巴蓮蓮子生物堿提取物對CCl4誘導(dǎo)小鼠肝損傷的預(yù)防效果

馮 霞，孫 鵬，易若琨，彭德光，趙 欣,*

（1.重慶第二師范學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院，重慶市功能性食品協(xié)同創(chuàng)新中心，重慶市功能性食品工程技術(shù)研究中心，

功能性食品研發(fā)重慶市工程實(shí)驗(yàn)室，重慶 400067；2.重慶市巴蓮品種選育及深加工企業(yè)工程技術(shù)研究中心，重慶 400041）

巴蓮蓮子生物堿提取物對CCl4誘導(dǎo)小鼠肝損傷的預(yù)防效果

馮 霞1，孫 鵬1，易若琨1，彭德光2，趙 欣1,*

（1.重慶第二師范學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院，重慶市功能性食品協(xié)同創(chuàng)新中心，重慶市功能性食品工程技術(shù)研究中心，

功能性食品研發(fā)重慶市工程實(shí)驗(yàn)室，重慶 400067；2.重慶市巴蓮品種選育及深加工企業(yè)工程技術(shù)研究中心，重慶 400041）

為檢測巴蓮蓮子生物堿提取物（alkaloids extracted from Ba lotus seed，AEBLS）對CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝損傷的預(yù)防作用，以732交換樹脂分離純化的AEBLS為研究對象，對小鼠灌胃低、高劑量（50 、100 mg/（kg·d））AEBLS后注射2 mL/kg CCl4誘導(dǎo)小鼠發(fā)生肝損傷，觀察小鼠肝指數(shù)、血清指標(biāo)和肝組織中相關(guān)mRNA表達(dá)的強(qiáng)度。結(jié)果顯示，AEBLS可以降低肝損傷小鼠的肝質(zhì)量和肝指數(shù)（P＜0.05）；AEBLS可以下調(diào)肝損傷小鼠血清中的天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、堿性磷酸酶、甘油三酯、總膽固醇、尿素氮、一氧化氮、丙二醛水平和上調(diào)白蛋白、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）水平（P＜0.05）；同時(shí)AEBLS還可以下調(diào)肝損傷小鼠血清中白介素-6（interleukin-6，IL-6）、IL-12、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-alpha，TNF-α）和γ-干擾素細(xì)胞因子水平（P＜0.05）。實(shí)時(shí)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)也證實(shí)AEBLS能上調(diào)肝損傷小鼠肝組織中Mn-SOD、Cu/Zn-SOD、CAT、GSH-Px、核因子κB抑制蛋白α的mRNA表達(dá)和下調(diào)核因子κB-p65、誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶、環(huán)氧化酶-2、TNF-α、IL-1β、IL-6的mRNA表達(dá)（P＜0.05）。由此可見，AEBLS對CCl4引發(fā)的肝損傷有較好的預(yù)防作用，且效果接近藥物水飛薊素，具有較好的功能性作用。

巴蓮蓮子；生物堿；mRNA表達(dá)；肝指數(shù)；谷胱甘肽過氧化物酶

馮霞, 孫鵬, 易若琨, 等. 巴蓮蓮子生物堿提取物對CCl4誘導(dǎo)小鼠肝損傷的預(yù)防效果[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(17): 216-222. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201717035. http://www.spkx.net.cn

FENG Xia, SUN Peng, YI Ruokun, et al. Preventive effects of alkaloids extracted from Ba lotus seeds on CCl4-induced hepatic injury in mice[J]. Food Science, 2017, 38(17): 216-222. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201717035. http://www.spkx.net.cn

