抗菌肽在大腸桿菌中的融合表達(dá)策略

楊勇+金德俊+余維維

摘要：抗菌肽抗菌譜廣、活性穩(wěn)定，具有與抗生素不同的抗菌機(jī)制，在抑殺病原微生物的同時(shí)不易產(chǎn)生耐藥性，在免疫調(diào)節(jié)和抗感染方面具有巨大的發(fā)展?jié)摿Γ軌虬l(fā)展為取代抗生素的新型藥劑，在食品、飼料、畜禽養(yǎng)殖等領(lǐng)域也具有重要的應(yīng)用價(jià)值?；蚬こ碳夹g(shù)是降低抗菌肽生產(chǎn)成本的主要方式，其中融合表達(dá)在提高抗菌肽產(chǎn)量方面起到了重要作用。綜述了抗菌肽在大腸桿菌中融合表達(dá)的國(guó)內(nèi)外研究進(jìn)展，探討了抗菌肽在大腸桿菌中融合表達(dá)的策略，并對(duì)高通量融合表達(dá)抗菌肽提出了建議。

關(guān)鍵詞：抗菌肽；大腸桿菌；基因工程；融合表達(dá)；高通量

中圖分類(lèi)號(hào)：Q78 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2017）15-2801-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.15.001

Abstract： Antimicrobial peptides have a wide antimicrobial spectrum and stable activity， with different antibacterial mechanisms from antibiotics， they result in a higher efficacy against pathogens. At the same time， they're difficult to form drug resistance. Antimicrobial peptides have great development potential in immune regulation and anti-infection， so they're able to develop new agents， to replace antibiotics. Besides， they have immense applied value in food， forage， poultry breeding and so on. Genetic engineering is the main way to reduce the production costs in antimicrobial peptides， furthermore， the fusion expression plays a important role in improving production. In this paper， we summarized the research progress of antimicrobial peptides' fusion expression in E. coli， at home and abroad. Also， the fusion strategy in E. coli are discussed， and we proposed our own view on the high flux fusion expression of antimicrobial peptides.

Key words： antimicrobial peptides； Escherichia coli； genetic engineering； fusion expression； high-throughput

真菌、細(xì)菌對(duì)抗生素的耐藥性引起了全世界范圍的普遍擔(dān)憂，導(dǎo)致巨大的財(cái)力、物力花費(fèi)在尋找新型抗生素上，但效果甚微[1]。一些抗生素對(duì)普通的感染作用效果差，引起大眾對(duì)不可治愈的恐慌[2]?，F(xiàn)在大量的研究者從事于抗生素的耐藥性機(jī)理的研究，但是由于缺乏協(xié)調(diào)行動(dòng)，進(jìn)展非常緩慢[3]。目前的形勢(shì)需要開(kāi)發(fā)出抗生素的替代品。

抗菌肽是動(dòng)物、植物等生物體免疫系統(tǒng)防御外來(lái)真菌、細(xì)菌等病原微生物入侵而合成的一類(lèi)小分子多肽類(lèi)物質(zhì)[4，5]?？咕囊话阌?0～60個(gè)氨基酸組成，其中接近一半是親水性氨基酸，帶有一定量的正電荷，能夠直接攻擊或破壞細(xì)菌、真菌的細(xì)胞膜或病毒的包膜。不同于抗生素作用于酶或DNA，抗菌肽能夠阻礙產(chǎn)生耐藥性，并且對(duì)熱穩(wěn)定，一些抗菌肽100 ℃加熱10 min仍有活性，有較寬的pH耐受范圍[6]。加熱抗菌肽抗菌譜廣，活性穩(wěn)定，并且不會(huì)對(duì)人及其所生存的環(huán)境產(chǎn)生危害，綠色環(huán)保?；谶@些優(yōu)點(diǎn)，激發(fā)了廣大科研人員的興趣，科研人員已經(jīng)對(duì)抗菌肽的作用機(jī)制、安全性進(jìn)行了深入研究，并且提供了抗菌肽在線更新數(shù)據(jù)庫(kù)（APD，http：//aps.unmc.edu/AP/）服務(wù)[6，7]。已經(jīng)有2 000多種抗菌肽被分離出來(lái)[8]，其中，部分已經(jīng)用于醫(yī)藥、食品及畜禽水產(chǎn)養(yǎng)殖等領(lǐng)域[9]。

盡管在抗菌肽的研究領(lǐng)域已經(jīng)取得豐碩的成果，但由于生產(chǎn)成本居高不下，難以投入工業(yè)化生產(chǎn)和商業(yè)化運(yùn)營(yíng)。大量高純度的抗菌肽是開(kāi)展基礎(chǔ)研究及臨床實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵。天然來(lái)源的抗菌肽資源有限、純化困難，化學(xué)合成抗菌肽成本高、活性不穩(wěn)定，因此通過(guò)基因重組來(lái)表達(dá)得到大量抗菌肽是低成本、高效益的方法[10]。

