菜豆種質(zhì)資源的植物凝集素含量測(cè)定與評(píng)價(jià)

任三國(guó)，陳高，郭瑞，陳禪友

（江漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/湖北省豆類（蔬菜）植物工程技術(shù)研究中心/湖北省食用豆類植物自然科技資源中心，武漢，430056）

菜豆種質(zhì)資源的植物凝集素含量測(cè)定與評(píng)價(jià)

任三國(guó)，陳高，郭瑞，陳禪友

（江漢大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/湖北省豆類（蔬菜）植物工程技術(shù)研究中心/湖北省食用豆類植物自然科技資源中心，武漢，430056）

以112份菜豆種質(zhì)商品莢為試驗(yàn)材料，測(cè)定了植物凝集素含量，分析評(píng)價(jià)其遺傳變異，擴(kuò)大極端菜豆凝集素水平的篩查范圍。試驗(yàn)結(jié)果表明，供試菜豆種質(zhì)的凝集素均值為0.335 3 mg/g，變幅為0.000 3～1.607 8 mg/g，變異系數(shù)為82.26%，種質(zhì)間水平差異極顯著（p<0.01）。研究還表明，供試菜豆植物凝集素含量的種質(zhì)頻率分布曲線呈非連續(xù)分布但有明顯主峰，有極低和極高水平的種質(zhì)分布。在已檢測(cè)的289份資源中，篩選出極低植物凝集素的菜豆材料2份，為低毒菜豆遺傳改良提供技術(shù)基礎(chǔ)。

菜豆；種質(zhì)；植物凝集素

菜豆（Phaseolus vulgarisL.）是人類生活中重要的食用豆類之一，菜豆可分為粒用菜豆和莢用菜豆，2014年全世界普通菜豆籽粒產(chǎn)量為2 500萬t，占食用豆總產(chǎn)量的50%左右[1]。食莢菜豆是普通菜豆傳入中國(guó)后，果莢產(chǎn)生基因突變失去硬質(zhì)層，并經(jīng)過長(zhǎng)期選擇及進(jìn)化而形成的軟莢變種蔬菜作物[2]。食莢菜豆含有豐富的人體所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，但含有包括皂苷、胰蛋白酶抑制劑、植酸和植物凝集素[3]等在內(nèi)的抗?fàn)I養(yǎng)因子，食用不當(dāng)會(huì)造成人體中毒，中毒后會(huì)出現(xiàn)四肢麻木，胃燒灼，頭痛、胸悶等神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，嚴(yán)重者可昏迷，甚至可造成心腎肝多臟器損害或猝死[4]。前期研究曾對(duì)56份菜豆種質(zhì)的4種抗?fàn)I養(yǎng)因子水平進(jìn)行差異分析[5]，結(jié)果表明，不同菜豆種質(zhì)抗?fàn)I養(yǎng)因子水平差異極大；并通過小鼠飼喂實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蜆?gòu)建[6]，發(fā)現(xiàn)菜豆凝集素（Phaseolus vulgaris agglutinin，PHA）是菜豆中的主要內(nèi)源毒素；因而尋求低水平種質(zhì)十分關(guān)鍵，故此后又對(duì)121份菜豆種質(zhì)進(jìn)行凝集素含量水平分析評(píng)價(jià)[7]。

本研究以未知凝集素水平的112份菜豆種質(zhì)為材料進(jìn)行測(cè)試，以進(jìn)一步擴(kuò)大篩查范圍，并結(jié)合前期研究，從中篩選出極低凝集素含量的種質(zhì)，以期再利用其與綜合性狀如熟性、單株莢數(shù)、單莢長(zhǎng)、單莢質(zhì)量等優(yōu)異品種雜交和回交，達(dá)到選育出綜合性狀優(yōu)良的低凝集素含量的菜豆品種的目的，為菜豆食用安全和產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

于2016年秋季在江漢大學(xué)湖北省豆類（蔬菜）植物工程技術(shù)研究中心試驗(yàn)大田（位于武漢市蔡甸區(qū)永安鎮(zhèn)，E 113°47′，N 30°30′）開展了菜豆種質(zhì)資源比較試驗(yàn)，共計(jì)112份食莢菜豆種質(zhì)參試，編號(hào)為1～112。試驗(yàn)采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，重復(fù)3次。每個(gè)小區(qū)10 m×1.6 m，面積為16 m2，株行距0.25 m× 0.85 m。試驗(yàn)場(chǎng)地土壤肥力均勻一致，8月20日地膜覆蓋播種，栽培管理按照當(dāng)?shù)爻Ｒ?guī)技術(shù)進(jìn)行。觀察農(nóng)藝性狀，10月9日后觀察開花結(jié)莢情況。選取開花后15 d的鮮莢作為試驗(yàn)材料，從每個(gè)品種每個(gè)試驗(yàn)小區(qū)隨機(jī)選取若干豆莢（約 50 g）作為 1份樣品，共計(jì)336份樣品，用于植物凝集素含量測(cè)定。

