富硒青錢柳多糖對糖尿病模型小鼠血糖、血脂和免疫力的影響

張 浩，陳偉鴻，馬方勵，王 珊，譚開祥，向極釬，劉 衛(wèi),*

（1.華中科技大學生命科學與技術學院，湖北 武漢 430074；2.無限極（中國）有限公司，廣東 廣州 510665；3.湖北思慧生物科技有限公司，湖北 恩施 445099；4.恩施州農(nóng)業(yè)科學院，湖北 恩施 445099）

富硒青錢柳多糖對糖尿病模型小鼠血糖、血脂和免疫力的影響

張 浩1，陳偉鴻2，馬方勵2，王 珊1，譚開祥3，向極釬4，劉 衛(wèi)1,*

（1.華中科技大學生命科學與技術學院，湖北 武漢 430074；2.無限極（中國）有限公司，廣東 廣州 510665；3.湖北思慧生物科技有限公司，湖北 恩施 445099；4.恩施州農(nóng)業(yè)科學院，湖北 恩施 445099）

研究富硒青錢柳多糖（selenium polysaccharide from Cyclocarya paliurus (Batal) Ijinskaja，Se-CPP）對糖尿病模型小鼠血糖、血脂和免疫力的影響。高脂飲食加腹腔注射鏈脲佐菌霉素建立小鼠糖尿病模型，以生理鹽水、青錢柳多糖（Cyclocarya paliurus (Batal) Ijinskaja polysaccharide，CPP）、CPP＋亞硒酸鈉、亞硒酸鈉、Se-CPP低、中、高劑量（0.2、0.6、1.8 g/（kg·d））、消渴丸連續(xù)灌胃給藥42 d。末次給藥后檢測小鼠葡萄糖耐量、血清總膽固醇（total cholesterol，TC）含量、甘油三酯（triglyceride，TG）含量、抗氧化酶活力、免疫器官指數(shù)及小鼠脾淋巴細胞轉化指數(shù)。結果表明：連續(xù)給藥42 d后，Se-CPP低、中劑量組小鼠血糖、血清TC和TG水平均低于CPP組和CPP＋亞硒酸鈉組，Se-CPP較CPP具有更好的抗氧化活力和提高糖尿病小鼠免疫力的功效。

富硒青錢柳多糖；糖尿病小鼠；血糖；血脂；抗氧化；免疫力

張浩, 陳偉鴻, 馬方勵, 等. 富硒青錢柳多糖對糖尿病模型小鼠血糖、血脂和免疫力的影響[J]. 食品科學, 2017, 38(17): 228-232. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201717037. http://www.spkx.net.cn

ZHANG Hao, CHEN Weihong, MA Fangli, et al. Effect of selenium polysaccharide from Cyclocarya paliurus (Batal) Ijinskaja on blood glucose, serum lipid and immunity in diabetic mice[J]. Food Science, 2017, 38(17): 228-232. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201717037. http://www.spkx.net.cn

青錢柳（Cyclocarya paliurus (Batal) Ijinskaja），又名搖錢樹、青錢李，系雙子葉植物綱胡桃科青錢柳屬落葉喬木，為我國特有的單種屬植物，分布于江西、湖北、湖南、貴州等省區(qū)[1]。研究表明，青錢柳葉富含多糖、黃酮、皂苷等次生代謝產(chǎn)物[1-2]，其中，青錢柳多糖（Cyclocarya paliurus (Batal) Ijinskaja polysaccharide，CPP）具有降血糖、降血脂等作用[3-4]。硒是人體必需的微量元素，具有抗氧化、提高免疫力等功效[5-6]。目前研究表明，硒多糖兼有硒與多糖的生物活性，具有降血糖、降血脂、抗氧化、提高免疫力、抗腫瘤等功效[6-8]。本課題組前期工作中采用有機硒肥噴施青錢柳葉，獲得硒含量達到國家富硒茶葉標準（0.25～4.00 mg/kg）的富硒青錢柳葉[9]。本實驗以富硒青錢柳葉為實驗材料，提取分離獲得富硒青錢柳多糖（selenium polysaccharide from Cyclocarya paliurus (Batal) Ijinskaja，Se-CPP），研究Se-CPP對高脂飲食加鏈脲佐菌霉素（streptozotocin，STZ）誘導的糖尿病小鼠的血糖、血脂以及抗氧化、免疫力等生理功能的影響，為富硒青錢柳保健食品的研究與開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、動物與試劑

