利魯唑?qū)ξ焖牡掳d癇大鼠海馬CA3區(qū)IL-1β、TNF-α的影響

馮基高，莫業(yè)和，劉達(dá)遠(yuǎn)，王東軍

（1.海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，海南?？?70311；2.廣東醫(yī)科大學(xué)，廣東湛江524001）

利魯唑?qū)ξ焖牡掳d癇大鼠海馬CA3區(qū)IL-1β、TNF-α的影響

馮基高1，莫業(yè)和1，劉達(dá)遠(yuǎn)1，王東軍2

（1.海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，海南海口570311；2.廣東醫(yī)科大學(xué)，廣東湛江524001）

目的探討利魯唑?qū)ξ焖牡?PTZ)致癲癇大鼠海馬CA3區(qū)白細(xì)胞介素1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子α (TNF-α)的影響。方法將45只大鼠按完全隨機(jī)設(shè)計(jì)方法分為對(duì)照組、癲癇模型組(PTZ組)和利魯唑組（Riluzole組)，每組15只；造模大鼠連續(xù)給予PTZ(35 mg·kg-1·d-1)腹腔注射30 d，3次Ⅳ級(jí)或以上發(fā)作大鼠為癲癇造模成功；免疫組織化學(xué)法檢測(cè)各組大鼠海馬CA3區(qū)IL-1β、TNF-α的表達(dá)和分布。結(jié)果對(duì)照組、PTZ組及Riluzole組大鼠的IL-1β陽性細(xì)胞平均光密度值(OD)分別為(0.210±0.002)、(0.241±0.002)和(0.220±0.002)，不同組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；TNF-α陽性細(xì)胞OD值分別為(0.191±0.003)、(0.230±0.003)和(0.202±0.003)，不同組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；大鼠海馬CA3區(qū)IL-1β與TNF-α表達(dá)水平呈顯著正相關(guān)(r=0.969，P＜0.01)。結(jié)論利魯唑通過抑制癲癇大鼠腦內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞過度表達(dá)IL-1β、TNF-α，可能降低其對(duì)正常神經(jīng)細(xì)胞的損傷作用，可能減緩癲癇發(fā)病對(duì)正常神經(jīng)細(xì)胞的損傷，產(chǎn)生神經(jīng)保護(hù)作用。

大鼠；利魯唑；戊四氮；癲癇；白細(xì)胞介素1β；腫瘤壞死因子α

癲癇是臨床最常見的神經(jīng)系統(tǒng)疾病之一。免疫-神經(jīng)-內(nèi)分泌網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)失衡與癲癇的發(fā)病密切相關(guān)[1]。細(xì)胞因子白細(xì)胞介素1β(interleukin-1 beta，IL-1β)及腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor alpha，TNF-α)均是體內(nèi)重要的免疫調(diào)節(jié)因子，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中還發(fā)揮著神經(jīng)遞質(zhì)的重要作用，它們與其受體緊密相結(jié)合后，通過調(diào)節(jié)神經(jīng)元釋放神經(jīng)遞質(zhì)并影響神經(jīng)元活性等重要相關(guān)途徑干擾癲癇的發(fā)生發(fā)展。利魯唑?qū)俦洁邕蝾惢衔铮桥R床上用于治療運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元病的一種藥物。其通過抑制腦內(nèi)興奮性氨基酸的活性、抑制N-甲基-D-天門冬氨酸受體(N-Methyl-D-Aspartate Receptor，NMDAR)的功能、抑制興奮性神經(jīng)遞質(zhì)的釋放及穩(wěn)定電壓依賴性鈉通道的失活狀態(tài)等機(jī)制來產(chǎn)生神經(jīng)保護(hù)作用[2]。有關(guān)載體狀況下利魯唑?qū)Πd癇模型海馬組織IL-1β、TNF-α的影響鮮見報(bào)道。鑒于此，本研究擬通過腹腔注射利魯唑觀察其對(duì)戊四氮(pentylenetetrazol，PTZ)致癲癇大鼠海馬組織IL-1β、TNF-α表達(dá)的影響，以期為臨床上預(yù)防及治療癲癇疾病提供實(shí)驗(yàn)支持和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物雄性健康SD大鼠60只，體質(zhì)量(200±20)g，由廣東醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 主要試劑利魯唑片購自賽諾菲(北京)制藥有限公司(國藥準(zhǔn)字J20100164，規(guī)格：50 mg)；PTZ購自美國Sigma公司；兔抗鼠IL-1β單抗、兔抗鼠TNF-α單抗購自武漢博士德生物公司；二步法免疫組化檢測(cè)試劑、DAB顯色試劑盒購自北京中杉金橋生物公司。

