豬偽狂犬病病毒野毒SYBR-GreenⅠ實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法的建立

常 晨，張道華*，唐 波，劉國(guó)陽(yáng)，華 濤，侯繼波

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 動(dòng)物免疫工程研究所，江蘇 南京 210014； 2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 國(guó)家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心，江蘇 南京 210014； 3.江蘇省動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 揚(yáng)州 225009)

豬偽狂犬病病毒野毒SYBR-GreenⅠ實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法的建立

常 晨1，2，3，張道華1，2，3*，唐 波1，2，3，劉國(guó)陽(yáng)1，2，3，華 濤1，2，3，侯繼波1，2，3

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 動(dòng)物免疫工程研究所，江蘇 南京 210014； 2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 國(guó)家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心，江蘇 南京 210014； 3.江蘇省動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 揚(yáng)州 225009)

根據(jù)豬偽狂犬病病毒(PRV)gI/gE基因序列，設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，建立了鑒別PRV野毒感染的熒光定量PCR方法。該方法靈敏度達(dá)到102拷貝/μL，與豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)、豬細(xì)小病毒(PPV)、豬瘟病毒(CSFV)、乙腦病毒(JEV)不發(fā)生交叉反應(yīng)，具有良好的特異性和重復(fù)性；用PRV強(qiáng)毒攻毒仔豬，熒光定量PCR比普通PCR能更靈敏檢出組織帶毒量。該方法可以用于豬的組織樣品，如腦、肺、扁桃體、淋巴結(jié)等樣品中偽狂犬野毒的定量，可用于臨床偽狂犬野毒感染的早期檢測(cè)和定量分析豬偽狂犬病毒感染程度。

豬偽狂犬病病毒；SYBR- GreenⅠ；熒光定量PCR；野毒；檢測(cè)

偽狂犬病(Pseudorabies，PR)是由偽狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)引起的危害多種動(dòng)物的一種以發(fā)熱、奇癢(豬除外)和以腦脊髓炎為代表的神經(jīng)癥狀的急性傳染病。豬是PRV的主要貯存宿主及疫源動(dòng)物。豬偽狂犬病常引起妊娠母豬繁殖功能障礙和初生仔豬的神經(jīng)癥狀，仔豬感染率和死亡率極高，給世界養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大的損失[1-2]。豬偽狂犬病具有潛伏感染的特點(diǎn)，病毒可在耐過感染的豬體內(nèi)終生潛伏，在一定條件下，病毒可能被激活，導(dǎo)致豬群復(fù)發(fā)感染，及時(shí)診斷是預(yù)防和控制該病的關(guān)鍵[1-3]。過去診斷豬偽狂犬病的方法有病毒分離鑒定、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、中和試驗(yàn)、常規(guī)PCR檢測(cè)等等，但是過程繁瑣、周期長(zhǎng)，還存在污染和特異性差的缺點(diǎn)，給該病的臨床檢測(cè)和防治帶來滯后性[4]。熒光定量PCR技術(shù)是在PCR 技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新型檢測(cè)技術(shù)，SYBR-GreenⅠ熒光信號(hào)的積累與擴(kuò)增的雙鏈DNA數(shù)量呈正相關(guān)。該方法操作簡(jiǎn)便、敏感度高、成本較探針低，可以達(dá)到快速、定量的目的，在動(dòng)物疾病早期診斷和疫苗效果評(píng)價(jià)中有重要意義。

gI基因和gE基因是偽狂犬病毒毒力基因，以gI/gE基因序列作為靶序列建立的PCR技術(shù)，能夠區(qū)分基因缺失疫苗接種和野毒感染。本研究設(shè)計(jì)一對(duì)引物，利用SYBR-GreenⅠ熒光染料定量PCR方法，可以定量檢測(cè)出組織中的病毒含量，對(duì)診斷偽狂犬病毒早期感染和凈化病毒有重要意義。

1 材料與方法

1.1 毒株與菌種

PRV NJ株為本實(shí)驗(yàn)室分離與保存，DH5a工程感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自大連寶生物工程有限公司。