青錢柳葉和富硒青錢柳葉采集于湖北恩施某青錢柳種植基地。CPP和Se-CPP分別參照文獻[10]方法提取制備。CPP和Se-CPP中硒元素含量采用氫化物原子熒光光譜法檢測[11]，檢測結果分別為0.11 mg/kg和3.30 mg/kg。

SPF級雄性C57BL/6小鼠120 只，體質量16～18 g，許可證號：SCXK（鄂）2015-0018。實驗動物、普通維持料及高脂飼料由湖北省疾病預防控制中心提供。

STZ、刀豆蛋白A（concanavalin A，ConA）、四甲基偶氮唑藍（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；消渴丸 廣州白云山中一藥業(yè)有限公司；羅康全活力型血糖試紙 羅氏診斷產(chǎn)品（上海）有限公司；亞硒酸鈉片 上海天賜福生物工程有限公司；總膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathioneperoxidase，GSH-Px）檢測試劑盒 南京建成生物工程研究所；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設備

ACCU-CHEK Active血糖儀 羅氏診斷產(chǎn)品（上海）有限公司；318C酶標儀 成都華衡儀器有限公司；BSA124S分析天平 賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；BPN-150CRH二氧化碳培養(yǎng)箱 上海一恒科學儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 分組及給藥

參照文獻[12-13]的方法，小鼠適應性喂養(yǎng)3 d，禁食12 h后測定小鼠空腹血糖（fasting blood glucose，F(xiàn)BG），按照FBG隨機分組。分為空白組（生理鹽水）、模型組（生理鹽水）、CPP組（0.6 g/（kg·d），以體質量計，下同）、CPP＋亞硒酸鈉組（CPP 0.6 g/（kg·d）、Na2SeO34.34 μg/（kg·d））、亞硒酸鈉組（Na2SeO34.34 μg/（kg·d））、Se-CPP低、中、高劑量組（0.2、0.6、1.8 g/（kg·d）），另設消渴丸（0.514 g/（kg·d））作為陽性對照組，各組給藥劑量參考文獻[14]及預實驗結果確定。分組后，空白組小鼠8 只，其余各組小鼠10 只。

分組后根據(jù)小鼠體質量灌胃給藥，每天一次，連續(xù)42 d，以生理鹽水配制受試樣品。給藥期間，除空白組外，各組小鼠給予高脂飼料喂養(yǎng)。

1.3.2 糖尿病小鼠模型的建立

參照文獻[13]的方法，連續(xù)給藥14 d后，小鼠禁食12 h，根據(jù)體質量腹腔注射劑量為40 mg/kg的STZ溶液（以0.1 mol/L、pH4.2的檸檬酸緩沖液為溶劑配制，現(xiàn)配現(xiàn)用），空白組小鼠注射等量溶劑，4 h后小鼠恢復進食。3 d后再次對小鼠腹腔注射等劑量STZ。

1.3.3 小鼠體質量和口服葡萄糖耐量的測定

每周定時記錄小鼠體質量并觀察小鼠生長狀況。末次給藥后進行口服葡萄糖耐量實驗（oral glucose tolerance test，OGTT）：小鼠禁食12 h后尾靜脈取血測定FBG作為0 h的血糖值，隨后根據(jù)體質量灌胃給藥，15 min后再灌胃2.5 g/kg葡萄糖溶液，分別等待0.5、1.0 h和2.0 h后測定小鼠血糖值，計算血糖曲線下面積（area under the curve，AUC）[15]。

1.3.4 小鼠血清生化指標的檢測

末次給藥后，所有小鼠普通維持料喂養(yǎng)2 d后禁食12 h，測定體質量后摘眼球取血。血液離心分離血清，檢測血清TC、TG含量和SOD、GSH-Px活力，具體檢測過程見試劑盒說明書。

1.3.5 小鼠免疫器官指數(shù)的檢測

將取血后的小鼠脫臼處死，無菌取脾臟、胸腺后稱質量，計算臟器指數(shù)[16]。

1.3.6 小鼠脾淋巴細胞轉化實驗

參照文獻[17]的MTT法，以ConA刺激小鼠脾淋巴細胞增殖，計算轉化指數(shù)（實驗孔與對照孔OD值之比）。

1.3.7 Se-CPP對正常小鼠血糖的影響

另取20 只小鼠，按照FBG隨機分為空白組（生理鹽水）和正常組（0.6 g/（kg·d）Se-CPP），每組小鼠9 只。分組后根據(jù)體質量灌胃給藥，每天一次，連續(xù)42 d。實驗期間，所有小鼠普通維持料喂養(yǎng)，末次給藥后進行OGTT并計算AUC。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用SPSS 19.0軟件對實驗結果進行統(tǒng)計學分析。對實驗數(shù)據(jù)進行方差分析，組間多重比較采用LSD法，結果以±s表示。