1.3 動(dòng)物分組實(shí)驗(yàn)SD大鼠分籠飼養(yǎng)于動(dòng)物房中，26℃恒溫，采用自由進(jìn)食水、自然晝夜的方法飼養(yǎng)，注意避免非特異性應(yīng)激反應(yīng)的發(fā)生。實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d，將45只大鼠按完全隨機(jī)設(shè)計(jì)方法分為對(duì)照組、癲癇模型組(PTZ組)和利魯唑組(Riluzole組)，每組15只。

1.4 造模方法造模大鼠按35 mg·kg-1·d-1給予PTZ腹腔注射，連續(xù)30 d。注藥操作在每天上午8:00～9:00進(jìn)行。每次給藥后觀察大鼠30 min，并記錄癲癇發(fā)作潛伏期、發(fā)作持續(xù)時(shí)間及發(fā)作時(shí)的行為表現(xiàn)。大鼠每5～6 d稱體質(zhì)量一次，以便調(diào)整PTZ劑量。模型點(diǎn)燃成功后，每5 d腹腔注射PTZ溶液1次加以鞏固。

1.5 癲癇發(fā)作的分級(jí)大鼠癲癇的行為表現(xiàn)采用Racine六級(jí)評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)[3]。0級(jí)：無任何反應(yīng)；Ⅰ級(jí)：濕狗樣抖動(dòng)表現(xiàn)為節(jié)律性咀嚼、動(dòng)須及眨眼；Ⅱ級(jí)：頸部肌肉持續(xù)痙攣表現(xiàn)為甩尾和(或)點(diǎn)頭；Ⅲ級(jí)：一側(cè)前肢間斷性陣攣；Ⅳ級(jí)：雙側(cè)前肢間斷性陣攣伴站立；Ⅴ級(jí)：全身陣攣，跌倒。記錄癲癇發(fā)作持續(xù)時(shí)間及發(fā)作時(shí)的行為表現(xiàn)。凡已獲得連續(xù)3次Ⅳ級(jí)或以上發(fā)作者，被認(rèn)為完全點(diǎn)燃。

1.6 利魯唑大鼠給藥劑量、給藥途徑及時(shí)間采用灌胃法給藥：造模成功后，利魯唑組按10 mg·kg-1·d-1給予利魯唑溶液灌胃，灌胃操作在每天上午8：00～9：00進(jìn)行，連續(xù)給藥8周。對(duì)照組和PTZ組給予等體積蒸餾水灌胃。

1.7 標(biāo)本的處理及切片的制備在最后一次灌胃給藥24 h后，10%的水合氯醛麻醉大鼠，斷頭處死，在冰盒上快速開顱取腦，分離腦組織取海馬組織，置于4%多聚甲醛溶液中，4℃存放24 h。梯度酒精脫水后石蠟包埋。石蠟標(biāo)本常規(guī)5 μm連續(xù)切片，取含海馬組織最大、最完整切面的切片供免疫組織化學(xué)反應(yīng)。

1.8 免疫組織化學(xué)染色選取的石蠟切片經(jīng)烤片、二甲苯脫蠟、梯度酒精脫水后高壓修復(fù)抗原，加3%H2O2滅活內(nèi)源性過氧化物酶，滴加一抗?jié)窈袃?nèi)4℃孵育過夜后滴加二抗，DAB顯色、蘇木素復(fù)染、1%鹽酸酒精分化、氨水返藍(lán)、梯度酒精脫水最后封片。