1.2 主要試劑與儀器

Taq DNA聚合酶、DL5000 Marker、SYBR Premix Ex TaqTM、pMD18-T載體、質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒、凝膠回收試劑盒購(gòu)自大連寶生物工程有限公司；Rotor-Gene 3000熒光定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)Gene公司。

1.3 質(zhì)粒模板標(biāo)準(zhǔn)品的制備

以偽狂犬病毒DNA為模板，PCR獲得848 bp的偽狂犬gI/gE基因片段，引物序列(實(shí)驗(yàn)室保存)如下：gI/gE基因上游引物：5′-CCCTGGACGCGAACGGCACGATG-3′；下游引物：5′-GGGTGGCACGCGGTCTCGAAGCA-3′。PCR運(yùn)行程序如下：94 ℃，5min；94 ℃，1 min；68 ℃，1 min；72 ℃，1 min；34個(gè)循環(huán)；72 ℃，10 min。1%瓊脂糖凝膠電泳，目的片段膠用回收試劑盒回收，按照載體連接試劑盒將基因片段連接pMD-18T載體，轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞，挑選陽(yáng)性菌落，提取質(zhì)粒，酶切鑒定，將陽(yáng)性結(jié)果的菌液送英駿公司測(cè)序。經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證的陽(yáng)性質(zhì)粒作為DNA標(biāo)準(zhǔn)品，命名為pMD-PRV-gI/gE。將標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒進(jìn)行10倍系列稀釋至濃度為108～104copies/μL，用于建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank登錄的偽狂犬病毒gI/gE基因序列，應(yīng)用Primer Premier 5.0生物軟件設(shè)計(jì)出擴(kuò)增110 bp片段的1對(duì)特異性引物，送大連寶生物工程有限公司合成。引物序列如下：上游引物：5′-GGTGTTTGCATAATTTTGTGGGTGG-3′；下游引物：5′-GAAAGGGCCGCATGGTCTCA -3′。

1.5 SYBR -GreenⅠ熒光定量PCR 擴(kuò)增及標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

用紫外分光光度計(jì)測(cè)量質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品pMD-PRV-gI/gE的OD值，計(jì)算拷貝數(shù)，以10倍梯度稀釋質(zhì)粒為模板進(jìn)行熒光定量PCR 擴(kuò)增，得到動(dòng)力學(xué)曲線及標(biāo)準(zhǔn)曲線。在20 μL反應(yīng)體系中依次加入以下成分：上、下游引物各0.4 μL， SYBR GreenⅠ Pre Mix聚合酶10 μL，模板2 μL，滅菌去離子水7.2 μL。在避光條件下將上述反應(yīng)體系混勻后進(jìn)行熒光定量PCR 擴(kuò)增，反應(yīng)的循環(huán)參數(shù)為：95 ℃，5 min；95 ℃，5 s；60 ℃，20 s；40個(gè)循環(huán)。

1.6 特異性檢驗(yàn)

將JEV、CSFV的病毒液按RNA iso Reagent試劑盒(Trizol法)提取總RNA，再反轉(zhuǎn)錄為cDNA 。按照蛋白酶K方法提取PRV、PPV、PCV - 2的DNA，備用。按照SYBR GreenⅠ熒光定量PCR反應(yīng)體系取5管，分別加入PRV DNA 2 μL(約100 ng)，PPV DNA 2 μL(約100 ng)，PCV - 2 DNA 2 μL(約100 ng)，CSFV cDNA 2 μL(約100 ng)，JEV cDNA 2 μL(約100 ng)；同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照，驗(yàn)證其特異性。

1.7 重復(fù)性檢驗(yàn)

選取偽狂犬病毒同一濃度的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行SYBR GreenⅠ熒光定量PCR 反應(yīng)，每一樣品做3個(gè)重復(fù)，通過Ct值和溶解曲線峰值溫度的分析，驗(yàn)證PRV SYBR GreenⅠ熒光定量PCR方法的穩(wěn)定性。

1.8 敏感性測(cè)定

將已計(jì)算出拷貝數(shù)的含目的基因的質(zhì)粒做10倍梯度稀釋，稀釋為109～100copies/μL，作為模板進(jìn)行熒光定量PCR，以此計(jì)算出熒光定量PCR所能檢出的最低模板拷貝數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 PRVgI/gE基因PCR擴(kuò)增與測(cè)序