巴蓮蓮子是一種主要產(chǎn)于重慶地區(qū)的睡蓮科植物蓮（Nelumbo nucifera Gaertn.）干燥后的成熟種子，蓮子具有多種功效，包括補(bǔ)脾止瀉、止帶、益腎澀精、養(yǎng)心安神等，可用于保健食品的開發(fā)與生產(chǎn)[1]。研究表明蓮子含有多種生物活性成分，其中生物堿的含量能達(dá)到2%[2]。最近的研究進(jìn)一步表明巴蓮蓮子通過其含有的生物活性物質(zhì)也產(chǎn)生抗氧化、抗炎和抗炎作用[3-5]，巴蓮及其蓮子已經(jīng)被逐步開發(fā)利用，通過對其功能性作用研究后開發(fā)出的保健飲料等多種加工品已經(jīng)進(jìn)入市場[6]，巴蓮及其蓮子具有很好的開發(fā)利用價(jià)值。

從天然植物中可提取到較多類型的生物堿物質(zhì)，其中大多數(shù)生物堿均具有生物活性作用，通過現(xiàn)代分子生物學(xué)方法證實(shí)植物中提取生物堿具有一定的降血壓、抗血壓和抗癌效果[7]。通過蓮子成分的分析結(jié)果顯示蓮子含有的生物堿包括蓮心堿、異蓮心堿和甲基蓮心堿等20多種異喹啉，同樣具有較好的功能性作用和保健品開發(fā)價(jià)值[8]。

肝臟是重要的代謝生理器官，肝損傷對人體能造成嚴(yán)重的危害，導(dǎo)致肝損傷的原因較多，其中化學(xué)性肝損傷是造成肝功能紊亂的常見原因，包括大量酒精攝入，藥物的副作用和環(huán)境中的化學(xué)毒性物質(zhì)均可能造成肝損傷，嚴(yán)重的化學(xué)性肝損傷甚至可引起肝硬化和肝癌[9]。CCl4是實(shí)驗(yàn)室條件誘導(dǎo)動(dòng)物肝損傷的常見化學(xué)誘導(dǎo)劑，CCl4在引發(fā)肝損傷的過程中能導(dǎo)致肝細(xì)胞大量分泌炎癥因子，從而加劇炎癥，加重肝損傷；同時(shí)，CCl4能促使肝細(xì)胞微粒體產(chǎn)生Cl－和CCl3－從而引起肝微粒體脂質(zhì)過氧化，導(dǎo)致細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化并破壞細(xì)胞膜，導(dǎo)致肝損傷[10]。本研究也利用CCl4對肝臟的作用，建立小鼠化學(xué)性肝損傷模型，以巴蓮蓮子生物堿提取物（alkaloids extracts of Ba lotus seed，AEBLS）為研究對象，觀察AEBLS對CCl4小鼠誘導(dǎo)肝損傷的預(yù)防作用，并進(jìn)一步采用分子生物學(xué)方法檢測小學(xué)血清和肝組織相關(guān)指標(biāo)，從機(jī)制上闡明AEBLS對小鼠肝損傷的預(yù)防作用機(jī)理。研究結(jié)果將有利于巴蓮資源的開發(fā)利用，為巴蓮應(yīng)用于食品加工和保健品研發(fā)積累理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

巴蓮蓮子購自于重慶當(dāng)?shù)厥袌觥?/p>

DMEM液體培養(yǎng)基 美國Hyclone公司；天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate aminotransferase，AST）測定試劑盒、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aminotransferase，ALT）測定試劑盒、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）測定試劑盒、甘油三酯（triglyceride，TG）測定試劑盒、總膽固醇（total cholesterol，TC）測定試劑盒、尿素氮（urea nitrogen，BUN）測定試劑盒、白蛋白（albumin，ALB）測定試劑盒、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）測定試劑盒、一氧化氮（nitric oxide，NO）測定試劑盒、過氧化氫酶（catalase，CAT）測定試劑盒、丙二醛（malondialdehyde，MDA）測定試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）測定試劑盒 南京建成生物工程研究所；白介素-6（interleukin-6，IL-6）、IL-12、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-alpha，TNF-α）和γ-干擾素（interferon-γ，IFN-γ）酶聯(lián)免疫試劑盒 美國Biolegend公司；CycleTESTTM PLUS DNA染色試劑盒 德國Becton Dickinson公司；Trizol試劑、Oligo（dT）18、RNase、dNTP和鼠白血病病毒（murine leukemia virus，MLV） 美國Invitrogen公司；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）引物 天根生化科技有限公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