2 結果與分析

2.1 Se-CPP對糖尿病小鼠體質量和葡萄糖耐量的影響

實驗期間，觀察到模型組小鼠體質量低于其余各實驗組，但無顯著性差異；同時，模型組小鼠出現(xiàn)多食、多飲、多尿等糖尿病癥狀，各實驗組小鼠糖尿病癥狀較模型組小鼠有所減輕。末次給藥后進行OGTT，結果見表1。

表 1 小鼠血糖和AUC比較（x±sTable 1 Comparison of blood glucose and AUC in all groups of mice (x ±s)

表 1 小鼠血糖和AUC比較（x±sTable 1 Comparison of blood glucose and AUC in all groups of mice (x ±s)

注：*.與空白組比較差異顯著（P＜0.05）；**.與空白組比較差異極顯著（P＜0.01）；#.與模型組比較差異顯著（P＜0.05）；##.與模型組比較差異極顯著（P＜0.01）；Δ.與陽性對照組比較差異顯著（P＜0.05）；ΔΔ.與陽性對照組比較差異極顯著（P＜0.01）；▲.與Se-CPP低、中劑量組比較差異顯著（P＜0.05）。表2同。

組別n血糖值/（mmol/L）AUC/（（mmol·h）/L）0.0 h0.5 h1.0 h2.0 h空白組85.93±0.7712.58±1.459.04±0.857.15±1.0018.12±1.71模型組106.25±2.1224.44±3.75**ΔΔ18.94±5.51**ΔΔ11.00±5.89**ΔΔ33.49±9.08**ΔΔ陽性對照組104.84±0.88#19.20±2.03**##12.10±2.35*##6.40±1.02##23.09±2.93*##CPP組104.46±0.72#21.29±3.46**#16.43±2.89**#ΔΔ8.85±1.13#Δ28.51±4.17**#ΔΔ▲CPP＋亞硒酸鈉組104.54±0.75#21.17±3.59**#14.60±2.40**##Δ8.58±1.37#Δ26.96±3.86**##Δ▲亞硒酸鈉組104.60±0.68#20.96±1.57**##15.96±1.09**#ΔΔ8.19±0.82##27.70±1.42**##Δ▲Se-CPP低劑量組104.90±0.95#19.24±2.54**##12.95±2.20**##8.02±0.78##24.57±2.93**##Se-CPP中劑量組104.72±0.77#17.86±2.85**##13.44±1.61**##8.53±0.62#Δ24.46±2.64**##Se-CPP高劑量組105.19±1.0821.20±3.55**#16.27± 3.13**#ΔΔ9.13±1.23ΔΔ28.66±4.63**#ΔΔ▲

由表1可知，模型組與空白組相比，小鼠口服葡萄糖后血糖值和AUC極顯著升高（P＜0.01），表明小鼠高血糖模型建造成功。陽性對照組、各實驗組與模型組比較，小鼠口服葡萄糖后血糖值均有顯著下降（P＜0.05，P＜0.01），且AUC極顯著降低（P＜0.01），表明陽性對照組和各實驗組均表現(xiàn)出顯著的降血糖作用。Se-CPP低、中劑量組與陽性藥物組比較，AUC無顯著性差異，表明低、中劑量的Se-CPP降血糖效果與消渴丸相當。Se-CPP低、中劑量組AUC均顯著低于CPP組和CPP＋亞硒酸鈉組（P＜0.05），表明低、中劑量的Se-CPP比CPP和CPP＋亞硒酸鈉具有更好的降血糖效果。實驗中低、中劑量組Se-CPP給藥劑量與文獻報道的恩施硒茶硒多糖降血糖給藥劑量相當[18]。

另外，實驗發(fā)現(xiàn)高劑量組Se-CPP降血糖效果不如低、中劑量組，原因可能與低劑量興奮效應有關[16,19]。低劑量興奮效應是指機體在外來因素影響時，低劑量對機體產(chǎn)生興奮效應而高劑量產(chǎn)生抑制效應。文獻報道硒具有U型或倒U型劑量反應曲線，當給藥劑量超過最適劑量后，其生物活性反而降低[19-20]。