取PCR產(chǎn)物5 μL于1%瓊脂糖凝膠上電泳，擴(kuò)增產(chǎn)物在750 bp與1000 bp之間，與預(yù)計(jì)的片段大小相符(圖1)。PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收純化后，與pMD 18-T載體連接并轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞。提取質(zhì)粒，進(jìn)行酶切鑒定。將酶切大小正確的重組質(zhì)粒送英駿公司測(cè)序，測(cè)定結(jié)果與目的序列完全一致。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

使用TaKaRa推薦的2步法將60 ℃作為退火溫度，擴(kuò)增動(dòng)力學(xué)曲線良好，并且所對(duì)應(yīng)的熔解曲線無非特異性擴(kuò)增出現(xiàn)。使用TaKaRa推薦的Roche LightCycler反應(yīng)體系，終濃度為0.2 μmol/L的引物擴(kuò)增動(dòng)力學(xué)曲線良好(圖2)，并且所對(duì)應(yīng)的熔解曲線無非特異性擴(kuò)增出現(xiàn)。將重組質(zhì)粒進(jìn)行10倍梯度倍比稀釋，選取合適濃度范圍(104～108拷貝/μL)，進(jìn)行Real-time PCR，通過LightCycler 480 software release 1.5.0 SP3軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。獲得PRVgI/gE基因標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖3所示，標(biāo)準(zhǔn)曲線的截距為43.01，斜率為-3.301，擴(kuò)增效率為100.009%，誤差為0.00969，判定系數(shù)R2為0.99。

2.3 熒光定量PCR擴(kuò)增的可重復(fù)性

為驗(yàn)證熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果的可重復(fù)性，將重組質(zhì)粒每個(gè)稀釋度做3個(gè)重復(fù)，由圖4可知，3次的動(dòng)力學(xué)曲線重合，可見熒光定量PCR有很高的可重復(fù)性。

曲線1、2、3、4、5的質(zhì)粒的濃度分別為

圖3 gI/gE基因標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4 熒光定量PCR擴(kuò)增的特異性

對(duì)PRV、JEV、CSFV、PPV、PCV-2及雙蒸水進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)，結(jié)果(圖5)顯示gI/gE熒光定量PCR對(duì)偽狂犬病毒NJ株在10個(gè)循環(huán)左右開始起峰，而對(duì)JEV、CSFV、PPV、PCV-2及雙蒸水均在30個(gè)循環(huán)左右起峰，用于檢測(cè)的引物具有高度的特異性。

2.5 熒光定量PCR擴(kuò)增的敏感性

以10倍梯度稀釋的gI/gE標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒為模板，用所建立的熒光定量PCR進(jìn)行檢測(cè)。如圖6所示，發(fā)現(xiàn)稀釋至102拷貝/μL時(shí)，仍有規(guī)律的S型熒光曲線。

圖5 熒光定量PCR特異性擴(kuò)增結(jié)果

2.6 對(duì)免疫攻毒豬病料的檢測(cè)

為了驗(yàn)證建立的熒光定量PCR方法對(duì)偽狂犬病毒感染的檢出結(jié)果，我們用偽狂犬滅活苗免疫試驗(yàn)豬10頭，同時(shí)設(shè)空白豬2頭，2周后攻毒，5 d后撲殺，根據(jù)鼻拭子排毒情況，分別取免疫組和對(duì)照組排毒最嚴(yán)重的3頭豬的腦、肺、扁桃體、脾、淋巴結(jié)組織，研磨，提取組織DNA，同時(shí)采用本法和普通PCR進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果見表1和表2，用本法檢測(cè)攻毒保護(hù)豬的腦、扁桃體、淋巴結(jié)中偽狂犬病毒結(jié)果均為陽(yáng)性，其中扁桃體中的病毒含量最高；PCR檢測(cè)僅部分結(jié)果呈陽(yáng)性。

