雷竹筍蛋白的雙向電泳分析

潘雁紅，楊慧敏，吳良如，高貴賓，鐘 浩

(1.國家林業(yè)局竹子研究開發(fā)中心，浙江 杭州 310012； 2.浙江省竹子高效加工重點實驗室，浙江 杭州 310012)

雷竹筍蛋白的雙向電泳分析

潘雁紅1,2，楊慧敏1,2，吳良如1,2，高貴賓1,2，鐘 浩1,2

(1.國家林業(yè)局竹子研究開發(fā)中心，浙江 杭州 310012； 2.浙江省竹子高效加工重點實驗室，浙江 杭州 310012)

以雷竹筍為材料，采用改良TCA-酚法提取竹筍總蛋白，Bradford法測定其質(zhì)量濃度為7.865 g·L-1，上樣量為1 500 μL，采用pH 3～10線性IPG預(yù)制膠條(24 cm)進行了總蛋白的雙向電泳實驗，并用PDquest 8.0軟件分析了凝膠圖譜。結(jié)果表明，雷竹筍的蛋白點數(shù)共有812個，等電點主要集中在pH 9～10，以堿性蛋白為主，占71.67%；相對分子質(zhì)量主要集中在45～116 kDa范圍內(nèi)，占60.59%。與相同提取方法和電泳條件的毛竹冬筍的總蛋白雙向電泳相比，其相對分子質(zhì)量的分布范圍相似，不同的是，雷竹筍以堿性蛋白為主，而毛竹冬筍酸性蛋白卻多于堿性蛋白；兩者表達差異量超過2倍的蛋白點有180個，其中上調(diào)表達75個，下調(diào)表達105個，差異大。

雷竹；竹筍蛋白；雙向電泳

雷竹(Phyllostachyspraecox) 是禾本科竹亞科剛竹，屬早竹的變種，是中國特有的優(yōu)良筍用竹種。竹筍是竹鞭或稈基上的芽萌發(fā)分化而成的膨大的芽和幼嫩的莖，據(jù)分析，每100 g雷竹鮮筍的粗蛋白(凱氏定氮法)為2.74 g[1]，可溶性蛋白(Bradford法)為2.95 g[2]，是蛋白含量較高的蔬菜之一。

近年來，對雷竹筍的研究主要集中在次生代謝產(chǎn)物黃酮類、萜類、生物堿類、醌類、木脂素類化合物，以及揮發(fā)性成分、酚酸和它們的衍生物等，而對其含量最豐富的初級代謝產(chǎn)物的蛋白或肽類成分研究極少。

從植物的蛋白質(zhì)類成分中尋找新的藥物是今后一個重要的發(fā)展方向，藥用活性蛋白(多肽)的開發(fā)是國內(nèi)外的研究熱點。已有的研究表明，植物蛋白具有具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗菌、抗病毒等多方面的生物活性，如靈芝蛋白、白果清蛋白、天花粉蛋白等，特別是蛋白的酶解產(chǎn)物多肽的藥用活性非常強，如從枸杞降血壓肽、鹿萁免疫調(diào)節(jié)肽等[3]。Wang等[4]利用色譜層析的方法從麻竹筍中得到抗真菌蛋白；Masatoshi等[5]利用親和色譜從毛竹筍中分離出2種抗菌肽Pp-AMP1和 Pp-AMP2；林倩等[6]選用Protamex和Papain兩種蛋白酶對毛竹筍蛋白同步復(fù)合酶解，得到多肽BSPs和BSP-IV的抗氧化活性的強于大豆肽和花生肽。

天然存在的竹筍蛋白種類繁多、結(jié)構(gòu)復(fù)雜。不同基源品種的竹筍蛋白具有不同的譜帶模式即差異性蛋白成分；相同基源品種的竹筍在其不同發(fā)育時期，蛋白在表達上也存在差異。大多數(shù)的蛋白質(zhì)在植物細胞內(nèi)的含量極低，低豐度蛋白質(zhì)反而更具有研究意義。