1 抗菌肽表達(dá)系統(tǒng)

1.1 昆蟲(chóng)表達(dá)系統(tǒng)

廣泛使用的真核表達(dá)系統(tǒng)，趙昆等[11]實(shí)現(xiàn)?？咕腂ac7-Bac5-β defense串聯(lián)基因在昆蟲(chóng)桿狀病毒系統(tǒng)中的表達(dá)。昆蟲(chóng)具有一般真核生物翻譯后修飾的功能，且表達(dá)水平高，成本低，但是翻譯后加工修飾操作繁瑣。

1.2 畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)

另一個(gè)常用的真核表達(dá)系統(tǒng)為畢赤酵母。同昆蟲(chóng)一樣具有完備的翻譯后修飾的功能，目前已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了多種抗菌肽在其中的表達(dá)，如孫立人等[12]試驗(yàn)斑點(diǎn)叉尾鮰LEAP-2抗菌肽在畢赤酵母中的表達(dá)，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，表達(dá)產(chǎn)量在上升，當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)120 h后產(chǎn)量達(dá)到2.7 mg/L（最高值）。Farzana等[13]利用pPIC9K表達(dá)載體實(shí)現(xiàn)了人類(lèi)抗菌肽hpcidin在畢赤酵母中的分泌表達(dá)及純化和功能驗(yàn)證，并且表達(dá)量穩(wěn)定在3 mg/L。畢赤酵母中存在表達(dá)水平低，發(fā)酵周期長(zhǎng)，易污染等問(wèn)題[14]。endprint

1.3 大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)

大腸桿菌遺傳圖譜清楚，易培養(yǎng)，周期短，對(duì)許多蛋白質(zhì)都有一定的耐受能力，在較短的時(shí)間內(nèi)可以高水平地表達(dá)多種蛋白，發(fā)酵條件易掌控，但是缺乏像酵母等真核系統(tǒng)翻譯后修飾加工功能，所表達(dá)的產(chǎn)物生物活性較低[15]。然而抗菌肽都是一些小肽類(lèi)分子，不需要翻譯后修飾等過(guò)程，因此大腸桿菌是抗菌肽首選的表達(dá)系統(tǒng)。

2 抗菌肽在大腸桿菌中的融合表達(dá)

抗菌肽分子小，直接表達(dá)不僅對(duì)宿主具有毒殺作用，而且極易被一些蛋白酶水解，因此難以獲得具有天然活性的抗菌肽。為了解決這個(gè)問(wèn)題，目前普遍采用的是在抗菌肽的N端接入一個(gè)可以在大腸桿菌中表達(dá)的蛋白質(zhì)，進(jìn)行融合表達(dá)，然后通過(guò)化學(xué)試劑處理或添加酶處理除去載體蛋白，進(jìn)一步分離提純，就可以獲得高產(chǎn)的抗菌肽[16]。

2.1 融合蛋白標(biāo)簽

載體蛋白的功能是避免抗菌肽被蛋白酶降解和對(duì)宿主產(chǎn)生毒殺作用，現(xiàn)在抗菌肽在大腸桿菌的融合表達(dá)的主要載體蛋白可以分為四大類(lèi)：增強(qiáng)可溶性的融合標(biāo)簽，促進(jìn)包涵體形成的融合標(biāo)簽，可自我剪切的融合標(biāo)簽，信號(hào)肽類(lèi)的融合標(biāo)簽[17]。本文綜述了一些常用的融合標(biāo)簽及其表達(dá)策略。

2.1.1 增強(qiáng)可溶性的融合標(biāo)簽

1）谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（GST）融合標(biāo)簽。GST可以在大腸桿菌融合表達(dá)中穩(wěn)定存在，可以迅速通過(guò)固定了谷胱甘肽的色譜柱從溶菌后的混合液中分離，非變性的條件下10 mmol/L的還原型谷胱甘肽洗脫獲得GST—抗菌肽融合蛋白[18]。融合蛋白通過(guò)位點(diǎn)專(zhuān)一的蛋白酶如凝血酶或Xa-因子切除GST部分，獲得目的蛋白。歐陽(yáng)萍等[19]將人溶菌酶和抗菌肽tachyplesins融合基因克隆至帶有GST標(biāo)簽的原核表達(dá)載體pGEX-4T-1上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3），IPTG 誘導(dǎo)表達(dá)，并對(duì)表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化，純化融合蛋白純度達(dá)90%。由于GST標(biāo)簽有助于保護(hù)重組蛋白免受胞外蛋白酶的降解，提高其穩(wěn)定性、可溶性，并且通過(guò)親和層析簡(jiǎn)化后續(xù)的純化工作，所以抗菌肽同GST標(biāo)簽融合表達(dá)將顯著提高其表達(dá)量、降低生產(chǎn)成本。但是由于GST融合標(biāo)簽過(guò)大（27KD），而抗菌肽分子小，二者相比質(zhì)量差距大，GST會(huì)影響抗菌肽的表達(dá)產(chǎn)量[20]。