清潔級昆明小鼠（6 周齡，雄性）購于重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心（動(dòng)物許可證SCXK（渝）2012-0001），控溫（22±4）℃并在相對濕度（50±20）%條件下飼養(yǎng)1 周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 儀器與設(shè)備

Biomate3S紫外-可見光分光光度儀、3111二氧化碳培養(yǎng)箱、StepOne Plus定量PCR儀、LUX多功能性酶標(biāo)儀美國Thermo Fisher Scientifi c公司；ICEN-24R高速冷凍離心機(jī) 杭州奧盛儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 AEBLS提取

將冷凍干燥后的巴蓮蓮子磨成細(xì)粉，取100 g巴蓮蓮子粉末加入1 000 mL的80%乙醇溶液后在50 ℃條件下提取1 h，然后收集過濾后的濾渣再重復(fù)以上的提取方法再提取一次，收集2 次的過濾液后在50 ℃條件下將濾液過732交換樹脂收集3 h。然后用蒸餾水洗掉水溶性雜質(zhì)后以3 mL/min的速率用80%乙醇溶液洗脫生物堿[11]。重復(fù)以上提取10 次收集乙醇洗脫液后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)法蒸干乙醇得到AEBLS用以動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)分組及設(shè)計(jì)

將實(shí)驗(yàn)用昆明小鼠分為5 組，每組10 只小鼠，分別為正常組、模型組、水飛薊素灌胃組（陽性對照組）、AEBLS灌胃組低劑量組（50 mg/（kg·d），以體質(zhì)量計(jì)，下同）、AEBLS灌胃組高劑量組（100 mg/（kg·d））。將適應(yīng)飼養(yǎng)1 周后的小鼠開始進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，正常組和模型組小鼠每天灌胃2 mL生理鹽水；水飛薊素灌胃組每天按100 mg/kg灌胃水飛薊素溶液0.2 mL；AEBLS灌胃高、低劑量組小鼠每天按50 mg/kg和100 mg/kg分別灌胃AEBLS，以上灌胃持續(xù)2 周。第14日對除正常組外所有小鼠腹腔注射CCl4誘導(dǎo)劑（2 mL/kg；CCl4與橄欖油體積比1∶1），然后對所有小鼠實(shí)施禁食，但允許自由飲水。禁食24 h后斷頸處死小鼠，心臟取血漿并解剖取肝臟待用[9]。

1.3.3 小鼠血清水平測定

4 000 r/min離心10 min分離血漿，分離上層血采用AST、ALT、ALP、TG、TC、BUN、ALB、SOD、NO、CAT、MDA和GSH-Px試劑盒測定小鼠血清水平[9]。

1.3.4 小鼠血清細(xì)胞因子水平測定

將離心分離到的血清采用IL-6、IL-12、TNF-α和IFN-γ細(xì)胞因子測定試劑盒測定小鼠血清細(xì)胞因子水平[9]。

1.3.5 RT-PCR實(shí)驗(yàn)測定小鼠肝組織mRNA表達(dá)

取小鼠的肝組織粉碎后用RNAzol提取肝組織的總RNA，然后將總RNA稀釋到1 μg/μL。取2 μL稀釋后的總RNA提取液，在其中依次加入1 μL的Oligo（dT）18、RNase、dNTP、MLV酶和10 μL 5×buffer，在條件37 ℃ 120 min，99 ℃ 4 min，4 ℃ 3 min下合成cDNA。然后以cDNA為模板，進(jìn)行Mn-SOD、Cu/Zn-SOD、CAT、GSH-Px、NF-κB-p65、IκB-α、iNOS、COX-2、TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA表達(dá)的擴(kuò)增（表1），同時(shí)以持家基因GAPDH作為內(nèi)參照按同樣條件進(jìn)行擴(kuò)增。最后用含1%溴化乙錠瓊脂電泳檢查PCR擴(kuò)增產(chǎn)物[12]。半定量分析按以下公式計(jì)算。