1.9 染色結(jié)果的判斷IL-1β、TNF-α的表達(dá)均以胞漿有棕黃色著色為陽性。采用圖像分析系統(tǒng)(OLYMPUS BX500顯微鏡，電腦圖像采圖軟件Image-Pro Plus 6.0分析軟件)進(jìn)行圖像分析。每只大鼠取5張切片，測(cè)海馬組織CA3區(qū)，在200倍視野下獲取平均光密度(OD)值，最后數(shù)據(jù)由分析系統(tǒng)自動(dòng)計(jì)算。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，計(jì)量資料兩兩比較采用t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)分析法。

2 結(jié)果

2.1 行為學(xué)觀察空白組無抽搐發(fā)作。45只腹腔注射PTZ溶液的SD大鼠，第1周后19只出現(xiàn)Ⅲ級(jí)以上發(fā)作，表現(xiàn)為點(diǎn)頭甩尾，四肢陣攣，之后癲癇發(fā)作逐漸加重。第2周后24只達(dá)到Ⅳ～Ⅴ級(jí)發(fā)作，表現(xiàn)為頭頸部僵硬，前肢陣攣，后肢直立，站立不穩(wěn)，跌倒，1只有Ⅴ級(jí)發(fā)作并死亡。第3周后34只大鼠達(dá)到Ⅳ～Ⅴ級(jí)發(fā)作，2只有Ⅴ級(jí)發(fā)作并死亡。第4周后36只達(dá)到Ⅳ～Ⅴ級(jí)發(fā)作，達(dá)到Ⅴ級(jí)的有34只，占致癲癇大鼠的75.6%左右，表現(xiàn)為全身強(qiáng)直陣攣，站立不穩(wěn)，跌倒，見表1。

表1 PTZ致癲癇大鼠模型行為學(xué)觀察(只)

2.2 IL-1β免疫組織化學(xué)結(jié)果光鏡下觀察免疫組織化學(xué)染色后的大鼠海馬組織CA3區(qū)，IL-1β呈胞漿表達(dá)，陽性細(xì)胞胞漿呈棕黃色。三組兩兩比較，PTZ組、Riluzole組IL-1β陽性細(xì)胞表達(dá)顯著高于對(duì)照組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；PTZ組IL-1β陽性細(xì)胞表達(dá)高于Riluzole組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見表2、圖1～3。

表2 各組大鼠海馬組織CA3區(qū)IL-1β的OD值()

表2 各組大鼠海馬組織CA3區(qū)IL-1β的OD值()

注：與正常對(duì)照組比較，aP＜0.05，bP＜0.05；與PTZ組比較，cP＜0.05。

對(duì)照組PTZ組Riluzole組0.210±0.002 0.241±0.002a0.220±0.002bc15 15 15

2.3 TNF-α免疫組織化學(xué)結(jié)果光鏡下觀察免疫組織化學(xué)染色后的大鼠海馬組織CA3區(qū)，TNF-α呈胞漿表達(dá)，陽性細(xì)胞胞漿呈棕黃色。三組兩兩比較，PTZ組、Riluzole組TNF-α陽性細(xì)胞表達(dá)顯著高于對(duì)照組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；PTZ組TNF-α陽性細(xì)胞表達(dá)高于Riluzole組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見表3、圖4～6。

圖1 對(duì)照組海馬CA3區(qū)IL-1β免疫組化標(biāo)記(×400)；圖2PTZ組海馬CA3區(qū)IL-1β免疫組化標(biāo)記(×400)；圖3利魯唑組海馬CA3區(qū)IL-1β免疫組化標(biāo)記(×400)

2.4 IL-1β與TNF-α表達(dá)的相關(guān)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：大鼠海馬CA3區(qū)IL-1β與TNF-α表達(dá)水平呈顯著正相關(guān)(n=45，r=0.969，P＜0.01)，見圖7。

表3 各組大鼠海馬組織CA3區(qū)TNF-α的OD值()

表3 各組大鼠海馬組織CA3區(qū)TNF-α的OD值()

注：與對(duì)照組比較，aP＜0.05，bP＜0.05；與PTZ組比較，cP＜0.05。

組別對(duì)照組PTZ組Riluzole組TNF-α(OD) 0.191±0.003 0.230±0.003a0.202±0.003bc樣本數(shù)（只）15 15 15