2）硫氧還蛋白（thioredoxin）融合標(biāo)簽。硫氧還蛋白是比GST更常用的融合表達(dá)標(biāo)簽，分子量為17 KD，不僅可以避免重組蛋白被蛋白酶降解，還可以促進(jìn)重組蛋白內(nèi)二硫鍵的形成，加工成更高穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)[21]。硫氧還蛋白沒(méi)有專(zhuān)門(mén)的親和介質(zhì)可以用于分離提純，因此在抗菌肽融合表達(dá)時(shí)，需要與一些親和標(biāo)簽進(jìn)行聯(lián)合。Alem等[22]利用硫氧還蛋白融合標(biāo)簽和His親和標(biāo)簽在大腸桿菌系統(tǒng)中成功融合表達(dá)并分離得到了來(lái)自青莧中的Aq抗菌肽，表達(dá)產(chǎn)量為38 mg/L。Krahulec等[23]成功融合表達(dá)了Trx—LL—37融合蛋白，1 g融合蛋白/每升培養(yǎng)液，最終高效液相色譜檢測(cè)純化的人源抗菌肽LL37的含量為37 mg/L，功能檢測(cè)顯示對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌都有很好的抑菌活性。Gagliardo等[24]在融合表達(dá)鐵調(diào)素（一種肝抗菌肽）時(shí)驗(yàn)證，采用硫氧還蛋白作為融合蛋白標(biāo)簽時(shí)應(yīng)該采用低溫誘導(dǎo)的方式發(fā)酵，這樣能夠協(xié)助抗菌肽的可溶性表達(dá)。

3）小分子泛素樣修飾蛋白（SUMO）融合標(biāo)簽。SUMO大約由100個(gè)氨基酸組成，類(lèi)似于泛素但功能完全不同，是新發(fā)展起來(lái)的一類(lèi)融合表達(dá)標(biāo)簽。SUMO可以用于難以表達(dá)的蛋白質(zhì)的融合表達(dá)，可抗蛋白酶水解，引導(dǎo)目標(biāo)蛋白的正確折疊，增強(qiáng)融合蛋白的可溶性[25]。LI等[26]成功融合表達(dá)了SUMO—CM4，NI柱親和層析獲得每升112 mg的融合蛋白，經(jīng)SUMO蛋白酶處理后，可以獲得24 mg/L的CM4，功能檢測(cè)同天然CM4抗菌肽一樣具有良好的抑菌活性。由于SUMO蛋白酶用于分離提純，使得融合表達(dá)的成本升高，限制了SUMO的應(yīng)用，姜媛媛等[27]設(shè)計(jì)了高效可溶性表達(dá)重組蛋白的載體，即His-SUMO和目的序列之間加入羥胺切割位點(diǎn)在His—SUMO中表達(dá)的融合蛋白用Ni-NTA純化，羥胺液切割后可獲得僅留一個(gè)甘氨酸殘基的重組蛋白。

2.1.2 促進(jìn)包涵體形成的融合標(biāo)簽 蛋白質(zhì)除了使用增強(qiáng)可溶性的蛋白標(biāo)簽實(shí)現(xiàn)高效表達(dá)，后通過(guò)親和純化，切除融合蛋白標(biāo)簽而獲得蛋白質(zhì)，也可以使目標(biāo)蛋白質(zhì)積聚在包涵體內(nèi)進(jìn)行表達(dá)。這種表達(dá)策略也應(yīng)用到了抗菌肽領(lǐng)域，包涵體表達(dá)抗菌肽能夠保護(hù)抗菌肽被蛋白酶降解。在這一類(lèi)抗菌肽融合標(biāo)簽中主要有類(lèi)固醇異構(gòu)酶、Purf片段、PaPer3.30、TAF12組蛋白[28]。Kim等[29]利用PurF片段實(shí)現(xiàn)了抗菌肽histonin包涵體形式的高表達(dá)，在其表達(dá)系統(tǒng)內(nèi)，可以獲得167 mg/L大腸桿菌發(fā)酵液。