表達(dá)相對對照組倍數(shù)=（對應(yīng)組相關(guān)表達(dá)強(qiáng)度/對應(yīng)組GAPDH表達(dá)強(qiáng)度）/（對照組相關(guān)表達(dá)強(qiáng)度/對照組GAPDH表達(dá)強(qiáng)度）

表 1 實(shí)驗(yàn)所用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)引物序列Table 1 Sequences of reverse transcription PCR primers used in this study

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，結(jié)果取平均值，然后使用SAS 9.1統(tǒng)計(jì)軟件采用One-way ANOVA方法分析各組數(shù)據(jù)在P＜0.05水平上相互是否具有顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 AEBLS對小鼠肝指數(shù)的影響

表 2 AEBLS對CCl4誘導(dǎo)肝損傷小鼠的體質(zhì)量、肝質(zhì)量和肝指數(shù)的影響（n＝10）Table 2 Effects of AEBLS on body weight, liver weight and liver index in mice with CCl4-induced hepatic damage (n= 10)

如表2所示，各組小鼠的體質(zhì)量無顯著差異，模型組小鼠的肝質(zhì)量顯著高于其他各組（P＜0.05），正常組的肝質(zhì)量最低，通過AEBLS灌胃處理，CCl4誘導(dǎo)肝損傷小鼠的肝質(zhì)量下降，且高劑量AEBLS灌胃小鼠的肝質(zhì)量下降得更多。肝指數(shù)的結(jié)果與肝質(zhì)量結(jié)果相似，模型組的肝指數(shù)最高，隨著AEBLS灌胃劑量的增高肝指數(shù)下降（P＜0.05），100 mg/kg AEBLS灌胃組小鼠肝指數(shù)略高于同劑量藥物水飛薊素灌胃小鼠的肝指數(shù)。

2.2 AEBLS對小鼠血清AST、ALT、ALP、TG、TC、BUN和ALB水平的影響

表 3 AEBLS對CCl4誘導(dǎo)肝損傷小鼠血清AST、ALT、ALP、TG、TC、BUN和ALB水平的影響（n＝ 10）Table 3 Effects of AEBLS on serum levels of AST, ALT, ALP, TG, TC, BUN and ALB in mice with CCl4-induced hepatic damage (n=10)

由表3可以看出，正常組小鼠血清的AST、ALT、ALP、TG、TC、BUN水平最低，ALB水平最高；CCl4誘導(dǎo)肝損傷的模型組呈現(xiàn)出相反的趨勢，AST、ALT、ALP、TG、TC、BUN水平最高，ALB水平最低。水飛薊素和AEBLS灌胃可以顯著下調(diào)肝損傷小鼠的AST、ALT、ALP、TG、TC、BUN水平和上調(diào)ALB水平（P＜0.05），其中水飛薊素使這些指標(biāo)最接近于正常組，而高劑量AEBLS可以使這些指標(biāo)接近于同劑量的水飛薊素。

2.3 AEBLS對小鼠血清SOD、NO、CAT、MDA和GSH-Px水平的影響

表 4 AEBLS對CCl4誘導(dǎo)肝損傷小鼠血清SOD、NO、CAT、MDA和GSH-Px水平的影響（n＝10）Table 4 Effects of AEBLS on serum levels of SOD, NO, CAT, MDA and GSH-Px in mice with CCl4-induced hepatic damage (n= 10)

如表4所示，CCl4將導(dǎo)致小鼠血清中的SOD、CAT、GSH-Px水平下降和NO、MDA水平上升（P＜0.05），水飛薊素和AEBLS均可抑制這些變化，且100 mg/kg的水飛薊素能夠最大程度地抑制這些變化，同劑量AEBLS的效果接近于陽性對照水飛薊素。