雙向電泳(two-dimensional electrophoresis, 2-DE)仍是目前分離蛋白的最有效方法，利用蛋白質(zhì)的等電點和分子量的不同，并通過等電聚焦電泳(isoelectric focusing，IEF)和十二烷基苯磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)兩次電泳分離蛋白質(zhì)[7]。雙向電泳所得的蛋白質(zhì)二維排列圖中的每一點都代表樣品中的一種或幾種蛋白質(zhì)，據(jù)此，分離出數(shù)千種蛋白質(zhì)，并且各種蛋白質(zhì)的等電點、分子量和含量等信息均可同時顯示出來[8]，并結(jié)合基于MALDI或ESI的質(zhì)譜技術(shù)進行蛋白質(zhì)的鑒定。

本研究以雷竹筍為材料，對其進行了總蛋白的提取及雙向電泳實驗，通過PDquest軟件分析，得到了竹筍蛋白的等電點和分子量的分布情況，然后進一步與毛竹筍的總蛋白雙向電泳圖進行了比較，為竹筍蛋白的分離純化、開發(fā)利用、蛋白質(zhì)組學(xué)的研究提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試竹筍 雷竹筍(覆蓋雷竹筍)2014年12月21 日采自杭州市余杭區(qū)徑山鎮(zhèn)。

1.1.2 主要儀器設(shè)備 分光光度儀(UV1800型，美譜達儀器公司)；IPGhor等電聚焦儀(GE Healthcare)；超聲細胞破碎儀(浙江新芝)；電泳儀(DALT-SIX SDS-PAGE，GE Healthcare)；Ettan-DALT-Six系統(tǒng)水浴循環(huán)儀；Image Scanner 掃描儀(GE Healthcare)。

1.1.3 主要試劑與試劑盒 ImmobilineTM DryStrip pH3-10 NL，24 cm(GE)、IPG Buffer pH 3-10 NL (GE)、尿素(AR)、硫脲(AR)、二硫蘇糖醇(AR)、3-[(3-膽酰胺丙基)-二乙胺]-丙磺酸(AR)、溴酚藍(AR)、碘乙酰胺 (AR)、十二烷基磺酸鈉 (AR)、丙烯酰胺 (AR)、甲叉雙丙烯酰胺(AR)、過硫酸銨(AR)、TEMED(AR)、甘氨酸(AR)、乙醇(AR)、冰醋酸(AR)、2D電泳樣品提取緩沖液系列(上海生工PL039)、2D Equilibration Buffer(上海生工SD6030)、無毒型蛋白質(zhì)快速染色試劑盒(上海生工SK3011)、Bradford法蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒(上海生工SK3031)。

1.2 方法

1.2.1 樣品總蛋白提取

采用改良TCA-酚法提取竹筍的總蛋白。取出冷凍的樣品，加入液氮，并充分研磨。按照1∶10的比例加入預(yù)冷的TCA(10%)的丙酮，沉淀1 h(-20 ℃)。在4 ℃下，15 000g離心15 min，取出沉淀，再加入預(yù)冷丙酮，沉淀1 h(-20 ℃)。重復(fù)上述步驟一次。15 000g離心15 min后(4 ℃)，取沉淀，進行真空冷凍干燥。將干燥后的固體加入到酚抽提液(0.7 M蔗糖，0.1 M KCl，0.5 M Tris-HCl(pH 7.5)，50 mM EDTA，0.2% DTT)混合。用等體積的酚-Tris-HCl(pH 7.5)飽和溶液在4 ℃下混合30 min。5 000g離心30 min(4 ℃)，收集酚上層。然后，加入等體積的酚抽提液，重復(fù)以上步驟，得到酚上層。加入預(yù)冷0.1 mol·L-1醋酸銨-甲醇溶液(5倍體積)，-20 ℃沉淀1 h。在4 ℃下，5 000g離心30 min，收集沉淀。按照前面酚抽提液的比例，加入2倍體積的預(yù)冷甲醇以清洗，輕微混合。5 000g離心10 min(4 ℃)，得到沉淀。重復(fù)以上步驟3次，來充分去除酚和其它雜質(zhì)。用丙酮代替甲醇重復(fù)以上步驟3次，甲醇被充分去除。4 ℃，5 000g離心10 min，收集沉淀。將干燥后的粉末溶解液于樣品裂解液中，充分溶解蛋白(30 ℃恒溫水浴溶解1 h)。將溶液于室溫下離心15 min(15 000g)，取上清液，并再次離心取上清液，除去不溶雜質(zhì)，該上清液即為毛竹筍的總蛋白溶液。