為了獲得抗菌肽單品，需要收集包涵體，可能會(huì)破碎細(xì)胞壁，細(xì)胞內(nèi)容物流出影響分離純化，需要經(jīng)歷變性、復(fù)性等過(guò)程，操作繁瑣，并且收率較低，因此目前多使用可溶性表達(dá)，較少考慮包涵體形式表達(dá)。

2.1.3 可自行切割的融合標(biāo)簽 內(nèi)含肽是前體未成熟的蛋白質(zhì)中一條多肽鏈，又稱(chēng)作內(nèi)含子蛋白質(zhì)，可以通過(guò)內(nèi)含肽的自我剪接作用使得蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生重排，也利用內(nèi)含肽的這一作用開(kāi)發(fā)出眾多的親和純化系統(tǒng)，較其他的親和純化標(biāo)簽簡(jiǎn)單，通過(guò)改變溫度、pH或加入如巰基乙醇類(lèi)化學(xué)試劑即可體外自我剪接，獲得除去融合蛋白標(biāo)簽的抗菌肽[30-32]。Coolbaugh等[33]利用幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域（CBD）親和標(biāo)簽和基于彈性蛋白樣多肽親和標(biāo)簽（ELP）實(shí)現(xiàn)了β半乳糖苷酶和超折疊綠色熒光蛋白的高通量表達(dá)純化。Xie等[34]利用內(nèi)含肽融合表達(dá)系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)了OG—2的高產(chǎn)量表達(dá)，是目前最好的高產(chǎn)量?jī)?nèi)含肽融合表達(dá)系統(tǒng)。

2.1.4 信號(hào)肽類(lèi)的融合標(biāo)簽 信號(hào)肽能夠引導(dǎo)蛋白質(zhì)正常折疊，在分泌表達(dá)時(shí)常引入信號(hào)肽增強(qiáng)分泌表達(dá)，表達(dá)后，信號(hào)肽會(huì)被切除，原保留在蛋白質(zhì)N端的甲硫氨酸也會(huì)切除，這樣的蛋白質(zhì)不用因?yàn)榫邆涿庖咴远枰偾谐?。大腸桿菌中常用的信號(hào)肽有OmpA、PelB、PhoA、HlyA、cherry等[35]。Lee等[36]用OmpA實(shí)現(xiàn)了扁口魚(yú)鐵調(diào)素Ⅰ的可溶性表達(dá)。這一類(lèi)融合標(biāo)簽?zāi)壳坝玫暮苌?。endprint

2.2 親和純化標(biāo)簽

上述提到的GST、內(nèi)含肽等融合蛋白標(biāo)簽自身可以作為親和介質(zhì)作用的親和標(biāo)簽。另一個(gè)重要的標(biāo)簽是聚組氨酸標(biāo)簽。組氨酸標(biāo)簽是大腸桿菌表達(dá)重組蛋白純化中最常使用的親和純化標(biāo)簽，可以與裝載有Ni的親和柱子結(jié)合[37]。組氨酸標(biāo)簽很小，不移除不影響蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，但是在一些情況有可能會(huì)影響蛋白質(zhì)的溶解性及其功能[38]。張亞妮等[39]實(shí)現(xiàn)人工合成抗菌肽D2A21基因的克隆和表達(dá)，其中直接應(yīng)用His6表達(dá)和純化抗菌肽D2A21。Yi等[40]構(gòu)建His6—SUMO—A20L融合表達(dá)體系，成功表達(dá)了抗菌肽A20L，最高純化后產(chǎn)量為5.3 mg/L，表達(dá)的抗菌肽A20L抗多種革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌。組氨酸標(biāo)簽用于抗菌肽的分離純化，簡(jiǎn)單易行，是設(shè)計(jì)并構(gòu)建抗菌肽表達(dá)系統(tǒng)的首要選擇。

2.3 融合蛋白標(biāo)簽的切除

融合蛋白標(biāo)簽的存在可能會(huì)影響目標(biāo)蛋白的結(jié)構(gòu)和功能，為了獲得具有正確結(jié)構(gòu)和良好生物活性的目標(biāo)蛋白質(zhì)產(chǎn)物，需要采取一定的方法除去標(biāo)簽，排除標(biāo)簽對(duì)蛋白質(zhì)的影響[41]。

