曲古霉素A(TSA)對(duì)人宮頸癌細(xì)胞的殺傷作用

黃鳳華，姚依蘭，馮 閣，舒 暢,張西鋒

(武漢輕工大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院，湖北 武漢 430023)

曲古霉素A(TSA)對(duì)人宮頸癌細(xì)胞的殺傷作用

黃鳳華，姚依蘭，馮 閣，舒 暢,張西鋒

(武漢輕工大學(xué) 生物與制藥工程學(xué)院，湖北 武漢 430023)

研究探討了曲古霉素A(TSA)對(duì)人宮頸癌Hela細(xì)胞的殺傷作用。通過(guò)TSA處理Hela細(xì)胞，利用MTT法、乳酸脫氫酶(LDH)和活化氧(ROS)的檢測(cè)法，以及熒光定量PCR方法等進(jìn)行研究。結(jié)果表明：TSA抑制了細(xì)胞的增殖，增加了細(xì)胞內(nèi)LDH和ROS的產(chǎn)生，促進(jìn)了凋亡相關(guān)基因的表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

曲古霉素A；宮頸癌細(xì)胞；凋亡

1 引言

腫瘤已經(jīng)成為了威脅人類健康的主要疾病之一，其治療難度大，致死率高，給人類生活帶來(lái)嚴(yán)重的負(fù)面影響。發(fā)展中國(guó)家所面臨的形勢(shì)更加嚴(yán)峻，是影響國(guó)內(nèi)居民身體健康的主要疾病，我國(guó)的癌癥病例呈現(xiàn)逐年上升的趨勢(shì)，同時(shí)死亡率也有所增加。宮頸癌對(duì)女性健康的影響不言而喻，癌癥的治療顯得尤為重要，同時(shí)治療方法的改善以及創(chuàng)新都有深遠(yuǎn)的意義。宮頸癌的發(fā)生與基因和表觀遺傳的異常調(diào)控相關(guān)，包括組蛋白H3的磷酸化和乙?；獶NA的低甲基化和抑癌基因的高甲基化[1-2]。其中通過(guò)特異性組蛋白乙?；负腿ヒ阴；傅淖饔?，使組蛋白N末端的乙酰化和去乙?；瑥亩绊懟虻恼{(diào)控[3]。

近年來(lái)，對(duì)組蛋白去乙?；种苿┑难芯咳〉昧艘欢ǖ倪M(jìn)展，為治療腫瘤提供了新的思路和潛在的治療方法。HDAC抑制劑是一類新的有效的HDAC特異性抑制劑，抑制多種癌癥[4-5]。曲古抑菌素A(TSA)是幾種抑制劑之一，當(dāng)與放射治療或化療聯(lián)合使用時(shí)，對(duì)多種癌細(xì)胞都有潛在的治療效果[6-7]。TSA在多種癌細(xì)胞中通過(guò)抑制細(xì)胞活力，激活凋亡相關(guān)蛋白質(zhì)引起細(xì)胞凋亡，包括人胃癌，卵巢癌和小細(xì)胞肺癌細(xì)胞[8-10]。本研究以人宮頸癌Hela細(xì)胞為細(xì)胞模型，探討TSA對(duì)Hela細(xì)胞的殺傷作用，及用于宮頸癌治療的可能機(jī)制。

2 材料與方法

2.1 材料

TSA和細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)試劑購(gòu)自Sigma公司，其它所用試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭籑TT、LDH和ROS檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Beyotime公司，RT-PCR試劑盒購(gòu)自Takara公司。

2.2 儀器與設(shè)備

熒光倒置顯微鏡及顯微圖像分析系統(tǒng) Nikon TE2000U；CO2培養(yǎng)箱 Thermo。

2.3 方法

2.3.1 RT-PCR

RT-PCR的實(shí)驗(yàn)操作參考試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。所用的引物見(jiàn)表1。

表1 引物序列

基因方向引物序列(5’-3’)BaxFGAGAGGTCTTTTTCCGAGTGGRGGAGGAAGTCCAATGTCCAGP53FAGGAAATTTGCGTGTGGAGTATRTCCGTCCCAGTAGATTACCACTBakFCTCAGAGTTCCAGACCATGTTGRCATGCTGGTAGACGTGTAGGGCaspase3FCATACTCCACAGCACCTGGTTARACTCAAATTCTGTTGCCACCTTCaspase9FACTTTCCCAGGTTTTGTTTCCTRGAAATTAAAGCAACCAGGCATCBcl2FCTGAGTACCTGAACCGGCARGAGAAATCAAACAGAGGCCG

2.3.2 細(xì)胞的培養(yǎng)、MTT檢測(cè)、LDH檢測(cè)和ROS檢測(cè)

參照文獻(xiàn)11和文獻(xiàn)12[11-12]進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)和各項(xiàng)檢測(cè)。

3 結(jié)果與分析

3.1 細(xì)胞活力的 MTT檢測(cè)

