癌的治療效果[1]。研究顯示,多西他賽作為有絲分裂抑制劑,還可以通過激活凋亡相關(guān)蛋白和通路,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,進(jìn)而起到抑制腫瘤的作用,但具體機(jī)制尚不清楚。

    窩蛋白-1(Cav-1)是胞膜窖(Caveolae)的主要結(jié)構(gòu)成分和標(biāo)志性結(jié)構(gòu)蛋白,不但在細(xì)胞膜組裝、細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)和囊泡運(yùn)輸?shù)确矫嫫鹬匾纳碜饔茫遗c腫瘤細(xì)胞的增殖轉(zhuǎn)化、侵襲轉(zhuǎn)移、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)以及多藥耐藥等密切有關(guān)[2-3]。近年來研究表明,Cav-1可作為抑癌因子負(fù)性調(diào)控乳腺癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移等相關(guān)信號通路的激活,是進(jìn)行乳腺癌基因治療理想的靶點(diǎn)之一。

    本實(shí)驗(yàn)通過研究多西他賽對乳腺癌細(xì)胞中Cav-1表達(dá)及細(xì)胞增殖的影響,并對其機(jī)制進(jìn)行初步探討,旨在了解基因治療與化療聯(lián)合應(yīng)用的特性以及臨床應(yīng)用的可能性,進(jìn)而為乳腺癌個體化治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

    1 材料和方法

    1.1 材 料

    人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。RPMI 1640培養(yǎng)基、胰酶和胎牛血清購自Gibco公司,G418購自美國Sigma公司。多西他賽為江蘇恒瑞制藥公司惠贈。Lipofectamin 2000和TRIzol試劑為Invitrogen 公司產(chǎn)品,PrimeScript RT reagent Kit和SYBR Premix Ex Taq II購自大連TaKaRa生物有限公司。兔抗人Cav-1、p-AKT 和 AKT 多克隆抗體購自美國 Abcam 公司,兔抗人Bcl-2和Bax多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司,兔抗人GAPDH多克隆抗體購自Bioworld公司,辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔 IgG購自北京中杉金橋生物公司,RIPA 強(qiáng)蛋白裂解液購自碧云天生物技術(shù)有限公司,ECL發(fā)光試劑盒購自美國 Pierce公司。CCK-8法細(xì)胞增殖檢測試劑盒購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-Cav-1及空載體pcDNA3.1由遼寧師范大學(xué)鄒偉教授惠贈。

    1.2 方 法

    1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

    MCF-7細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基中。取2×105個對數(shù)生長期的MCF-7細(xì)胞懸于2 mL完全培養(yǎng)液中,接種于6 孔板內(nèi),待細(xì)胞長至90%匯合時按照Lipofectamine 2000 說明書進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。將質(zhì)粒pcDNA3.1-Cav-1及其空載體pcDNA3.1轉(zhuǎn)染入MCF-7細(xì)胞后,經(jīng)800 μg/mL G418篩選4周,形成穩(wěn)定的細(xì)胞克隆,經(jīng)有限稀釋法獲取單克隆,然后進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng),利用Western-blot 檢測不同組細(xì)胞Cav-1的表達(dá)情況,得到穩(wěn)定過表達(dá)Cav-1以及空載體的MCF-7細(xì)胞株。野生型MCF-7細(xì)胞株為對照組,通過基因轉(zhuǎn)染技術(shù)建立Cav-1過表達(dá)的MCF-7細(xì)胞株(轉(zhuǎn)染組)及空載體的MCF-7細(xì)胞株(空載體組)。

    1.2.2 Real-time PCR

    利用TRIzol試劑和PrimeScript RT reagent試劑盒提取細(xì)胞總RNA,并將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA,在SYBR Premix Ex Taq II聚合酶的催化下進(jìn)行PCR反應(yīng)。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。Cav-1上游引物:5'-TGGTTTTACCGCTTGCTGTCT-3',下游引物:5'-GACACGGCTGATGCACTGAA-3';內(nèi)參照GAPDH上游引物:5'- AGAAGTATGACAACAGCCTCAAGATC - 3',下游引物:5'- CAGTCTTCTGGGTGGCAGTGA-3'。反應(yīng)條件為: 95 ℃ 3 min;95 ℃ 30 s, 60 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min ,共40 個循環(huán)。每組細(xì)胞設(shè)計(jì)3個重復(fù)孔,同時擴(kuò)增目的及內(nèi)參照基因。采用 2-ΔΔct法計(jì)算基因表達(dá)的相對變化。