目前在抗菌肽融合表達(dá)領(lǐng)域蛋白融合標(biāo)簽的切除有3種方法，即化學(xué)法、酶法和內(nèi)含肽的自我剪接等。

2.3.1 化學(xué)法 化學(xué)法是利用一些氨基酸之間的肽鍵對(duì)某些化學(xué)試劑敏感而發(fā)生斷裂從而去除融合蛋白標(biāo)簽的一種方法。Pane等[42]構(gòu)建來(lái)自人凝血酶C端的一段小的GKY20抗菌肽和豹蛙酶系列大腸桿菌融合表達(dá)，探索了化學(xué)法切除融合蛋白的反應(yīng)條件和效率，成功構(gòu)建了能夠利用稀醋酸等稀酸斷裂Asp—Cys之間的肽鍵和溴化氰斷裂與甲硫氨酸相連的肽鍵從而除去融合標(biāo)簽，并且表現(xiàn)出高達(dá)95%的切割效率。

化學(xué)法具有成本低、效率高等優(yōu)點(diǎn)，化學(xué)試劑作用效果好，時(shí)間短，可以縮短分離純化的周期，應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)，但是化學(xué)試劑可能會(huì)影響抗菌肽的結(jié)構(gòu)和功能，另外需要摸索適合的反應(yīng)條件，如作用溫度、pH等。值得注意的是，化學(xué)法切割融合蛋白標(biāo)簽會(huì)使抗菌肽上增加一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸，例如切割X—Met之間的肽鍵，會(huì)使抗菌肽的N端多一個(gè)甲硫氨酸，雖然不影響抗菌肽的結(jié)構(gòu)和功能，但是應(yīng)用到人和動(dòng)物體上會(huì)引起免疫排斥反應(yīng)。

2.3.2 酶法 酶法除去融合蛋白標(biāo)簽，是在融合蛋白標(biāo)簽和目標(biāo)蛋白之間插入酶識(shí)別和作用的位點(diǎn)。常使用的酶有TEV蛋白酶、Xa因子、腸激酶、凝血酶及SUMO蛋白酶等。常用的蛋白酶切割融合蛋白標(biāo)簽見(jiàn)表1。

酶法去除融合蛋白標(biāo)簽作用效果好，反應(yīng)穩(wěn)定，但是應(yīng)用成本高，不易工業(yè)推廣，并且需要合適的酶切反應(yīng)環(huán)境，易變性失活。另外，腸激酶、凝血酶等有第二識(shí)別和切割位點(diǎn)，容易產(chǎn)生非特異性切割，產(chǎn)生副產(chǎn)物，影響抗菌肽的分離純化，這種非特異性的切割是不可能完全消失的，只能通過(guò)改變反應(yīng)條件，減弱非特異性識(shí)別和切割的頻率來(lái)實(shí)現(xiàn)。

蛋白酶法用于抗菌肽融合標(biāo)簽的切除，可以從兩個(gè)方向進(jìn)行改進(jìn)，一是尋找特異性更強(qiáng)、酶切效率更高、制造成本更低的酶，二是簡(jiǎn)化酶法切除的提純工藝，減少步驟，降低損失，例如上面提到的“His—SUMO—A20L”即是“標(biāo)簽—蛋白酶識(shí)別和切割序列—抗菌肽”的純化體系，操作程序簡(jiǎn)單。

2.3.3 內(nèi)含肽的自我剪接 利用內(nèi)含肽的自我切割功能和對(duì)某種介質(zhì)親和的特性，可以開(kāi)發(fā)“內(nèi)含肽—抗菌肽”的抗菌肽融合表達(dá)親和純化系統(tǒng)。目前內(nèi)含肽數(shù)據(jù)中共發(fā)現(xiàn)了450多種內(nèi)含肽。其中廣泛應(yīng)用于抗菌肽融合表達(dá)親和純化的有CBD（幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域），還有的是基于ELP（彈性蛋白樣多肽）的內(nèi)含肽介導(dǎo)的純化系統(tǒng)。

利用CBD和含有chitin（幾丁質(zhì)）介質(zhì)的親和柱子結(jié)合，可以提純含有CBD的融合蛋白，后加入巰基乙醇（DTT），可以使得抗菌肽和CBD連接鍵斷裂，獲得不含有任何其他片段的抗菌肽。Hong等[48]利用CBD和人源抗菌肽（MDCD—1L）融合簡(jiǎn)單純化獲得了人源MDCD—1L。這一方法成本較低，但是介質(zhì)和配基之間的結(jié)合的穩(wěn)定性和特異性較低，結(jié)合的目標(biāo)蛋白很容易從介質(zhì)上脫落，使獲得融合蛋白含有雜蛋白。