1.2.2 蛋白定量

采用Bradford法蛋白質(zhì)濃度(上海生工)測定試劑盒(SK3031)測定竹筍總蛋白的濃度，并以牛血清蛋白(BSA)為標(biāo)準蛋白。

1.2.3 雙向電泳

1.2.3.1 IEF 蛋白上樣量：蛋白上樣量為1 500 μg，用 pH 3-10 NL IPG預(yù)制干膠條進行第一向等電聚焦。50 V預(yù)電泳12 h后，正式電泳條件為500 V 1 h，1 000 V 1 h，1 000～10 000 V 1 h，10 000 V 11 h。

1.2.3.2 膠條平衡 將聚焦完成的膠條加 2D Equilibration Buffer(加1% DTT)10 mL，并搖動平衡15 min。清洗膠條后，加入2D Equilibration Buffer(加2.5% IAA)，搖動平衡15 min。

1.2.3.3 SDS-PAGE 將平衡后的膠條放入凝膠板后，同時加入低熔點瓊脂糖封膠液(0.5%低熔點瓊脂糖+電泳緩沖液)，室溫靜置 20 min，結(jié)束后，開始第二向電泳。第二向SDS-PAGE 凝膠濃度為12.5%，其電泳參數(shù)設(shè)定為：100 V·膠-1，電泳45 min；200 V·膠-1，至溴酚藍離膠下沿0.5 cm 處停止；設(shè)定冷循環(huán)溫度為15 ℃。電泳結(jié)束后，取出凝膠并進行染色。

1.2.3.4 凝膠染色 采用考馬斯亮藍染色法，具體操作如下：固定時間為2 h，考馬斯亮藍染色 12 h，用水洗背景使其清晰。

圖1 牛血清白蛋白的標(biāo)準曲線Fig.1 The standard curve of BSA

1.2.3.5 凝膠圖像掃描 采用ImageScanner 掃描儀掃描染色好的聚丙烯酰胺凝膠，分辨率為300 dpi。然后，用 PDquest 8.0軟件對電泳圖譜進行蛋白點的檢定、匹配與編輯、數(shù)據(jù)分析和輸出，計算出蛋白點的等電點、相對分子質(zhì)量、標(biāo)注毛竹筍總蛋白的表達差異點與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白定量

用紫外分光光度計測定標(biāo)準品溶液在595 nm處的吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，蛋白濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準曲線，結(jié)果如圖1所示。

圖2 雷竹筍總蛋白雙向電泳圖譜Fig.2 The 2-DE profile of total protein of bamboo shoots of Phyllostachys praecox

通過測定不同濃度牛血清蛋白的吸光度得到的線性回歸方程式為y=0.097 2x+0.064 1，R2=0.999 6。雷竹筍總蛋白稀釋1倍后測得的的吸光度分別為0.445、0.449和0.445，平均吸光度為0.446，計算得到的蛋白質(zhì)量濃度為3.932 g·L-1，故雷竹筍總蛋白的實際質(zhì)量濃度為7.865 g·L-1。

2.2 蛋白雙向電泳

雷竹筍總蛋白的雙向電泳圖譜如圖2所示，經(jīng)PDquest 8.0 軟件分析，共分離出約812個蛋白點。

2.3 不同等電點范圍的蛋白點數(shù)

雷竹筍總蛋白的雙向電泳圖譜上各不同等電點范圍內(nèi)的蛋白點數(shù)目如圖3所示。結(jié)果表明，竹筍蛋白分布在pH 3～10范圍內(nèi)，主要集中在pH 9～10；pH 7以下的蛋白點數(shù)為230個，占28.33%；pH 7以上的蛋白點數(shù)有582個，占71.67%；以堿性蛋白為主。