曲線1、2、3、4、5、6、7、8的質(zhì)粒濃度分別為109、108、107、106、105、104、103、102拷貝/μL。

3 討論

豬偽狂犬病作為危害我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的一個(gè)重要傳染病，加上近年來許多大規(guī)模的偽狂犬疫情在豬場(chǎng)暴發(fā)，臨床快速、準(zhǔn)確診斷偽狂犬病，對(duì)該病的發(fā)現(xiàn)和防控有重要意義。豬急性感染后，偽狂犬病毒能夠在神經(jīng)系統(tǒng)中建立終身潛伏感染[5-7]。PRV疫情診斷有3個(gè)時(shí)間段難以檢測(cè)出豬體內(nèi)的病毒：(1)急性感染期～血清轉(zhuǎn)陽(yáng)之前；(2)恢復(fù)期；(3)潛伏期。過去使用市售的gB阻斷ELISA和gE阻斷ELISA來檢測(cè)恢復(fù)期的PRV特異性抗體，以此區(qū)分野生型偽狂犬病毒和接種的疫苗毒株，但其不能診斷偽狂犬病毒的急性感染，并且在某些豬中，潛伏期的抗體水平存在衰減，容易產(chǎn)生假陰性結(jié)果[5]。因此，有效檢測(cè)潛伏感染的豬是控制和根除偽狂犬病的關(guān)鍵。PCR技術(shù)能快速、敏感和準(zhǔn)確地診斷豬的偽狂犬病[8,10]。另一項(xiàng)研究報(bào)道，實(shí)時(shí)熒光定量PCR比普通PCR檢測(cè)更敏感[11-12]，本研究證實(shí)了這一結(jié)果。常規(guī)PCR方法無法作出早期的診斷；本方法不僅呈現(xiàn)良好的特異性，檢測(cè)靈敏度可以達(dá)到102拷貝/μL，與常規(guī)的PCR方法比較，該方法更精確，更省時(shí)，操作更簡(jiǎn)便。張雪寒等[12]利用TaqMan探針技術(shù)建立檢測(cè)豬偽狂犬病毒的方法，可檢測(cè)到20拷貝/μL，但其成本高，需結(jié)合特異性探針。本試驗(yàn)建立的SYBR-GreenⅠ實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，選取豬偽狂犬病毒gI、gE基因的重組質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)品，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，該方法呈現(xiàn)良好的S型擴(kuò)增曲線，具有很好的重復(fù)性，能夠靈敏地檢測(cè)出豬偽狂犬病野毒感染的情況。

表1 免疫后攻毒豬樣品熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果

注：“-”代表結(jié)果陰性；CT值表示陽(yáng)性樣品檢出時(shí)對(duì)應(yīng)的循環(huán)數(shù)。

表2 免疫后攻毒豬樣品PCR檢測(cè)結(jié)果

注：“+”代表結(jié)果陽(yáng)性；“-”代表結(jié)果陰性。

為了更好驗(yàn)證本研究建立的定量PCR方法的可操作性，我們選取了攻毒保護(hù)實(shí)驗(yàn)中鼻拭子排毒最多的3頭豬，取腦等組織研磨，提取DNA，分別進(jìn)行普通PCR檢測(cè)和熒光定量PCR檢測(cè)。普通PCR陽(yáng)性的樣品，本法同樣得到陽(yáng)性的結(jié)果。本法檢測(cè)組織樣品中病毒載量均大于350拷貝/μL。

本試驗(yàn)建立的SYBR-GreenⅠ實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，可作為規(guī)?；i場(chǎng)PRV的凈化檢測(cè)方法，建立無PRV的豬群，同時(shí)也為偽狂犬病毒的早期診治建立了基礎(chǔ)。

[1] 殷震,劉景華.動(dòng)物病毒學(xué)[M].2版.北京:科學(xué)出版社,1997:700-713.

[2] 斯特勞B E,阿萊爾S D,蒙加林W L,等.豬病學(xué)[M].趙德明,張仲秋,沈建忠,譯.8版.北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社,2000:195-196.

[3] Peeters B, Dewind N, Broer R, et al. Glycoprotein H of pseudorabies virus is essential for entry and cell to cell spread of the virus [J]. J Viro, 1992, 66: 3888-3892.