基于彈性蛋白的內(nèi)含肽介導(dǎo)的抗菌肽純化系統(tǒng)得到廣泛的應(yīng)用。類(lèi)彈性蛋白ELPs是一類(lèi)人工合成的生物大分子，由五肽重復(fù)序列單元VPGXG（其中X是除脯氨酸以外的任意一種氨基酸，來(lái)源于哺乳動(dòng)物的彈性蛋白序YfJVPGVG）組成，具有溫度誘導(dǎo)的反復(fù)相變特性[49]。而將與ELP融合的蛋白也有這樣的特性，因此，可構(gòu)建“ELP—內(nèi)含肽—抗菌肽”的純化系統(tǒng)，當(dāng)體系處于某一溫度（反轉(zhuǎn)變溫度）時(shí)，ELP的結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生改變，導(dǎo)致聚集沉淀，與ELP相連的抗菌肽也會(huì)隨之沉淀，簡(jiǎn)單離心就可以獲得ELP—內(nèi)含肽—抗菌肽融合蛋白，再改變條件就可以使得內(nèi)含肽自我剪接，抗菌肽從融合蛋白上釋放。巢亦成[50]利用“ELP—內(nèi)含肽—抗菌肽”融合表達(dá)純化了抗菌肽NK—2內(nèi)含肽介導(dǎo)的ELP純化系統(tǒng)，可以避免使用親和樹(shù)脂，降低了純化成本，操作簡(jiǎn)單。

和化學(xué)法相比，內(nèi)含肽的自我剪接作用溫和，不會(huì)使得抗菌肽失去生物活性，和酶法相比，內(nèi)含肽的自我剪接不用除去酶或獲得純抗菌肽而反復(fù)過(guò)柱子，降低了純化的投入，操作也簡(jiǎn)單，是大腸桿菌融合表達(dá)抗菌肽純化的很好選擇。

3 小結(jié)

融合表達(dá)是目前抗菌肽表達(dá)的最好方式，選擇合適的表達(dá)菌株、融合蛋白標(biāo)簽及純化體系是高效低成本表達(dá)抗菌肽的關(guān)鍵。本文綜述了抗菌肽在大腸桿菌中融合表達(dá)及純化的策略，但是僅限于個(gè)別抗菌肽的表達(dá)純化，工業(yè)化推廣由于產(chǎn)量低、過(guò)程復(fù)雜、成本高而受阻。為了高通量表達(dá)抗菌肽，構(gòu)建高產(chǎn)低成本的表達(dá)平臺(tái)仍有很多工作要做。

為了實(shí)現(xiàn)抗菌肽高通量表達(dá)，可以從以下方面考慮：一是應(yīng)用現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)，減少使用或不用酶切、酶連等傳統(tǒng)構(gòu)建表達(dá)載體的方法，結(jié)合抗菌肽基因小、可全化學(xué)合成的特點(diǎn)，應(yīng)用無(wú)酶克隆先進(jìn)操作技術(shù)，高通量構(gòu)建表達(dá)載體[51]。二是應(yīng)用快速的轉(zhuǎn)化檢測(cè)手段。三是應(yīng)用適合的融合蛋白標(biāo)簽和純化標(biāo)簽，最好是使得融合蛋白表達(dá)分泌到胞外，為了工業(yè)化推廣，選擇不用酶或者尋找更高效、低成本的酶去除融合標(biāo)簽的方法。endprint

參考文獻(xiàn)：

[1] MAKOVITZKI A，AVRAHAMI D，SHAI Y. Ultrashort Antibacterial and Antifungal Lipopeptides[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2006， 103（43）：15997-16002.

[2] KALLEN M，RICKS P，EDWARDS J，et al. Vital signs：carbapenem-resistant Enterobacteriaceae[J].MMWR Morb Mortal Wkly Rep，2013，62：165-170.

[3] LAXMINARAYAN R， DUSE A， WATTAL C， et al. Antibiotic resistance—the need for global solutions[J]. The Lancet Infectious Diseases，2013，13（12）：1057-1098.

[4] SELSTED M E，OUELLETTE A J. Mammalian defensins in the antimicrobial immune response[J]. Nature Immunology，2005， 6（6）：551-557.

[5] TOSSI A，SANDRI L. Molecular diversity in gene-encoded，cationic antimicrobial polypeptides[J].Current Pharmaceutical Design，2002，8（9）：743-761.

[6] WANG G，LI X，WANG Z. APD3： the antimicrobial peptide database as a tool for research and education[J].Nucleic Acids Research，2016，44（D1）：D1087-D1093.

[7] WANG G，LI X，WANG Z. APD2： the updated antimicrobial peptide database and its application in peptide design[J]. Nucleic Acids Research，2008，37（suppl_1）：D933-D937.

[8] LAZAREV V N，GOVORUN V M. Antimicrobial peptides and their use in medicine[J]. Applied Biochemistry and Microbiology，2010，46（9）：803-814.

[9] 李冠楠，夏雪娟，隆耀航，等.抗菌肽的研究進(jìn)展及其應(yīng)用[J].動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào)，2014，26（1）：17-25.