2.4 不同相對分子質(zhì)量范圍的蛋白點數(shù)

雷竹筍總蛋白的雙向電泳圖譜上各不同相對分子質(zhì)量范圍內(nèi)的蛋白點數(shù)目見圖4。由圖4可知，竹筍蛋白的分子量分布在11～120 kDa，蛋白點的相對分子質(zhì)量分布以45～116 kDa為峰并呈偏態(tài)分布，即竹筍蛋白主要集中在45～116 kDa范圍內(nèi)，占60.59%。

圖3 雷竹筍蛋白雙向電泳凝膠中不同等電點范圍的蛋白點數(shù)Fig.3 The isoelectric point distribution of protein spots in 2-DE gel of bamboo shoots of Phyllostachys praecox

圖4 雷竹筍蛋白雙向電泳凝膠中不同相對分子質(zhì)量分布范圍的蛋白點數(shù)Fig.4 The protein spots for various molecular mass in 2-DE gel of bamboo shoots of Phyllostachys praecox

2.5 與毛竹筍2-DE圖譜的蛋白表達差異分析

將雷竹筍2-DE圖譜與同一天采集的同屬剛竹屬采用相同蛋白提取方法和相同電泳條件的毛竹冬筍的2-DE圖譜[9]，利用PDquest 8.0 軟件進行蛋白的比較和差異分析，結(jié)果見圖5。毛竹筍的蛋白點數(shù)有1 014個，等電點主要集中在pH 6.0～7.0范圍，而雷竹筍則主要集中在pH 9～10，以堿性蛋白為主，兩者蛋白點分子量均集中在45～116 kDa范圍。若將強度差異倍數(shù)大于2的蛋白質(zhì)點視為表達有差異，兩者存在表達差異的蛋白點有180個，其中上調(diào)表達75個，下調(diào)表達105個。可見，兩者雖同屬剛竹屬，但其筍蛋白的差異性很大。

圖5 雷竹筍和毛竹筍差異顯著蛋白點的2-DE標(biāo)注圖Fig.5 2-DE labeling maps of significantly different proteins of Phyllostachys praecox and Phyllostachys edulis

3 討論

蛋白質(zhì)樣品的提取為得到高清晰雙向電泳的第一步，其效果的好壞直接影響蛋白質(zhì)的分離和結(jié)果的可靠性。因此，提高蛋白質(zhì)樣品的制備質(zhì)量是非常重要的。本研究采用改良TCA-酚法提取雷竹筍的總蛋白，TCA可以有效地抑制蛋白酶對蛋白質(zhì)的水解作用，具有降低次生代謝物質(zhì)的干擾、減少蛋白降解等優(yōu)點[10]；丙酮溶液可以除去樣品中的酚類和色素等干擾物質(zhì)，同時高速離心辦法能較好地去除多糖的影響；抽提蛋白至酚相中，而干擾物質(zhì)，如酚類物質(zhì)、多糖、核酸、鹽離子等則存在于水相中，采用多次離心去除水相中的雜質(zhì)，而酚相中的蛋白也得到了純化和濃縮；與此同時，酚能使蛋白水解酶失活，從而阻止了蛋白質(zhì)的降解。Bradford法測定改良TCA-酚法提取的毛竹冬筍總蛋白濃度為9.470 g·L-1，這表明提取效果較佳。

