右美托咪定對(duì)膿毒癥患者外周血線粒體能量代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響

鄧興，林名瑞，肖雄箭，林建東

（1.龍巖市第二醫(yī)院ICU，福建龍巖364000；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬人民醫(yī)院ICU，福建福州350004；3.福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院ICU，福建福州350005）

--論著--

右美托咪定對(duì)膿毒癥患者外周血線粒體能量代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響

鄧興1，林名瑞2，肖雄箭3，林建東3

（1.龍巖市第二醫(yī)院ICU，福建龍巖364000；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬人民醫(yī)院ICU，福建福州350004；3.福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院ICU，福建福州350005）

目的基于PCR Assay芯片技術(shù)，分析右美托咪定對(duì)膿毒癥外周血線粒體能量代謝相關(guān)基因表達(dá)的變化并推論其可能的作用機(jī)制。方法選取50例老年嚴(yán)重膿毒癥病例，隨機(jī)分為右美托咪定治療組與生理鹽水對(duì)照組（常規(guī)治療組）。右美托咪定干預(yù)前與干預(yù)后1、3天所有患者靜脈采血立即提取RNA做PCR Assay基因芯片檢測(cè)。結(jié)果右美托咪定組與常規(guī)治療組相比，死亡率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。經(jīng)右美托咪定干預(yù)后，線粒體產(chǎn)能相關(guān)基因（如：Ndufa1、Ndufab1、Ndufb2、Ndufs8、Sdha、Uqcrb、Cox8a、Atp5a1、Atp5i）從抑制轉(zhuǎn)為活躍表達(dá)，以彌補(bǔ)機(jī)體高代謝狀態(tài)下產(chǎn)能的減少。結(jié)論右美托咪定早期應(yīng)用可調(diào)節(jié)機(jī)線粒體能量相關(guān)基因表達(dá)，使機(jī)體整體供能與應(yīng)激期時(shí)能量代謝相匹配，從而起到對(duì)膿毒癥的保護(hù)作用，但并不減少膿毒癥患者死亡率。

膿毒癥；右美托咪定；線粒體；能量代謝；PCR Assay

膿毒癥3.0對(duì)膿毒癥作出了新的釋義，即膿毒癥系感染基礎(chǔ)上出現(xiàn)一定程度的器官功能障礙[1]。膿毒癥作為危重病領(lǐng)域的常見(jiàn)病，引起危重病醫(yī)學(xué)界的極大重視。盡管近年危重病專家對(duì)膿毒癥的認(rèn)識(shí)及治療方式的改進(jìn)，膿毒癥患者死亡率有所下降，但隨著人口老齡化發(fā)展，膿毒癥的發(fā)病率卻呈上升趨勢(shì)，繼而使膿毒癥死亡人數(shù)呈逐年上升趨勢(shì)[2]。繼往研究顯示：膿毒癥早期，機(jī)體氧耗往往增加，但由于毛細(xì)血管滲漏致機(jī)體容量相對(duì)不足，導(dǎo)致機(jī)體組織器官有效灌注不足，進(jìn)而引起組織缺氧，這更進(jìn)一步加劇機(jī)體缺氧。線粒體因缺氧不能有效地驅(qū)動(dòng)ADP氧化磷酸化為ATP，從而引起機(jī)體產(chǎn)能的減少，同時(shí)也可觸發(fā)細(xì)胞死亡[3]。右美托咪定（DEX）屬于高選擇性α2-腎上腺素能受體激動(dòng)劑中的一種，在臨床鎮(zhèn)靜、抗焦慮方面有一定的歷史[4]。繼往動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究顯示右美托咪定可使線粒體功能障礙大鼠受益[5]。但對(duì)于膿毒癥早期使用右美托咪定鎮(zhèn)靜是否可改善外周血中線粒功能障礙國(guó)內(nèi)外仍少見(jiàn)，本研究擬從基因水平對(duì)右美托咪定對(duì)膿毒癥患者外周血線粒體能量代謝作用相關(guān)機(jī)制作一探討。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)方法選取2015年1月～2015年12月龍巖市第二醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科收治的50例老年嚴(yán)重膿毒癥患者，隨機(jī)分為右美托咪定治療組（A組）與生理鹽水對(duì)照組（常規(guī)治療組，B組），各25例。嚴(yán)重膿毒癥患者的準(zhǔn)入標(biāo)準(zhǔn)參照中國(guó)嚴(yán)重膿毒癥/膿毒性休克治療指南（2014）[6]。排除標(biāo)準(zhǔn)為合并外傷、免疫缺陷性疾患、乙肝表面抗原陽(yáng)性、嚴(yán)重心血管疾病、終末期肝腎疾病、惡性腫瘤、長(zhǎng)期使用鎮(zhèn)靜催眠藥物及近3個(gè)月內(nèi)使用激素或免疫抑制劑史。本研究符合醫(yī)學(xué)倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并獲得患者家屬的知情同意。隨機(jī)選取10例健康體檢老年人作為健康對(duì)照組（C組）。1.2臨床資料本實(shí)驗(yàn)研究最終共納入50例老年嚴(yán)重膿毒癥患者，A組與B組在年齡、性別、APACHEⅡ評(píng)分等比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表1。