2.4 AEBLS對小鼠血清IL-6、IL-12、TNF-α和IFN-γ細(xì)胞因子水平的影響

如表5所示，模型組小鼠血清中的IL-6、IL-12、TNF-α和IFN-γ細(xì)胞因子水平顯著高于其他各組小鼠（P＜0.05）。相對于模型組小鼠，水飛薊素和AEBLS可以顯著下調(diào)小鼠血清中的IL-6、IL-12、TNF-α和IFN-γ細(xì)胞因子水平（P＜0.05），水飛薊素的作用最為明顯，能使小鼠血清中的細(xì)胞因子水平更為接近正常組小鼠，而AEBLS也能起到下調(diào)IL-6、IL-12、TNF-α和IFN-γ細(xì)胞因子水平作用，且高劑量的AEBLS（100 mg/kg）的作用更強(qiáng)。

表 5 AEBLS對CCl4誘導(dǎo)肝損傷小鼠血清IL-6、IL-12、TNF-α和IFN-γ細(xì)胞因子水平的影響（n＝10）Table 5 Effects of AEBLS on serum levels of IL-6, IL-12, TNF-α and IFN-γ in mice with CCl4-induced hepatic damage (n= 10)

2.5 AEBLS對小鼠肝組織中Mn-SOD、Cu/Zn-SOD、CAT和GSH-Px mRNA表達(dá)的影響

Fig. 1 Effects of AEBLS on mRNA expression levels of Mn-SOD, Cu/Zn-SOD, CAT and GSH-Px in liver of the mice with CCl4-induced hepatic damage (n = 6)

表 6 AEBLS對CCl4誘導(dǎo)肝損傷小鼠肝組織中Mn-SOD、Cu/Zn-SOD、CAT和GSH-Px mRNA表達(dá)影響的半定量分析（n＝6）Table 6 Semi-quantitative analysis of the effects of AEBLS on mRNA expression levels of Mn-SOD, Cu/Zn-SOD, CAT andGSH-Px in liver of the mice with CCl4-induced hepatic damage (n＝6)

由圖1和表6可以看出，正常組小鼠肝臟中的Mn-SOD、Cu/Zn-SOD、CAT和GSH-Px mRNA表達(dá)最強(qiáng)，而模型組表達(dá)最弱。水飛薊素灌胃可以顯著上調(diào)肝損傷小鼠肝臟的Mn-SOD、Cu/Zn-SOD、CAT和GSH-Px的mRNA表達(dá)（P＜0.05），AEBLS同樣可以上調(diào)這些表達(dá)，且高劑量的AEBLS效果更為明顯，通過半定量計(jì)算結(jié)果進(jìn)一步看出，100 mg/kg劑量水飛薊素和AEBLS的效果均較為明顯，且兩者沒有顯著差異（P＞0.05）。

2.6 AEBLS對小鼠肝組織中NF-κB-p65、IκB-α、iNOS和COX-2 mRNA表達(dá)的影響

圖 2 AEBLS對CCl4誘導(dǎo)肝損傷小鼠肝組織中NF-κB-p65、IκB-α、iNOS和COX-2 mRNA表達(dá)強(qiáng)度的影響（n＝6）Fig. 2 Effects of AEBLS on mRNA expression levels of NF-κB-p65, IκB-α, iNOS and COX-2 in liver of mice with CCl4-induced hepatic damage (n = 6)

表 7 AEBLS對CCl4誘導(dǎo)肝損傷小鼠肝組織中NF-κB-p65、IκB-α、iNOS和COX-2 mRNA表達(dá)影響的半定量分析（n＝6）Table 7 Semi-quantitative analysis of the effects of AEBLS on mRNA expression levels of NF-κB-p65, IκB-α, iNOS andCOX-2 in liver of mice with CCl4-induced hepatic damage (n= 6)