研究梯度濃度的TSA對(duì)宮頸癌細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用，如圖1所示，TSA的抗腫瘤細(xì)胞活性比較明顯，并且對(duì)于HeLa細(xì)胞50%抑制濃度為100 nM。由此表明TSA可以有效并且明顯地降低宮頸癌細(xì)胞的活性(*P<0.05)。

圖1 Hela細(xì)胞暴露TSA后細(xì)胞活力的檢測(cè)

3.2 TSA對(duì)細(xì)胞內(nèi)LDH和ROS產(chǎn)生的檢測(cè)

檢測(cè)對(duì)照組和處理組細(xì)胞外的LDH含量，在實(shí)驗(yàn)中加入N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine, NAC)和H2O2作為對(duì)照(圖2)。NAC是一種常用的抗氧化劑，H2O2作為活性氧供體。圖2A所示，TSA處理組與對(duì)照組相比，LDH的泄漏量都有所提高(*P<0.05)。在添加NAC的處理組，LDH的泄漏量均有下降，而且只比對(duì)照組的泄漏量略有升高。H2O2處理組的LDH泄漏量是最高的，但是加入NAC后，泄漏量也顯著降低。

在實(shí)驗(yàn)組中活性氧(reactive oxygen species, ROS)的水平檢測(cè)時(shí)，同樣添加NAC和H2O2作為對(duì)照。活性氧是分子氧在參加反應(yīng)過(guò)程中的所產(chǎn)生的一系列的中間產(chǎn)物，其中活性氧包括了以自由基形式存在和不以自由基形式存在的具有高活性的中間產(chǎn)物，比如過(guò)氧化氫(hydrogen peroxide, H2O2)和羥基自由基(hydroxyl radicals,·HO)。

圖2B，TSA處理組與對(duì)照組相比， DCF的熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，ROS有所提高，H2O2處理組的ROS水平是最高的(*P<0.05)。處理組中NAC的有無(wú)對(duì)其結(jié)果有明顯的差異。很顯然的是，NAC會(huì)強(qiáng)烈抑制活性氧的生成，在TSA和H2O2這兩個(gè)處理組中都有明顯的效果。

圖2 TSA對(duì)Hela細(xì)胞內(nèi)LDH和ROS生產(chǎn)的影響

3.3 TSA破壞線粒體膜電位(MMP)和增強(qiáng)Caspase-3活性

在細(xì)胞凋亡的過(guò)程中往往伴隨著線粒體跨膜電位的破壞，這被廣泛認(rèn)為是細(xì)胞凋亡過(guò)程中最早發(fā)生的事件之一。JC-1是線粒體膜電位的檢測(cè)方法之一。凋亡細(xì)胞，線粒體跨膜電位去極化，JC-1從線粒體內(nèi)釋放，濃度降低，逆轉(zhuǎn)為發(fā)射綠色熒光的單體形式。故而可以通過(guò)檢測(cè)綠色和紅色熒光來(lái)定性(細(xì)胞群的偏移)定量(細(xì)胞群的熒光強(qiáng)度)的檢測(cè)線粒體膜電位的變化。加入依托泊苷(Etoposide, ET)作為陽(yáng)性對(duì)照，ET是細(xì)胞周期特異性抗腫瘤藥。HeLa細(xì)胞經(jīng)過(guò)TSA和ET處理24 h后，加入JC-1來(lái)測(cè)定MMP。圖3A中可以看到與對(duì)照組相比，處理組的紅/綠熒光強(qiáng)度比都有所下降，也就是說(shuō)明兩個(gè)處理組細(xì)胞MMP去極化嚴(yán)重。

線粒體釋放出的細(xì)胞色素c會(huì)激活caspase家族的級(jí)聯(lián)反應(yīng)[13]，影響細(xì)胞中caspase-3的水平。在檢測(cè)細(xì)胞中caspase-3的水平時(shí)。加入caspase-3的抑制劑(Z-DEVD)和依托泊苷(Etoposide, ET)作為對(duì)照實(shí)驗(yàn)。由圖3B可以看到不加caspase-3抑制劑的處理組，caspase-3活性都較對(duì)照組有明顯提高。加入caspase-3抑制劑的實(shí)驗(yàn)組結(jié)果都大致相同，caspase-3活性都在一個(gè)較低的水平(*P<0.05)。

圖3 TSA對(duì)MMP和Caspase-3活性的影響

3.4 TSA上調(diào)促凋亡基因的表達(dá)

眾所周知，各種促凋亡和抗凋亡蛋白調(diào)控細(xì)胞死亡通路，通過(guò)檢測(cè)p53 ，Bax， Bak，caspase-3/9以及Bcl2的mRNA水平來(lái)研究細(xì)胞凋亡與TSA處理組之間的聯(lián)系。如圖4，與對(duì)照組相比，處理組中p53， Bax， Bak和， caspase-3/9的mRNA水平均有所上升；同時(shí)處理組中Bcl-2的mRNA水平均下降(P<0.05)。經(jīng)過(guò)處理的HeLa細(xì)胞中caspase3/9的表達(dá)量會(huì)上升，表明TSA誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制和Bcl-2蛋白家族有關(guān)系。