    1.2.3 CCK-8分析

    將對數(shù)生長期的細(xì)胞按1×105/mL的密度接種于96孔板中,培養(yǎng)24 h后加入多西他賽至終濃度分別為5、10、20、40 μg/mL,每一濃度設(shè)5個復(fù)孔,另設(shè)陰性對照組和空白對照組,繼續(xù)培養(yǎng)24 h后更換100 μL新鮮培養(yǎng)基并加入CCK-8試劑10 μL,37 ℃孵育2 h后,全自動酶標(biāo)儀在450 nm波長處測定各孔光密度值(OD值),最后計(jì)算不同濃度多西他賽作用下各組細(xì)胞的增殖抑制率,繪制生長抑制曲線。細(xì)胞抑制率(%)=[1-(處理組平均OD值-空白對照組OD值)/(陰性對照組平均OD值-空白對照組OD值)]×100%。

    1.2.4 Western-blot

    用RIPA 強(qiáng)細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞總蛋白,BCA法測定蛋白濃度,經(jīng)濃度標(biāo)準(zhǔn)化后取 50 μg總蛋白,經(jīng)12 %聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后,濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)至PVDF膜上。5%脫脂奶粉室溫封閉 1 h,孵育一抗Cav-1(1∶1000)、p-AKT(1∶1000)、AKT(1∶1000)、Bcl-2(1∶500)、Bax(1∶ 500)、GAPDH(1∶1000),4 ℃過夜。 TBST洗膜后,加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶5000)室溫孵育 1 h。使用ECL化學(xué)發(fā)光試劑作用1~5 min后,放入AlphaEase FC凝膠成像系統(tǒng)內(nèi),曝光顯影,進(jìn)行圖片掃描與條帶灰度分析。

    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    2 結(jié) 果

    2.1 不同濃度多西他賽對乳腺癌細(xì)胞MCF-7中Cav-1表達(dá)的影響

    濃度為5、10、20、40 μg/mL多西他賽作用后的MCF-7細(xì)胞中Cav-1 mRNA的表達(dá)量分別是不加藥對照組的2.90±0.26,4.80±0.40,9.83±0.45和13.50±1.25倍。0、5、10、20、40 μg/mL多西他賽作用后的MCF-7細(xì)胞中Cav-1蛋白條帶的灰度值分別為:18.52×103±2.38×103,42.46×103±4.31×103,60.69×103±8.45×103,88.24×103±6.76×103,120.16×103± 9.25×103。在5~40 μg/mL濃度范圍內(nèi),隨著多西他賽作用濃度的增大,MCF-7細(xì)胞中Cav-1蛋白的表達(dá)量逐漸增加。見圖1。

    **與不加藥對照組比較,P<0.01圖1 多西他賽對MCF-7細(xì)胞中Cav-1表達(dá)的影響Fig 1 Effect of Docetaxel on Cav-1 expression in MCF-7 cells

    2.2 多西他賽對不同組MCF-7細(xì)胞增殖的影響

    CCK-8法檢測發(fā)現(xiàn),多西他賽對不同組MCF-7細(xì)胞的增殖均有明顯的抑制作用,轉(zhuǎn)染組作用最明顯(圖2)。在同一藥物濃度下,轉(zhuǎn)染組與對照組和空載體組相比,細(xì)胞增殖抑制率明顯增高(圖2,表1,P<0.01),而空載體組和對照組相比,抑制率則無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖2,表1,P>0.05)。

    表1 CCK-8法檢測不同濃度多西他賽對不同組MCF-7細(xì)胞的抑制率

    組別多西他賽(μg/mL) 5 10 20 40對照組6.37±0.5712.22±1.0027.17±1.6744.65±1.90轉(zhuǎn)染組12.32±1.591)22.25±1.911)46.76±1.911)65.04±2.551)空載體組6.89±0.8313.22±1.4429.2±1.7246.69±1.80

    1)與對照組和空載體組比較,P<0.01

    Control: 對照組; pcDNA3.1-cav-1:轉(zhuǎn)染組;Vector:空載體組。**與對照組和空載體組比較,P<0.01圖2 多西他賽對不同組MCF-7細(xì)胞增殖的影響Fig 2 Effect of Docetaxel on MCF-7 cells proliferation in different groups