2.2 Se-CPP對糖尿病小鼠血清血脂的影響

表 2 小鼠血清TC和TG含量比較Table 2 Comparison of serum TC and TG levels in all groups of mice

連續(xù)給藥42 d后檢測小鼠血清TC和TG的含量結果見表2，Se-CPP各劑量組小鼠血清TC水平均低于空白組和模型組，且低、中劑量組與空白組和模型組比較差異顯著（P＜0.05），TG水平較空白組和模型組有所升高。Se-CPP各劑量組小鼠血清TC和TG水平均低于CPP組和CPP＋亞硒酸鈉組，Se-CPP各劑量組間小鼠血清TC和TG水平均為低劑量組＜中劑量組＜高劑量組，各組間無顯著性差異（P＞0.05）。

2.3 Se-CPP對糖尿病小鼠抗氧化酶活力的影響

圖 1 小鼠血清SOD和GSH-Px活力比較Fig. 1 Comparison of serum SOD and GSH-Px activities in all groups of mice

SOD和GSH-Px是小鼠體內(nèi)兩種重要的抗氧化酶，連續(xù)給藥42 d后檢測小鼠血清SOD和GSH-Px活力。由圖1可知，Se-CPP低、中劑量組小鼠GSH-Px活力高于CPP組和CPP＋亞硒酸鈉組，且高于空白組、模型組與陽性對照組，但Se-CPP高劑量組小鼠GSH-Px活力較低。Se-CPP中、高劑量組小鼠SOD活力高于CPP組和CPP＋亞硒酸鈉組，且高于空白組、模型組與陽性對照組。另外，Se-CPP中劑量組小鼠血清抗氧化酶活力優(yōu)于高劑量組，其原因可能與降血糖實驗一樣，與硒的U型劑量反應曲線有關。

2.4 Se-CPP對糖尿病小鼠免疫能力的影響

2.4.1 Se-CPP對糖尿病小鼠免疫器官指數(shù)的影響

圖 2 小鼠免疫器官指數(shù)比較Fig. 2 Comparison of immune organ indexes in all groups of mice

胸腺與脾臟是小鼠體內(nèi)重要的免疫器官，免疫器官指數(shù)可以間接反映出機體淋巴細胞水平[16]。由圖2可知，與空白組和模型組比較，Se-CPP中、高劑量組小鼠胸腺指數(shù)顯著升高（P＜0.05，P＜0.01），且高于CPP組和CPP＋亞硒酸鈉組，但各實驗組小鼠脾臟指數(shù)無顯著性差異（P＞0.05）。

2.4.2 Se-CPP對糖尿病小鼠脾淋巴細胞增殖的影響

圖 3 小鼠脾淋巴細胞轉化指數(shù)比較Fig. 3 Comparison of spleen lymphocyte transformation rates in mice

淋巴細胞的增殖分化是機體免疫應答的重要階段，檢測淋巴細胞的增殖能力是評價細胞免疫功能的常用方法[21]。由圖3可知，Se-CPP中、高劑量組小鼠轉化指數(shù)顯著高于空白組和模型組（P＜0.05，P＜0.01），表明一定劑量的Se-CPP可以增強糖尿病小鼠脾淋巴細胞增殖能力，從而提高糖尿病小鼠細胞免疫能力。

2.5 Se-CPP對正常小鼠血糖的影響

表 3 Se-CPP對正常小鼠血糖的影響（n=9）Table 3 Effect of Se-CPP on blood glucose in normal mice (n= 9)

由表3可知，給葡萄糖前，空白組與正常組小鼠血糖無顯著性差異；給葡萄糖后，空白組與正常組小鼠血糖變化趨勢相同，即先升高，然后逐漸降低，且兩者AUC無顯著性差異，表明長期服用一定劑量的Se-CPP對正常小鼠的FBG和葡萄糖耐量無明顯影響（P＞0.05）。

3 討 論

糖尿病是一種常見的以持續(xù)高血糖為主要臨床特征的慢性內(nèi)分泌紊亂疾病，近年來其發(fā)病率逐漸提高[22]。研究表明，糖尿病與人體內(nèi)硒元素的缺乏具有一定的關系，適量補硒對于糖尿病的預防與治療具有重要意義[23]。