4 結(jié)論與討論

通過(guò)MTT來(lái)研究TSA對(duì)癌細(xì)胞活性的影響，發(fā)現(xiàn)TSA對(duì)細(xì)胞的毒性都有濃度依賴性。對(duì)于HeLa細(xì)胞，TSA50%抑制濃度為100 nM。Vigushin等人研究了TSA對(duì)8種不同乳腺癌細(xì)胞系的抑制活性，發(fā)現(xiàn)TSA的50%抑制濃度在26.4—308.1 nM[14]。Wu等人發(fā)現(xiàn)用低濃度的TSA(0.1—1.0μM)處理HeLa細(xì)胞，在12 h以內(nèi)會(huì)出現(xiàn)輕微促進(jìn)細(xì)胞增殖的情況，接著會(huì)略微抑制細(xì)胞增殖，但即使24 h以后也不會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞死亡。用更高濃度的TSA(1.0 μM和2.0 μM)來(lái)處理細(xì)胞24 h，會(huì)使細(xì)胞的生長(zhǎng)完全受到抑制[15]。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果和上述結(jié)果是一致的，還有研究表明TSA抑制宮頸癌細(xì)胞增殖是不僅有劑量依賴性而且還有時(shí)間依賴性的[16]。

圖4 TSA對(duì)細(xì)胞凋亡相關(guān)基因mRNA表達(dá)量的影響

許多研究表明TSA與其他藥物組合使用會(huì)使抑制細(xì)胞活性的作用得到增強(qiáng)， Yan等人證明了姜黃素(curcumin)和TSA聯(lián)用處理細(xì)胞，有抑制細(xì)胞活性的作用從而加強(qiáng)抗癌效果[17]。還有實(shí)驗(yàn)提到了將5μM的槲皮素和82.5 nM的TSA組合使用，會(huì)有效地提高對(duì)肺癌細(xì)胞A549的細(xì)胞毒性[18]。

有文獻(xiàn)提到原發(fā)性肝星狀細(xì)胞(primary hepatic stellate cell)經(jīng)過(guò)TSA(1,10,100 nM)處理后，LDH的泄漏量會(huì)提高[19]。文獻(xiàn)中提到在白血病、前列腺和宮頸癌細(xì)胞中，組蛋白去乙?；?histone deacetylase, HDAC)抑制劑會(huì)通過(guò)提高細(xì)胞中ROS的水平，從而誘導(dǎo)細(xì)胞死亡[20]。

TSA的抗癌活性是由于激活了必要的信號(hào)通路導(dǎo)致了細(xì)胞的凋亡[21]，Bcl-2蛋白家族在破壞線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential, MMP)和釋放細(xì)胞色素c(cytochrome c)的過(guò)程中有著重要的角色。包括TSA在內(nèi)的HDAC抑制劑通過(guò)增加Bcl2家族的BH3-only的表達(dá)來(lái)破壞細(xì)胞MMP。MMP去極化會(huì)影響細(xì)胞正常的呼吸，并且一般認(rèn)為MMP的下降是細(xì)胞早期凋亡的一個(gè)標(biāo)志，而DNA降解為片段是細(xì)胞凋亡的一個(gè)重要標(biāo)志。

TSA會(huì)下調(diào)Bcl2的表達(dá)量并上調(diào)凋亡相關(guān)基因的表達(dá)量，從而誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡，Bax/Bcl2比例的升高也會(huì)造成MMP下降，同時(shí)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[22]。所以TSA是通過(guò)Bcl2蛋白家族來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

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Cytotoxicity of Trichostatin A on human cervical carcinoma cell

HUANGFeng-hua,YAOYi-lan,FENGGe,SHUChang,ZHANGXi-feng

(School of Biology and Pharmaceutical Engineering, Wuhan Polytechnic University, Wuhan 430023, China)

The aim of this study was to investigate the cytoxicity of Trichostatin A on human cervical carcinoma cell. Hela cells were treated with Trichostatin A, and the methods of MTT, check of Lactate dehydrogenase (LDH) and activated oxygen(ROS), RT-PCR were used for this experiment. The results show that TSA effectively inhibits cell viability, increases the LDH leakage and the fluorescence intensity of ROS, and promotes the expression of apoptosis-related genes, induce cell apoptosis.

trichostatin A; cervical carcinoma cell;apoptosis

2017-05-04.

黃鳳華(1990-)，女，碩士研究生，E.mail:867134498@qq.com.

張西鋒(1977-)，男，博士，副教授，E.mail:zhangxf9465@163.com.

國(guó)家自然科學(xué)基金(B020704).

2095-7386(2017)02-0036-05

10.3969/j.issn.2095-7386.2017.02.007

R 737.11

A