[4] Newby D T, Hadfield T L, Roberto F F. Real-time PCR detection ofBrucellaabortus: a comparative study of SYBR GreenⅠ, 5’-exonuclease and hybridization probe assays[J]. Appl Environ Microbiol, 2003, 69(8): 4753-4759.

[5] 王喜姣,熊文婕,曹國(guó)敏.2010～2013年廣西規(guī)?；i場(chǎng)偽狂犬病毒野毒株感染血清學(xué)調(diào)查[J].南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2015,46(3):508-511.

[6] Wenjun M, Kelly M L, Juergen A R, et al. Development of real-time polymerase chain reaction assays for rapid detection and differentiation of wild-type pseudorabies and gene-deleted vaccine viruses [J]. J Vet Diagn Invest, 2008, 20:440-447.

[7] Francoise P, Céline D, Aurélie O, et al. Validation of a commercial real-time PCR kit for specific and sensitive detection of pseudorabies [J]. Journal of Virological Methods, 2013, 187: 421-423.

[8] Denis M, Soumet C, Legeay O, et al. Development of a semi-quantitative PCR assay using internal standard and colorimetric detection on microwell plate for pseudorabies virus[J]. Mol Cell Probes, 1997, 11: 439-448.

[9] Hasebe H, Wheeler J G, Osorio F A. Gene specific assay to differentiate strains of pseudorabies virus[J]. Vet Microbiol, 1993, 34(3): 221-231.

[10] 饒桂波,孟菲,王力波,等.豬偽狂犬病毒變異株與大腸桿菌、志賀氏菌混合感染的病原鑒定及分析[J].南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2015,46(6):1111-1116.

[11] Yoon H A, Eo S K, Aleyas A G, et al. Molecular survey of latent pseudorabies virus infection in nervous tissues of slaughtered pigs by nested and real-time PCR[J]. J Microbiol, 1993, 43: 430-436.

[12] 張雪寒,何孔旺,繆文凱,等.Taqman探針實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)豬偽狂犬病毒[J].江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2008,24(4):440-443.

(責(zé)任編輯：許晶晶)

Establishment of SYBR-Green Ⅰ Real-time Quantitative PCR Method for Detection of Porcine Pseudorabies Wild-type Virus

CHANG Chen1，2，3, ZHANG Dao-hua1，2，3*, TANG Bo1，2，3, LIU Guo-yang1，2，3, HUA Tao1，2，3, HOU Ji-bo1，2，3

(1. Institute of Veterinary Immunology and Engineering, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210014, China; 2. National Research Center of Engineering and Technology for Veterinary Biological Products, Jiangsu Academy of Agricultural Sciences, Nanjing 210014, China; 3. Jiangsu Co-innovation Center for Prevention and Control of Important Animal Infectious Diseases and Zoonoses, Yangzhou 225009, China)

We designed a pair of specific primers according to the sequence of genegI/gEin porcine pseudorabies virus (PRV), and established the SYBR-Green Ⅰ real-time quantitative PCR method for the detection of wild-type PRV. The sensitivity of this method reached 100 copy/μL. This method exhibited good specificity and repeatability, and it could prevent from the cross reactions between PRV and other porcine pathogens such as PCV2, PPV, CSFV and JEV. After piglets were challenged with high-virulent PRV, the virus in pig tissue could be detected more sensitively by fluorescent quantitative real-time PCR than by traditional PCR. This method can be used for the quantitative assay of wild-type PRV in the tissue (such as brain, lung, tonsil and lymph nodes) samples of pig, and it also can be used for the early clinical detection of wild-type PRV and the quantitative analysis of the infectious degree of PRV.

Porcine pseudorabies virus; SYBR-Green Ⅰ; Real-time quantitative PCR; Wild-type virus; Detection

2017-05-27

農(nóng)業(yè)公益性行業(yè)科研專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)項(xiàng)目(201303046)。

常晨(1987─)，女，江蘇南京人，助理研究員，碩士，主要從事動(dòng)物疫苗產(chǎn)品研究工作。*通訊作者：張道華。

S858.28

A

1001-8581(2017)09-0001-04