[10] 陳軼群，曹云鶴.抗菌肽研究進(jìn)展[J].中國(guó)畜牧雜志，2009， 45（11）：60-64.

[11] 趙 昆，劉思國(guó)，王春來(lái)，等.?？咕腂ac7-Bac5-βdefense串聯(lián)基因在昆蟲(chóng)桿狀病毒系統(tǒng)中的表達(dá)及其產(chǎn)物的活性分析[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2008，16（3）：380-384.

[12] 孫立人，高 北，陶 妍.斑點(diǎn)叉尾鮰LEAP-2抗菌肽在畢赤酵母中的表達(dá)[A].2015年中國(guó)水產(chǎn)學(xué)會(huì)學(xué)術(shù)年會(huì)論文摘要集[C].杭州：中國(guó)水產(chǎn)學(xué)會(huì)，2015.

[13] RASHID F，ALI I，袁其朋，等.人類(lèi)抗菌肽hepcidin在畢赤酵母中的分泌表達(dá)和純化[J].生物技術(shù)通報(bào)，2009（9）：121-124.

[14] 付登峰，胡建和，劉興友.抗菌肽基因工程表達(dá)技術(shù)研究進(jìn)展[J].中國(guó)畜牧獸醫(yī)2010，37（9）：124-126.

[15] 唐 勇.抗菌肽基因表達(dá)系統(tǒng)研究進(jìn)展[J].飼料工業(yè)，2009， 30（7）：13-16.

[16] 張學(xué)敏，金莉莉，王 錚，等.抗菌肽在大腸桿菌中的融合表達(dá)[J].生物工程學(xué)報(bào)，2014，30（8）：1172-1181.

[17] LI Y. Recombinant production of antimicrobial peptides in Escherichia coli：A review[J].Protein Expression & Purification，2011，80（2）：260-267.

[18] LI Y. Carrier proteins for fusion expression of antimicrobial peptides in Escherichia coli[J].Biotechnology and Applied Biochemistry，2009，54（1）：1-9.

[19] 歐陽(yáng)萍，高 宇，雷連成，等.人溶菌酶-抗菌肽tachyplesins融合蛋白的原核表達(dá)及其抗菌活性[J].中國(guó)生物制品學(xué)雜志，2010，23（8）：829-833.

[20] 馬青山，余占橋，韓 冰，等.抗菌肽融合表達(dá)研究進(jìn)展[J].生物工程學(xué)報(bào)，2011，27（10）：1408-1416.

[21] STEWART E J，SLUND F，BECKWITH J. Disulfide bond formation in the Escherichia coli cytoplasm：an in vivo role reversal for the thioredoxins[J].The EMBO Journal，1998，17（19）：5543-5550.endprint

[22] ALEM D，DELLAVALLE P D，LEONI C，et al. In Search of topical agricultural biofungicides：properties of the recombinant antimicrobial peptide TrxAq-AMP obtained from Amaranthus quitensis[J].Journal of Microbial and Biochemical Technology，2014，6：268-273.

[23] KRAHULEC J，HYR？譒OV M，PEPELIAEV S，et al. High level expression and purification of antimicrobial human cathelicidin LL-37 in Escherichia coli[J].Applied Microbiology and Biotechnology，2010，88（1）：167-175.

[24] GAGLIARDO B， FAYE A，JAOUEN M，et al. Production of biologically active forms of recombinant hepcidin，the iron-regulatory hormone[J].The FEBS Journal，2008，275（15）：3793-3803.

[25] BUTT T R，EDAVETTAL S C，HALL J P，et al. SUMO fusion technology for difficult-to-express proteins[J].Protein Expression and Purification，2005，43（1）：1-9.

[26] LI J F，ZHANG J，SONG R，et al. Production of a cytotoxic cationic antibacterial peptide in Escherichia coli using SUMO fusion partner[J].Applied Microbiology and Biotechnology，2009， 84（2）：383-388.

[27] 姜媛媛，劉銘瑤，任桂萍，等.高效可溶性重組蛋白表達(dá)載體的構(gòu)建[J].生物工程學(xué)報(bào)，2010，26（1）：121-129.

[28] HWANG P M，PAN J S，SYKES B D. Targeted expression，purification，and cleavage of fusion proteins from inclusion bodies in Escherichia coli[J].Febs Letters，2014，588（2）：247-252.

[29] KIM J M，JANG S A，YU B J，et al. High-level expression of an antimicrobial peptide histonin as a natural form by multimerization and furin-mediated cleavage[J].Applied Microbiology and Biotechnology，2008，78（1）：123-130.