表1 臨床資料（x±s）Table 1 General clitical data(x±s)

1.3 治療方法所有患者均在入ICU并給予常規(guī)重癥監(jiān)護(hù)、抗生素治療、復(fù)蘇、維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定等一般治療。A組則先予右美托咪定負(fù)荷量2.5μg/(kg·h)的速度靜脈泵入，后改用0.2～0.7μg/(kg·h)的速度持續(xù)靜脈泵入鎮(zhèn)靜，B組患者除了未予右美托咪定外其他治療均相同，同時(shí)予同B組同等量的生理鹽水進(jìn)行對(duì)照。用藥前與用藥后1、3天所有患者靜脈采血5 mL，取其中3 mL血液立即分離線粒體后提取RNA，-80℃保存，待做基因芯片檢測(cè)。

1.4 觀察指標(biāo)及方法能量代謝相關(guān)基因表達(dá)量檢測(cè)。按組及取材時(shí)間為單位，隨機(jī)取10標(biāo)本的RNA，進(jìn)行混勻后，進(jìn)一步提取mRNA，取2μg mRNA使用superscriptⅡ和Random Primer Hexamers（Invitrogen）反轉(zhuǎn)錄合成并純化cDNA。然后在PCR Array的96孔板中各加入20 ng cDNA，依RT2Profiler?PCR Array使用說(shuō)明設(shè)置循環(huán)數(shù)并進(jìn)行PCR并計(jì)算出每個(gè)孔板中的Ct數(shù)。采用ΔΔCt方法計(jì)算每個(gè)處理組中的每個(gè)通路相關(guān)基因的ΔCt。ΔCt(group 1)= average Ct-average of HK genes’Ct for group 1 array ΔCt(group 2)=average Ct-average of HK genes’Ct for group 2 array。計(jì)算2個(gè)PCR Array（或兩組）中每個(gè)基因的ΔΔCt。ΔΔCt=ΔCt(A組)-ΔCt (B組)。同過(guò)2-ΔΔCt計(jì)算組2與組1對(duì)應(yīng)基因的表達(dá)差異。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料采用“x±s”表示，組間及組內(nèi)比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床治療及轉(zhuǎn)歸統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示A組患者平均住院時(shí)間(15.72±5.04)與B組（15.76±3.95）接近（P=0.401）；兩組患者28 d死亡率（0.24 vs 0.32）（P=0.529）?；颊咦罱K死亡原因多數(shù)為MODS。

2.2 相對(duì)于C組，A、B組Fold值改變情況右美托咪定干預(yù)后Ndufa1、Ndufab1、Ndufb2、Ndufs8、Sdha、Uqcrb、Cox8a、Atp5a1、Atp5i的Fold絕對(duì)值趨向于升高趨勢(shì)，而B(niǎo)組治療前后，絕大多數(shù)Fold值變化并不大。見(jiàn)表2。

表2 相對(duì)于C組，右美托咪定干預(yù)前后及B組治療前后相關(guān)有意義基因的表達(dá)情況Table 2 Compared to C group，the expression of related significant genes of before and after dexmedetomidine intervention and before and after treatment of B group

3 討論

膿毒癥是危重病，仍是重癥醫(yī)學(xué)科主要病種之一，具有極高的死亡率[2]。盡管隨著其病理生理研究的深入及相關(guān)生命支持的進(jìn)步，但其病死亡率仍不容忽視。研究顯示，膿毒癥引起的全身炎癥反應(yīng)綜合征往往會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)熱休克蛋白，組蛋白，DNA，線粒體等功能相應(yīng)受損[7]。近年來(lái)研究指出，關(guān)于膿毒癥與機(jī)體代謝盯著研究指出，系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)可以以不同的方式影響線粒體：①在感染性休克灌注受損的早期，由于內(nèi)在和外在的液體損失和攝入減少，血管張力減少，心肌收縮受抑制，微循環(huán)血流量重新分配能力喪失，這可致組織缺氧，即在線粒體內(nèi)氧不足以驅(qū)動(dòng)ADP的氧化磷酸化的ATP。雖然特殊的酶特性的復(fù)合物IV可以在氧氣濃度較低時(shí)發(fā)揮有效功能，但非常低的水平可能會(huì)影響ATP的生成從而成為觸發(fā)細(xì)胞死亡潛在的通路[8]。②NO，硫化氫，和其他活性氧過(guò)量產(chǎn)生直接抑制線粒體呼吸和直接損害線粒體蛋白和其他結(jié)構(gòu)如脂質(zhì)膜。一氧化氮和過(guò)氧亞硝基陰離子也被證明具有變化對(duì)其他呼吸鏈酶的影響[9]。③膿毒癥中激素的改變對(duì)線粒體功能和效率的影響。例如，甲狀腺激素被認(rèn)為主要是發(fā)揮它的作用，通過(guò)調(diào)節(jié)線粒體功能，即在膿毒癥早期，機(jī)體甲狀腺功能就有可能受影響，即重癥感染可引起“SES”或“低T3綜合征”[10]。這在臨床工作中也得到認(rèn)可。