    2.3 多西他賽對不同組MCF-7細(xì)胞中Bax和Bcl-2表達(dá)的影響

    用20 μg/mL多西他賽作用MCF-7細(xì)胞24 h后,利用Western-blot法檢測不同組MCF-7細(xì)胞中Bax和Bcl-2蛋白的表達(dá)情況。Bax蛋白條帶的灰度值分別為:不加藥對照組10.15×103±1.23×103,對照組+Docetaxel 42.53×103±4.61×103,轉(zhuǎn)染組+Docetaxel 82.58×103±6.76×103,空載體組+Docetaxel 48.76×103±8.60×103;Bcl-2蛋白條帶的灰度值分別為:不加藥對照組47.64×103±5.25×103,對照組+Docetaxel 21.76×103±3.22×103,轉(zhuǎn)染組+Docetaxel 6.52×103±0.41×103,空載體組+Docetaxel 18.93×103±5.38×103。與不加藥對照組相比,多西他賽作用后各組MCF-7細(xì)胞中Bax蛋白的表達(dá)增加,而Bcl-2蛋白的表達(dá)降低。多西他賽作用后轉(zhuǎn)染Cav-1的MCF-7細(xì)胞中Bax的表達(dá)水平明顯高于對照組和空載體組(P<0.01),而Bcl-2蛋白的表達(dá)水平則明顯低于對照組和空載體組(P<0.01)。對照組和空載體組之間Bax和Bcl-2蛋白的表達(dá)則無明顯差異(P>0.05)。見圖3。

    C: 對照組;C+D:對照組+Docetaxel; Cav-1+D:轉(zhuǎn)染組+Docetaxel; V+D:空載體組+Docetaxel圖3 多西他賽對不同組MCF-7細(xì)胞中Bax和Bcl-2表達(dá)的影響Fig 3 Effect of Docetaxel on Bax and Bcl-2 expression in three groups

    2.4 多西他賽對不同組MCF-7細(xì)胞中p-AKT表達(dá)的影響

    利用Western-blot法檢測20 μg/mL多西他賽作用24 h后,不同組MCF-7細(xì)胞中PI3K/AKT 信號通路的活化情況。p-AKT蛋白條帶的灰度值分別為:對照組72.13×103±6.82×103,對照組+Docetaxel 32.15×103±3.63×103,轉(zhuǎn)染組+Docetaxel 8.32×103±1.76×103,空載體組+Docetaxel 36.42×103±7.16×103。與不加藥對照組相比,多西他賽作用后各組MCF-7細(xì)胞中p-AKT表達(dá)降低。多西他賽作用后轉(zhuǎn)染Cav-1的MCF-7細(xì)胞中p-AKT的表達(dá)水平明顯低于對照組和空載體組(P<0.01),對照組和空載體組p-AKT蛋白的表達(dá)則無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。而各組細(xì)胞間總AKT蛋白的表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。見圖4。

    C: 對照組;C+D:對照組+Docetaxel;Cav-1+D:轉(zhuǎn)染組+Docetaxel; V+D:空載體組+Docetaxel圖4 多西他賽對不同組MCF-7細(xì)胞中磷酸化AKT表達(dá)的影響Fig 4 Effect of Docetaxel on p-AKT expression in three groups

    3 討 論

    化療在乳腺癌的綜合治療中占有重要的地位,然而化學(xué)藥物對機(jī)體的毒副作用往往限制了其劑量的使用,無法到達(dá)預(yù)期效果[4-5]。傳統(tǒng)策略是將化療藥物和其他非抗癌藥物聯(lián)用,以緩解藥物毒副作用,但這種做法并不能從根本上解決化療毒副作用對療效的影響。近年來腫瘤的生物治療越來越受到重視,基因治療作為腫瘤生物治療的重要手段之一,不僅可以協(xié)同化療實(shí)現(xiàn)化療增敏以及防止化療藥物產(chǎn)生耐藥性,還可以調(diào)控一系列腫瘤發(fā)生相關(guān)的信號通路達(dá)到靶向治療效果,已日漸成為腫瘤治療的一個重要途徑[6-7]。

    多西他賽屬于紫杉醇類藥物,可以通過促進(jìn)微管蛋白異常聚合并保持其穩(wěn)定,從而抑制細(xì)胞有絲分裂時紡錘體形成以及微管的其他功能;并能抑制微管蛋白解聚,破壞細(xì)胞的有絲分裂,使細(xì)胞阻滯在分裂期[8]。目前在臨床已廣泛應(yīng)用于乳腺癌、非小細(xì)胞肺癌、胃癌等多種惡性實(shí)體腫瘤治療,取得顯著療效[9-11]。近年來研究發(fā)現(xiàn),多西他賽可以誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞凋亡[12],其主要機(jī)制可能與下調(diào)抑制凋亡蛋白Bcl -2的表達(dá),上調(diào)促凋亡蛋白Bax 的表達(dá)有關(guān),但多西他賽是否還可以通過作用于其他基因誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡及其機(jī)制如何,目前尚不清楚。本研究發(fā)現(xiàn),多西他賽可以促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞MCF-7中Cav-1基因和蛋白的表達(dá),并呈劑量依賴性,提示Cav-1可能在多西他賽誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡中起重要作用。