圖4 對(duì)照組海馬CA3區(qū)TNF-α免疫組化標(biāo)記(×400)；圖5PTZ組海馬CA3區(qū)TNF-α免疫組化標(biāo)記(×400)；圖6Riluzole組海馬CA3區(qū)TNF-α免疫組化標(biāo)記(×400)

圖7 各組SD大鼠海馬CA3區(qū)IL-1β與TNF-α表達(dá)水平的關(guān)系(n=45)

3 討論

IL-1β是一種多功能調(diào)節(jié)細(xì)胞因子，參與機(jī)體的多種病理生理反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)在癲癇大鼠模型腦組織中IL-1β的表達(dá)明顯增高，癲癇患血清及腦脊液中IL-1β的含量也顯著增高等[4-5]。Straussberg等[6]報(bào)道，IL-lβ可能通過介導(dǎo)細(xì)胞炎癥參與癲癇發(fā)生。在腦內(nèi)IL-β是由神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生，與受體緊密相結(jié)合后，通過調(diào)節(jié)神經(jīng)元釋放神經(jīng)遞質(zhì)并影響神經(jīng)元活性等重要相關(guān)途徑干擾癲癇的發(fā)生發(fā)展。TNF-α是一種具有多種生物學(xué)效應(yīng)的細(xì)胞因子，有增強(qiáng)興奮性神經(jīng)介質(zhì)興奮毒性作用，參與多種疾病的病理生理過程，在癲癇中也有重要作用[7]。在癲癇患者腦組織和腦脊液中，TNF-α及TNF-α mRNA的表達(dá)明顯升高[8]。Plata-Salaman等[9]發(fā)現(xiàn)，癲癇小鼠模型海馬組織TNF-α mRNA表達(dá)水平明顯升高。Liu等[10]發(fā)現(xiàn)癲癇與免疫功能異常關(guān)系密切，并發(fā)現(xiàn)TNF-α參與癲癇的發(fā)生發(fā)展。本實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，癲癇大鼠模型海馬組織IL-1 β、TNF-α陽性細(xì)胞表達(dá)顯著增高[(0.241± 0.002)、(0.230±0.003)]；且IL-1β與TNF-α表達(dá)水平呈顯著正相關(guān)(n=45，r=0.969，P＜0.01)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明TNF-α與IL-1β關(guān)系密切，文獻(xiàn)也報(bào)道IL-1β可激活核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)系統(tǒng)，NF-κB又能誘導(dǎo)TNF-α等更多細(xì)胞因子的表達(dá)[11]；而TNF-α可使星形膠質(zhì)細(xì)胞活化增殖，誘導(dǎo)其合成和分泌IL-1、IL-2等細(xì)胞因子[12]，介導(dǎo)癲癇模型大鼠腦組織局部的炎癥反應(yīng)，加重神經(jīng)損傷。

利魯唑(Riluzole)屬苯噻唑類化合物，能透過血腦屏障，臨床上用于治療神經(jīng)損傷及退行性疾病。利魯唑通過抑制NMDAR的功能及谷氨酸神經(jīng)興奮毒性作用機(jī)制，在麻醉、神經(jīng)保護(hù)、抗驚厥、抗抑郁、鎮(zhèn)痛和抗依賴等方面發(fā)揮作用[13]。研究表明，利魯唑重要從突觸前、突觸間隙及突觸后受體三個(gè)方面拮抗谷氨酸興奮毒性作用發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[14]，其作用機(jī)制可能與其影響多種離子通道和受體的功能相關(guān)。利魯唑抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)突觸前釋放谷氨酸[15]；上調(diào)星形膠質(zhì)細(xì)胞谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體數(shù)量及活性，增加谷氨酸清除[16]。利魯唑可抑制興奮性氨基酸活性，從而減少腦組織中乙酰膽堿的釋放，達(dá)到抗驚厥作用[17]。