研究顯示，膿毒癥時(shí)，機(jī)體代謝加快，然而，因炎癥反應(yīng)相關(guān)的一系列級(jí)聯(lián)反應(yīng)嚴(yán)重影響機(jī)體線粒體的功能，進(jìn)而引起機(jī)體能量生成障礙。這種供需矛盾，更進(jìn)一步加重機(jī)體組織器官功能的障礙。右美托咪定作為一種α2-腎上腺素受體激動(dòng)劑，主要涉及抑制去甲腎上腺素的釋放和神經(jīng)元的興奮，可一定程度上抑制SIRS進(jìn)一步發(fā)展[11-12]。例如：M Peng等人研究發(fā)現(xiàn)右美托咪定是一種有效的抑制脂多糖誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞活化的炎癥[13]。另有研究發(fā)現(xiàn)，在心臟搭橋手術(shù)中，應(yīng)用右美托咪定可減少機(jī)體產(chǎn)生IL-1，IL-6，TNF-α[14]。

本研究發(fā)現(xiàn)，膿毒癥時(shí)，線粒體產(chǎn)能相關(guān)基因（如：Ndufa1、Ndufab1、Ndufb2、Ndufs8、Sdha、Uqcrb、Cox8a、Atp5a1、Atp5i）表達(dá)受到一定程度的抑制，這從一定程度上抑制了線粒體呼吸，從而致使機(jī)體產(chǎn)能減少。經(jīng)右美托咪定干預(yù)后，此基因表達(dá)水平升高明顯，以彌補(bǔ)機(jī)體高代謝狀態(tài)下產(chǎn)能的不足，而常規(guī)治療，這些基因表達(dá)上調(diào)輻度相對(duì)較低，甚至仍以抑制為主。因此，右美托咪定可能通過(guò)調(diào)節(jié)線粒體產(chǎn)能相關(guān)基因的表達(dá)，從而起到維持機(jī)體代謝水平，

綜上所述，膿毒癥時(shí)機(jī)體線粒體產(chǎn)能相關(guān)基因表達(dá)明顯受抑，右美托咪定可能通過(guò)調(diào)節(jié)線粒體產(chǎn)能相關(guān)基因的表達(dá)，從而起到對(duì)膿毒癥患者保護(hù)作用,但并不減少膿毒癥患者死亡率。

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Effect of dexmedetomidine on expression of mitochondrial energy metabolism related genes of peripheral blood in septic patients

Deng Xing1,Lin Ming-rui2,Xiao Xiong-jian3,Lin Jian-dong3
(1.Intensive Care Unit,The Second Hospital of Longyan,Longyan,Fujian,364000,China;2.Intensive Care Unit,TheAffiliated People’s Hospital of Fujian Traditional Medical University,Fuzhou,Fujian,350004,China;3.Intensive Care Unit,The First Affiliated Hospital of Fujian Medical University,Fuzhou,Fujian,350005,China)

Objective To analyze the changes of mitochondrial energy metabolism related genes of peripheral blood in septic patients were under Dexmedetomidine treatment based PCR Assay chip technology and to find its possible mechanism.Methods 50 cases of severe septic patients were selected.The patients were randomly divided into the Dexmedetomidine treatment group and normal saline control group(conventional treatment group).Before Dexmedetomidine given and 1,3 days post-intervention,venous blood of all patients was collected immediately and extract RNA,and then to do PCR Assay cDNA microarray.Results There was no significant difference in mortality between the dexmedetomidine group and the conventional treatment group.The expression of mitochondrial production-related genes(Ndufa1,Ndufab1,Ndufb2,Ndufs8,Sdha,Uqcrb, Cox8a,Atp5a1,Atp5i)are actived from inhibition to make up for the body's high metabolic capacity reduction.Conclusion Early application of Dexmedetomidine can regulate the expression of genes related to mitochondrial energy-related genes to match the body of the overall energy supply with energy metabolism during the stress period,which can protect the sepsis,but does not reduce the mortality of patients with sepsis.

Sepsis;Dexmedetomidine;Mitochondrion;Energy metabolism;PCRAssay

10.3969/j.issn.1009-4393.2017.24.001

中華醫(yī)學(xué)會(huì)臨床醫(yī)學(xué)科研專項(xiàng)資金-國(guó)瑞重癥科研項(xiàng)目（13091440529）

林建東，E-mail：linjd@tom.com