[30] 孫永福，王鳳山，張 敏.內(nèi)含肽介導(dǎo)的新型蛋白質(zhì)純化技術(shù)[J].生命的化學(xué)，2008，28（2）：146-148.

[31] 王姝婧，陳丙友，王玉君，等.內(nèi)含肽在構(gòu)建親和純化系統(tǒng)中的應(yīng)用[J].生物工程學(xué)報(bào)，2016，32（9）：1175-1184.

[32] LI Y. Self-cleaving fusion tags for recombinant protein production[J]. Biotechnology Letters，2011，33（5）：869-881.

[33] COOLBAUGH M J，SHAKALLI TANG M J，WOOD D W. High-throughput purification of recombinant proteins using self-cleaving intein tags.[J].Analytical Biochemistry，2017，516：65-74.

[34] XIE Y G，HAN F F，LUAN C，et al. High-yield soluble expression and simple purification of the antimicrobial peptide OG2 using the intein system in Escherichia coli.[J].BioMed Research International，2013（7）：754319.

[35] 吳衛(wèi)星.大腸桿菌中的蛋白質(zhì)分泌[J].中國(guó)生物工程雜志，1990，10（2）：41-47.

[36] LEE S J，PARK I S，HAN Y H，et al. Soluble expression of recombinant olive flounder hepcidin I using a novel secretion enhancer.[J]. Molecules & Cells，2008，26（2）：140-145.

[37] BELL M R，ENGLEKA M J，MALIK A，et al. To fuse or not to fuse：what is your purpose？[J].Protein Science A Publication of the Protein Society，2013，22（11）：1466-1477.endprint

[38] DICKSON J M，LEE W J，SHEPHERD P R，et al. Enzyme activity effects of N-terminal His-tag attached to catalytic sub-unit of phosphoinositide-3-kinase[J].Bioscience Reports，2013， 33（6）：857-863.

[39] 張亞妮，馬艷玲.人工合成抗菌肽D2A21基因的克隆和表達(dá)[J].基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)，2010，29（3）：453-456.

[40] YI T，SUN S，HUANG Y，et al. Prokaryotic expression and mechanism of action of α-helical antimicrobial peptide A20L using fusion tags[J]. Bmc Biotechnology，2015，15（1）：69.

[41] 謝 浩，楊 程，陳麗娥.多肽融合標(biāo)簽的移除策略[J].生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展，2009，36（10）：1365-1369.

[42] PANE K，DURANTE L，PIZZO E，et al. Rational design of a carrier protein for the production of recombinant toxic peptides in Escherichia coli[J].Plos One，2016，11（1）：e0146552.

[43] 文 雅，陶 妍.尼羅羅非魚(yú)Hepcidin抗菌肽在大腸桿菌中的融合表達(dá)及其抗菌活性[J].上海交通大學(xué)學(xué)報(bào)（農(nóng)業(yè)科學(xué)版），2012，30（4）：68-75.

[44] 李建民，馬志飛，曹勤洪，等.中國(guó)家蠶抗菌肽CBM1、CBM2的克隆和表達(dá)研究[J].生物技術(shù)通訊，2005，16（4）：367-370.

[45] HARTMANN B M，KAAR W，YOO I K，et al. The chromatography-free release，isolation and purification of recombinant peptide for fibril self-assembly[J].Biotechnology & Bioengineering，2009，104（5）：973-985.

[46] 王來(lái)城，王金星，趙小凡，等.家蠅防御素在大腸桿菌中的表達(dá)、純化與抗體制備[J].動(dòng)物學(xué)報(bào)（Current Zoology），2005，51（2）：327-334.

[47] 侯歡歡，盧 佳，章緯菁，等.少棘蜈蚣抗菌肽scolopin 2的克隆、表達(dá)與抗癌機(jī)制研究[J].生物技術(shù)通報(bào)，2016，32（9）：172-178.

[48] HONG I，KIM Y S，CHOI S G. Simple purification of human antimicrobial peptide dermcidin（MDCD-1L） by intein-mediated expression in E.coli.[J].Journal of Microbiology & Biotechnology，2010，20（2）：350-355.

[49] HERRERO-VANRELL R，RINC N A C，ALONSO M，et al. Self-assembled particles of an elastin-like polymer as vehicles for controlled drug release[J].Journal of Controlled Release，2005，102（1）：113-122.

[50] 巢亦成.抗菌肽NK-2的分子克隆、融合表達(dá)及其抑菌活性的初步研究[D].江蘇揚(yáng)州：揚(yáng)州大學(xué)，2010.

[51] TAO K，SU L，JIN H，et al. A novel PCR-based method for high throughput prokaryotic expression of antimicrobial peptide genes[J].BMC Biotechnology，2012，12（1）：10.endprint