目前，國內(nèi)外關于硒與糖尿病的研究很多，以無機硒為主，較少涉及有機硒對糖尿病的影響[24]。本實驗以我國特有植物青錢柳為原材料，采用人工施加有機硒肥的方式使青錢柳富集硒元素，探討Se-CPP對糖尿病小鼠的影響，并與CPP及CPP＋亞硒酸鈉的復配物作比較。實驗結果表明，連續(xù)給藥42 d后，一定劑量的Se-CPP具有與陽性藥物消渴丸相當?shù)慕档吞悄虿⌒∈蟛秃笱堑淖饔?，其降血糖效果明顯優(yōu)于CPP及CPP＋亞硒酸鈉復配物。據(jù)文獻報道，CPP可能通過修復受損的胰島細胞、抑制α-葡萄糖苷酶的活性等機制發(fā)揮降血糖的作用[14,25]。Se-CPP降血糖機制是否與CPP相類似還需進一步研究。

除了血糖異常，糖尿病患者常出現(xiàn)血脂代謝紊亂的癥狀[26]。檢測結果表明模型組與空白組TC和TG含量無顯著性差異，原因可能與高脂飼養(yǎng)時間較短有關。Se-CPP各劑量組小鼠TC和TG水平均低于CPP組和CPP＋亞硒酸鈉組，表明Se-CPP具有更好的降血脂作用。

SOD和GSH-Px在機體抗自由基損傷中起著重要的作用[27]。檢測結果表明，適宜劑量的Se-CPP具有增強糖尿病小鼠SOD和GSH-Px活力的功效。此外，小鼠的免疫器官指數(shù)和轉化指數(shù)的檢測結果表明，一定劑量的Se-CPP可以提高糖尿病小鼠胸腺指數(shù)和轉化指數(shù)，從而增強糖尿病小鼠免疫力。研究表明，CPP具有較強的抗氧化活性并可提高小鼠免疫力[28-29]。本實驗結果表明，Se-CPP抗氧化和增強小鼠免疫力的活性較CPP、CPP＋亞硒酸鈉復配物均有所提升。機體免疫能 力與抗氧化活性密切相關[30]，Se-CPP具有比CPP更好的增強小鼠免疫力功效，可能與Se-CPP具有更好的抗氧化活性有關，Se-CPP提高小鼠免疫能力的詳細作用機制還有待深入研究。

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Effect of Selenium Polysaccharide from Cyclocarya paliurus (Batal) Ijinskaja on Blood Glucose, Serum Lipid and Immunity in Diabetic Mice

ZHANG Hao1, CHEN Weihong2, MA Fangli2, WANG Shan1, TAN Kaixiang3, XIANG Jiqian4, LIU Wei1,*
(1. College of Life Science and Technology, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430074, China; 2. The Infi nite (China) Co. Ltd., Guangzhou 510665, China; 3. Hubei Savant Biological Technology Co. Ltd., Ens hi 445099, China; 4. Enshi Academy of Agricultural Sciences, Enshi 445099, China)

This work studied the effect of selenium polysaccharide from the leaves of Cyclocarya paliurus (Batal) Ijinskaja (Se-CPP) on blood glucose, serum lipid and immunity in diabetic mice. The diabetic mice induced by high-fat diet and intraperitoneal injection of streptozotocin were administrated with physiological saline, Cyclocarya paliurus (Batal) Ijinskaja polysaccharide (CPP), CPP + sodium selenite, sodium selenite, Se-CPP at low, middle and high doses (0.2, 0.6, 1.8 g/(kg·d)) and Xiaoke pill. After 42 d administration, the levels of glucose tolerance, serum total cholesterol (TC) and triglyceride (TG), the activities of antioxidant enzymes, immune organ index, and splee n lymphocyte transformation rate were measured. The results showed that blood glucose, serum TC and TG levels in the low- and middle-dose Se-CPP groups were lower than those in the CPP and CPP + sodium selenite groups. In addition, Se-CPP had better antioxidant activity and could more effectively improve immunity in diabetic mice than CPP.

selenium polysaccharide from Cyclocarya paliurus (Batal) Ijinskaja; diabetic mice; blood glucose; serum lipid; antioxidant activity; immunity

10.7506/spkx1002-6630-201717037

R587.1

A

1002-6630（2017）17-0228-05引文格式：

2016-06-24

湖北省科技支撐計劃項目（2013BEC048）

張浩（1992—），男，碩士研究生，研究方向為天然產(chǎn)物功效。E-mail：1479765099@qq.com *通信作者：劉衛(wèi)（1966—），男，教授，博士，研究方向為生物制藥。E-mail：wliu@hust.edu.cn