由圖2和表7可知，CCl4誘導(dǎo)肝損傷后，模型組小鼠肝臟的NF-κB-p65、iNOS和COX-2表達(dá)顯著強(qiáng)于其他各組，而IκB-α表達(dá)則顯著弱于其他各組（P＜0.05）；正常組小鼠肝臟的NF-κB-p65、IκB-α、iNOS和COX-2表達(dá)強(qiáng)度與模型組小鼠相反。相對于陽性對照組水飛薊素和AEBLS可以下調(diào)小鼠肝臟的NF-κB-p65、iNOS、COX-2表達(dá)和上調(diào)IκB-α表達(dá)，且高劑量的AEBLS上調(diào)的NF-κB-p65、iNOS、COX-2表達(dá)和上調(diào)的IκB-α表達(dá)接近陽性對照組（水飛薊素灌胃組）和正常組。

2.7 AEBLS對小鼠肝組織中TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA表達(dá)的影響

由圖3和表8可以看出，正常組小鼠肝臟組織中的TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA表達(dá)最弱，CCl4可導(dǎo)致肝組織中的TNF-α、IL-1β和IL-6的mRNA表達(dá)，AEBLS可抑制TNF-α、IL-1β和IL-6的mRNA表達(dá)，且相同劑量下AEBLS的作用僅略微弱于陽性藥物水飛薊素。

圖 3 AEBLS對CCl4誘導(dǎo)肝損傷小鼠肝組織中TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA表達(dá)強(qiáng)度的影響（n＝6）Fig. 3 Effects of AEBLS on mRNA expression levels of TNF-α, IL-1β and IL-6 in liver of mice with CCl4-induced hepatic damage (n = 6)

表 8 AEBLS對CCl4誘導(dǎo)肝損傷小鼠肝組織中TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA表達(dá)影響的半定量分析（n＝6）Table 8 Semi-quantitative analysis of for the effects of AEBLS on mRNA expression levels of TNF-α,IL-1β andIL-6 in liver of mice with CCl4-induced hepatic damage (n= 6)

3 討 論

肝臟是腹腔內(nèi)最大的實(shí)質(zhì)性器官，肝臟出現(xiàn)損傷后，不僅威脅機(jī)體健康，嚴(yán)重的情況下還將危及生命。肝質(zhì)量和肝指數(shù)作為評價(jià)CCl4誘導(dǎo)肝損傷的程度已經(jīng)被應(yīng)用于研究，高肝質(zhì)量和肝指數(shù)是肝損傷的表現(xiàn)之一[13]，本研究也得到了相似的結(jié)果，結(jié)果顯示，相對于肝損傷小鼠AEBLS可以下調(diào)肝損傷小鼠的肝質(zhì)量和肝指數(shù)，且效果接近于肝損傷治療藥物水飛薊素。

AST主要存在于肝細(xì)胞漿和肝細(xì)胞的線粒體中，而ALT主要存在于肝細(xì)胞漿，肝細(xì)胞壞死會(huì)導(dǎo)致ALT和AST在機(jī)體內(nèi)增加[14]。CCl4引發(fā)肝組織發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，從而肝細(xì)胞膜通透性發(fā)生改變，肝細(xì)胞內(nèi)的ALP水平急劇上升[15]。肝損傷可導(dǎo)致脂肪酸向肝內(nèi)轉(zhuǎn)移，造成肝內(nèi)TG含量的升高，同時(shí)TG和TC也反映肝臟脂質(zhì)過氧化的情況，機(jī)體發(fā)生脂質(zhì)過氧化TG和TC 水平上升[16]。肝損傷影響肝功能將進(jìn)一步導(dǎo)致腎功能受損，使蛋白質(zhì)代謝的產(chǎn)物BUN在血液中的含量提升，同時(shí)肝損傷也將影響ALB在機(jī)體內(nèi)的合成、運(yùn)輸和釋放，使血液中ALB含量下降[17]。