1.2 PHA的檢測(cè)方法

采集的樣品材料置于-80℃冰箱低溫冰凍，備用。選取健康白兔靜脈取血，經(jīng)胰蛋白酶處理，制備紅細(xì)胞體積 10%的兔子紅細(xì)胞懸液；取PHA標(biāo)準(zhǔn)品制 備 1 mg/mL的 PHA標(biāo)準(zhǔn)液，倍比稀釋6次，加等體積兔子紅細(xì)胞懸液，酶標(biāo)法測(cè)定吸光度值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；稱取樣品適量（根據(jù)所需樣品量，即8 g左右為佳）于研缽研磨成漿，以樣品∶PBS液=1∶3的比例加入PBS液，4℃搖床振蕩浸提4 h，取出用Centrifuge 5804R離心機(jī)將菜豆提取液于8 000 r/min、4℃離心20 min，離心制備分離樣品上清液作為待測(cè)液（3份材料重復(fù)操作，得3份待測(cè)液）；加等體積兔子紅細(xì)胞懸液，酶標(biāo)法測(cè)定樣品吸光度，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得出菜豆植物凝集素含量。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析方法

試驗(yàn)數(shù)據(jù)皆通過WPS中Excel表格記錄處理。方差分析時(shí)，采用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)，通過DPS 7.05軟件分析完成，采用Duncan's新復(fù)極差法分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 菜豆種質(zhì)凝集素水平測(cè)定結(jié)果

112份菜豆種質(zhì)植物凝集素含量 （3次重復(fù)均值）如圖1所示。結(jié)果表明，菜豆凝集素總體含量差異較大，含量最高的為18號(hào)（1.607 8 mg/g），最低的是65號(hào)（0.000 3 mg/g）。經(jīng)計(jì)算，112份菜豆種質(zhì)的凝集素含量平均值為0.335 3 mg/g，變異系數(shù)為82.26%。

篩選出3份低凝集素含量的種質(zhì)，分別為65號(hào) （0.000 3 mg/g），58號(hào) （0.001 5 mg/g）和47號(hào)（0.008 2 mg/g）。

2.2 菜豆種質(zhì)凝集素水平方差分析

對(duì)112份菜豆凝集素含量進(jìn)行方差分析的結(jié)果如表1，F(xiàn)值高達(dá)7.65（p<0.01），說明供試菜豆群體內(nèi)種質(zhì)間豆莢所含菜豆凝集素水平差異極顯著。

2.3 菜豆凝集素水平種質(zhì)頻率分布

如112份菜豆植物凝集素含量水平所做的菜豆種質(zhì)頻率分布曲線（圖 2）所示，其總體顯現(xiàn)非連續(xù)性，但主峰明顯，近1/3的菜豆種質(zhì) （35份，占31.25%）凝集素含量分布在均值左右。可見此群體植物凝集素常規(guī)水平在0.335 3 mg/g左右，種質(zhì)間極差很大。極高（1.6 mg/g以上）區(qū)域分布有1份種質(zhì)，極低（0.01 mg/g以下）區(qū)域分布有3份種質(zhì)。

圖1 112份菜豆種質(zhì)凝集素含量

表1 菜豆種質(zhì)間植物凝集素含量差異性分析

3 小結(jié)