樣品制備的目的是將樣品中的蛋白質(zhì)完全溶解、變性、分離和還原[11]。為得到蛋白雙向電泳的最佳的清晰度和分辨率，須使樣本蛋白處于變性狀態(tài)，變性劑尿素可打開蛋白的三維結(jié)構(gòu)，暴露出蛋白的電荷使其易于溶解；洗滌劑40 g·劑-13-[(3-膽酰胺丙基)-二乙胺]-丙磺酸(CHAPS)保證蛋白完全溶解，防止了蛋白通過疏水基團的相互作用而聚集；用還原劑0.2% DTT裂解雙硫鍵，并使樣品蛋白處于完全還原狀態(tài)；在室溫下，樣品保持溶解 30 min以上，以達到蛋白的充分變性與溶解；固定pH梯度緩沖液(20 g·劑-1IPG Buffer)可提高蛋白的溶解度，防止蛋白通過所帶電荷互相聚集。本實驗得到的雷竹筍蛋白的雙向凝膠電泳圖譜效果較好，具有背景清晰，分辨率高，重復(fù)性好，分離出的蛋白點數(shù)量多等優(yōu)點。

本研究采用pH 3～10的寬范圍的線性IPG預(yù)制膠條，可以在同一塊凝膠上顯示雷竹筍蛋白的整體分布。雷竹筍總蛋白在pH 3～10都有分布，但主要集中在pH 9～10，以堿性蛋白為主，這與Ong等[12]報道的生物中大部分蛋白的等電點在pH 4～8之間的結(jié)果不一致，顯示了雷竹筍蛋白的獨特性。雷竹筍蛋白的分子量主要為45～116 kDa之間，與毛竹筍的分布范圍相似，非常適合用低蛋白吸附的切向流超濾的方法進行竹筍蛋白的提取和純化。

與同屬剛竹屬的毛竹冬筍的蛋白表達圖譜相比，蛋白總數(shù)，酸性、中性、堿性蛋白種類和含量均表現(xiàn)出較大的差異性，雷竹筍主要以堿性蛋白為主，毛竹筍雖以酸性蛋白為多，但堿性蛋白含量也比其他生物的高。該研究揭示了竹筍蛋白種類的豐富性和多樣性特征，為今后進一步探究竹筍蛋白的生物活性組分奠定基礎(chǔ)。

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Two-dimensional Electrophoresis Analysis of Bamboo Shoot Protein ofPhyllostachyspraecox

PAN Yan-hong1,2, YANG Hui-min1,2，WU Liang-ru1,2，GAO Gui-bin1,2，ZHONG Hao1,2，YE Xiao-dan1,2

(1.China National Bamboo Research Center, Hangzhou 310012，Zhejiang, China；2.Key Laboratory of High Efficient Processing of Bamboo of Zhejiang Province, Hangzhou 310012，Zhejiang, China)

The total protein of bamboo shoots inPhyllostachyspraecoxwas extracted by the improved TCA-phenol method, and its content was 7.865 g·L-1as detected by Bradford method. Two-dimensional electrophoresis was carried out with 1500μg loading amount on 24 cm linear IPG strips at pH 3-10. Then, the Gel image was analyzed with PDquest 8.0 software. The results showed the bamboo shoots had 812 protein spots. The isoelectric points mainly concentrated in pH 9-10, and the basic protein accounted for 71.67%. Their relative molecular mass mainly ranged 45-116 kDa, and accounted for 60.59%. In comparison with Moso bamboo shoots with the same extraction method and electrophoresis conditions, the range of relative molecular mass was similar. The bamboo shoots ofPhyllostachyspraecoxcontained mainly alkaline protein, and that of Moso bamboo had more acid protein than the basic one. The number of protein spots of expression differences being more than 2 times amounted to 180. Of which, 75 protein spots were up-regulated and 105 were down-regulated. The difference betweenPhyllostachyspraecoxand Moso bamboo shoots was great.

Phyllostachyspraecox; Protein of bamboo shoots; Two-dimensional gel electrophoresis

2015-11-06

“十三五”國家重點研發(fā)計劃課題(2016YFD0600903)；國際合作項目(PRSD-026-13)；“十二五”浙江省農(nóng)業(yè)重大成果轉(zhuǎn)化工程項目(2012T201-05)； 科研院所省級重點實驗室建設(shè)(2014F10047)

潘雁紅，碩士，工程師，從事竹林培育及竹資源食品研究。通信作者：吳良如，副研究員，從事筍(竹)資源高值利用研究。E-mail: boteatree@163.com