    Cav-1是細(xì)胞膜主要支架蛋白之一,其表達(dá)異常與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn),Cav-1在正常乳腺導(dǎo)管上皮細(xì)胞中具有較高的表達(dá),而在乳腺癌組織及細(xì)胞中不表達(dá)或低表達(dá)。Cav-1表達(dá)下調(diào)會促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖,而Cav-1 過表達(dá)則可顯著抑制乳腺癌細(xì)胞的生長[13-14]。進(jìn)一步研究表明,Cav-1 可直接與PI3K 結(jié)合或通過膜雌激素受體與PI3K 的p85 亞基相互作用,從而抑制PI3K/AK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活化,通過增加Bax的表達(dá), 降低Bcl-2 的表達(dá),進(jìn)而抑制乳腺癌細(xì)胞增殖[15]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),多西他賽可明顯抑制MCF-7細(xì)胞的增殖,同時能增加Bax并降低Bcl-2的表達(dá)量,與文獻(xiàn)報(bào)道相一致[12]。其機(jī)制可能與降低AKT的磷酸化水平,進(jìn)而抑制PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有關(guān)。通過基因轉(zhuǎn)染和篩選建立穩(wěn)定過表達(dá)Cav-1的MCF-7細(xì)胞株,我們發(fā)現(xiàn)Cav-1可以顯著增加多西他賽對MCF-7細(xì)胞增殖的抑制作用,并且與對照組和空載體組相比,Cav-1聯(lián)合多西他賽可以使MCF-7細(xì)胞促凋亡蛋白Bax表達(dá)增高和抑制凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)降低,并具有更低的AKT磷酸化水平,兩者具有協(xié)同作用。由此可見,Cav-1 過表達(dá)可以通過抑制AKT磷酸化,阻止PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活化,從而抑制乳腺癌細(xì)胞的生長和增殖,增強(qiáng)其對多西他賽的化療敏感性。

    綜上所述,本研究將Cav-1和多西他賽結(jié)合有效地促進(jìn)了乳腺癌細(xì)胞的凋亡及其對化療藥物的敏感性,為尋找乳腺癌新的藥物靶標(biāo)及為個體化治療提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。基因免疫治療協(xié)同放化療的治療策略將會成為腫瘤治療新的熱點(diǎn),具有良好的應(yīng)用前景和新藥開發(fā)潛力。

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    Effect and potential mechanism of Cav-1 in Docetaxel inhibiting breast cancer MCF-7 cell proliferation

    LI Ying1,YIN Liangwei2,LIU Jiwei1, LIU Peng2

    (1.Department of Oncology, the First Affiliated Hospital of Dalian Medical University, Dalian 116011, China;2.Department of Oncology, Dalian Municipal Central Hospital Affiliated of Dalian Medical Universty, Dalian 116021, China)

    Objective To investigate the effect and potential mechanism of Cav-1 (Cav-1) on the proliferation inhibiting of breast cancer MCF-7 cell by Docetaxel. Methods The transfection group was established by stable transfection of pcDNA3.1-Cav-1 into MCF-7 cells, while the vector group (pcDNA3.1 vector transfected) and control group (non-transfection MCF-7 cells) were used as control. The Cav-1 expression of MCF-7 cells treated by Docetaxel was detected by Real-time PCR and Western-blot. CCK-8 assay was used to analyze the cell proliferation. The expression of Bax and Bcl-2 proteins and the activation of PI3K/AKT signal pathway were examined by Western-blot. Results The expression of Cav-1 in MCF-7 cells was gradually enhanced with the increasing of Docetaxel concentration in the range of 5-40 μg/mL.The inhibitory rate of cell proliferation in Cav-1 transfection group was significantly higher than that of the control groups after Docetaxel treatment (P<0.01). Compared with the control groups, Bax expression increased and Bcl-2 and p-AKT expression decreased in Cav-1 transfection group (P<0.01), while there was no significant difference between the two control groups (P>0.05). Conslusion Docetaxel might inhibit the proliferation of MCF-7 cells by promoting the Cav-1 expression, which can regulate the apoptosis-related protein expression and suppress the activation of PI3K/AKT signaling pathway.

    Cav-1; Docetaxel; breast cancer cells;cell proliferation; gene therapy

    國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(81302310)

    李 穎(1981-),女,主治醫(yī)師。E-mail:liying8121@126.com

    劉 鵬,主治醫(yī)師。E-mail:liupeng0823@126.com

    10.11724/jdmu.2017.04.02

    R737.9

    A

    1671-7295(2017)04-0318-05

    李穎,尹良偉,劉基巍,等.多西他賽對乳腺癌細(xì)胞中Cav-1表達(dá)及細(xì)胞增殖的影響[J].大連醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2017,39(4):318-322.

    2017-03-20;

    2017-05-16)

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