結(jié)合本實(shí)驗(yàn)中利魯唑組IL-1β及TNF-α陽性細(xì)胞表達(dá)均明顯低于PTZ組(P＜0.05)的結(jié)果推測(cè)，臨床上應(yīng)用利魯唑治療癲癇疾病，可能會(huì)通過抑制谷氨酸的活性及釋放，降低了谷氨酸調(diào)節(jié)星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化增殖作用，減少了神經(jīng)膠質(zhì)瘢痕的形成和膠質(zhì)膜的重建，維持正常的生理結(jié)構(gòu)及生理功能，從而產(chǎn)生神經(jīng)保護(hù)作用影響癲癇的發(fā)生發(fā)展。而且，利魯唑還可能會(huì)通過抑制腦內(nèi)谷氨酸的活性及釋放，間接抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞過度分泌IL-1β、TNF-α等重要細(xì)胞因子，降低IL-1β、TNF-α對(duì)正常神經(jīng)細(xì)胞的損傷作用，從而減緩癲癇發(fā)病對(duì)正常神經(jīng)細(xì)胞的損傷，產(chǎn)生神經(jīng)保護(hù)作用。再者，利魯唑可能會(huì)通過抑制了NMDAR的功能，間接抑制了IL-1β介導(dǎo)的神經(jīng)元內(nèi)鈣離子升高，繼而影響神經(jīng)細(xì)胞膜上的電壓門控通道，進(jìn)而抑制神經(jīng)元興奮性增高及過度異常放電，最終抑制癲癇的發(fā)作。這些均需要后續(xù)實(shí)驗(yàn)去證實(shí)，這也提示了本實(shí)驗(yàn)為利魯唑的研究提供新的方向。

綜上所述，可以確認(rèn)在癲癇中利魯唑可抑制IL-1β、TNF-α的過度表達(dá)，可能發(fā)揮一定的神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用。但其機(jī)制仍需繼續(xù)深入研究，在下一步研究中，我們將進(jìn)行利魯唑影響免疫系統(tǒng)通路的研究，闡明利魯唑在癲癇發(fā)生發(fā)展中的具體機(jī)制，為癲癇的臨床診治及基礎(chǔ)研究提供新的依據(jù)。

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Effects of riluzole on the expressions of IL-1β and TNF-α in the hippocampus CA3 of rat with seizures induced by pentylenetrazole.

FENG Ji-gao1,MO Ye-he1,LIU Da-yuan1,WANG Dong-jun2.1.Department of Neurosurgery,the Second Affiliated Hospital of Hainan Medical University,Haikou 570311,Hainan,CHINA;2.Guangdong Medical University,Zhanjiang 524001,Guangdong,CHINA

ObjectiveTo investigate the effects of riluzole on interleukin-1 beta(IL-1β)and tumor necrosis factor alpha(TNF-α)levels in the hippocampus CA3 of Rat,using pentylenetetrazole(PTZ)kindling epileptic model. MethodsA total of 45 rats were divided into 3 groups:the control group,the epilepsy model group(PTZ group)and the riluzole group according to the completely randomized design method,with 15 rats in each group.The model rats were continuously given PTZ(35 mg·kg-1·d-1)intraperitoneal injection for 30 days.Rats with 3 times ofⅣor more seizures were successfully modeled for epilepsy.The expressions and distributions of IL-1β and TNF-α of each group in hippocampus of CA3 were evaluated by immunohistochemical assay.ResultsThe mean optical density(OD)of IL-1β positive cells in the control group,PTZ group and riluzole group were(0.210±0.002),(0.241±0.002)and(0.220±0.002), respectively,and there were significant differences among them(P＜0.05).The mean optical density(OD)of TNF-α in the control group,PTZ group and riluzole group were(0.191±0.003),(0.230±0.003)and(0.202±0.003),respectively, and there were significant differences among them(P＜0.05).There was a significantly positive correlation between the expressions of IL-1β and TNF-α in hippocampus CA3(r=0.969,P＜0.01).ConclusionRiluzole prevent the excessive expression of IL-1β,TNF-α from neurons in the brain of epileptic rats,reduce its damaging effects on normal nerve cells.Therefore,Riluzole act as a neuroprotector to alleviate damages of epilepsy.

Rat;Riluzole;Pentylenetetrazole;Epilepsy;Interleukin-1 beta(IL-1β);Tumor necrosis factor alpha(TNF-α)

R-332

A

1003—6350（2017）16—2586—04

2017-03-16)

海南省科學(xué)技術(shù)廳項(xiàng)目（編號(hào)：20168295）

王東軍。E-mail：395869860@qq.com