本試驗(yàn)以112份菜豆鮮莢為材料，測(cè)定其菜豆凝集素水平，結(jié)果表明，該種質(zhì)群體的菜豆凝集素含量均值為0.335 3 mg/g，種質(zhì)群體內(nèi)植物凝集素含量變幅為 0.000 3～1.607 8 mg/g，變異系數(shù)為82.26%，水平差異極顯著（p<0.01）。種質(zhì)頻率分布曲線表明，有少量極高菜豆凝集素含量的種質(zhì)分布和少量極低菜豆凝集素含量的種質(zhì)分布，并通過比較分析從中篩選出極低植物凝集素水平的菜豆種質(zhì)3份，根據(jù)尚蕊等[5]、任三國(guó)等[6]試驗(yàn)，其菜豆凝集素水平極低與極高的品種分別為 97-5架豆（0.025 mg/g）、Bean Saint Esprit A Oeil Rouge品種（10.850 mg/g）和zyz-4886 （0.005 mg/g）、SJ-0193（1.330 mg/g），而本試驗(yàn)篩選得出，極低凝集素含量水 平 的 種質(zhì) 分別 為 編 號(hào) 65號(hào) 的 SJ-0092（0.000 3 mg/g）、58號(hào)的SJ-0082（0.001 5 mg/g）和47號(hào)（0.008 2 mg/g），最高凝集素含量水平的菜豆品種為SJ-0053（1.607 8 mg/g）?？紤]綜合性狀如熟性、單株莢數(shù)、單莢長(zhǎng)、單莢質(zhì)量等，結(jié)合前期試驗(yàn)已篩選檢測(cè)的177份種質(zhì)，在目前檢測(cè)的289份菜豆種質(zhì)中，篩選得出極低凝集素含量水平的菜豆種質(zhì)SJ-0092和SJ-0082。高凝集素水平方面，未檢測(cè)出超過Bean Saint Esprit A Oeil Rouge品種的種質(zhì)。因此，SJ-0092和SJ-0082或可作為低凝集素水平的菜豆親本，通過與農(nóng)藝性狀優(yōu)異的菜豆品種雜交和回交育種程序，獲得低毒菜豆遺傳改良的機(jī)會(huì)。

圖2 基于植物凝集素含量的種質(zhì)頻率分布曲線

[1]朱吉風(fēng)，武晶，王蘭芬，等.菜豆普通細(xì)菌性疫病抗性基因定位[J].作物學(xué)報(bào)，2017，43（1）：1-8.

[2]王艷，張?jiān)?，陳姍姍，?食莢菜豆氨基酸組成與含量及其品質(zhì)評(píng)價(jià)[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2014，42（8）：156-161.

[3]Van Damme E M,Peumans W J, Barre A,et al．Plant lectins:a composite of several distinct families of structurally and evolutionary related proteins with diverse biological roles[J]. Critical Reviews in Plant Sciences，1998,17(6):575-692．

[4]李明，黃涌，梁戈清，等.一起四季豆食物中毒的調(diào)查研究[J].中國(guó)衛(wèi)生監(jiān)督雜志，1998，5（5）：203.

[5]尚蕊，吳華，郭瑞，等.不同菜豆品種4種抗?fàn)I養(yǎng)因子水平差異分析[J].園藝學(xué)報(bào)，2015，42（11）：2 163-2 173.

[6]李佳楠，楊薇，彭娜，等.菜豆毒性分析及毒性預(yù)測(cè)模型建立[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，48（4）：727-734.

[7]任三國(guó)，陳高，郭瑞，等.121份菜豆品種資源的植物凝集素含量分析[J].江漢大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2016，44（6）：504-508.

Determination and Evaluation of Lectin Contents in Kidney Bean(Phaseolus vulgarisL.)Germplasm Resources

REN Sanguo,CHEN Gao,GUO Rui,CHEN Chanyou
(School of Life Sciences,Jianghan University/Huhei Province Engineering Research Center for Legume Plants/Hubei Natural Science and Technology Resource Center of Legume Plants,Wuhan 430056)

In order to analyze genetic variability,and select germplasm resources with the extremely low content of lectin, 112 kidney beans were took as materials and their lectin contents were determined.The results showed that the mean value of lectin content,amplitude of changes and coefficients of variation (CV)were 0.335 3 mg/g,0.000 3-1.607 8 mg/g and 82.26%respectively,and the differences were extremely significant among the materials(p<0.01).Meanwhile,the frequency distribution curve of 112 kidney beans lectin contens was discontinuous,but there was an obvious peak with long dual-tails,which indicated extremely low or high level of lectin existed in the 112 materials.Furthermore,two materials contained less lectin were screened out from all 289 germplasm resources.The paper provides technical basis for genetic improvement of low toxicity kidney bean.

Kidney bean;Germplasm resources;Lectin

S643.1

：A

：1001-3547（2017）16-0036-03

10.3865/j.issn.1001-3547.2017.16.015

農(nóng)業(yè)部“948”項(xiàng)日（2011-G1-17）；湖北省科技平臺(tái)項(xiàng)日（鄂科技通[2011]第101號(hào)）；湖北省食用豆類植物自然科技資源中心項(xiàng)目（2015BCE091）；武漢市科技攻關(guān)項(xiàng)目（201250499145-11）

任三國(guó)（1993-），男，碩士，研究方向?yàn)橹参锷锘瘜W(xué)，電話：13212764179，E-mail：rensanguo@sina.com

陳禪友（1963-），通訊作者，男，教授，研究方向?yàn)橹参镔Y源與遺傳育種，E-mail：ccy@jhun.edu.cn

2017-05-03