CCl4將導(dǎo)致機(jī)體發(fā)生氧化，機(jī)體自身對氧化損傷能以非酶性和酶性兩種抗氧化2 種方式進(jìn)行防御，其中調(diào)控提升SOD、CAT和GSH-Px是機(jī)體進(jìn)行酶性抗氧化的主要機(jī)制[16]。SOD具有催化超氧化物自由基的作用，能夠清除自由基，同時(shí)CAT和SOD也有協(xié)同作用，加強(qiáng)清楚自由基的作用[18]。CAT是機(jī)體中的一種重要抗氧化酶，CAT能夠清除機(jī)體中的H2O2，從而起到抑制氧化應(yīng)激的作用，減輕CCl4造成的機(jī)體氧化，抑制肝損傷[19]。GSH-Px是一種重要的催化H2O2分解的酶，催化還原型谷胱甘肽對H2O2的還原反應(yīng)能夠保護(hù)細(xì)胞膜，避免細(xì)胞損傷[20]。MDA是脂質(zhì)過氧化的代謝產(chǎn)物，肝損傷后MDA在體內(nèi)大量堆積[16]。NO和其氧化產(chǎn)物含量的增加能夠?qū)е录?xì)胞表面磷脂及蛋白發(fā)生損傷，從而促進(jìn)組織的炎性滲出及損傷[21]。同時(shí)，NO能與超氧陰離子反應(yīng)形成過氧亞硝陰離子ONOO，加劇氧化應(yīng)激反應(yīng)，進(jìn)一步導(dǎo)致細(xì)胞毒性加劇肝損傷[22]。

CCl4能夠?qū)е聶C(jī)體發(fā)生氧化，促使肝臟發(fā)生炎癥反應(yīng)，從而體現(xiàn)在小鼠血清中IL-6、IL-12、TNF-α和IFN-γ水平大幅度上升[9]。IL-6是由Th2細(xì)胞分泌的因子，參與體液免疫應(yīng)答，Th2在機(jī)體中水平升高時(shí)可發(fā)生內(nèi)臟功能性損害[23]。IL-6能夠促進(jìn)T淋巴細(xì)胞的分化、增殖和促進(jìn)抗體的產(chǎn)生，還能夠改變細(xì)胞內(nèi)G細(xì)胞活性和上調(diào)中性粒細(xì)胞功能，對機(jī)體的炎癥反應(yīng)有增強(qiáng)作用[24]。IL-12是NK細(xì)胞的激活因子，而且作用最為強(qiáng)烈，肝損傷時(shí)肝細(xì)胞過度凋亡和過強(qiáng)的免疫應(yīng)答將加劇損傷，這與IL-12增加CD8＋T細(xì)胞的殺傷功能有關(guān)[25]。TNF-α與肝細(xì)胞膜上TNF-αR1結(jié)合，能導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)雙鏈基因組DNA變成寡脫氧核苷酸片段，促使干細(xì)胞凋亡；另外，TNF-α還可以通過激活NF-κB使機(jī)體內(nèi)的炎癥表達(dá)加劇，使肝組織損傷加劇[26]。IFN-γ是前炎癥細(xì)胞因子，能夠加強(qiáng)肝細(xì)胞對TNF-α的敏感性，使肝細(xì)胞更容易受損[27]。肝臟組織受損后出現(xiàn)的氧化應(yīng)激狀態(tài)能引起包括TNF-α、IL-1β和IL-6在內(nèi)的炎癥因子在體內(nèi)的平衡失調(diào)，導(dǎo)致TNF-α、IL-1β和IL-6炎癥因子在肝臟內(nèi)的含量提升[18]。

Mn-SOD和Cu/Zn-SOD是機(jī)體內(nèi)SOD的異構(gòu)體，Mn-SOD是存在于線粒體中的以Mn4＋為活性中心的一種SOD自由基清除劑；Cu/Zn-SOD是存在于胞漿中以Cu2＋和Zn2＋為活性中心的另一種SOD自由基清除劑[28]。肝臟和心臟是含線粒體最豐富的器官，在CCl4誘導(dǎo)肝損傷后Mn-SOD的活性出現(xiàn)明顯下降，本研究也得到了相同的結(jié)果[29]。Cu/Zn-SOD可以清除機(jī)體內(nèi)的O2－?造成的毒性作用，可以保護(hù)內(nèi)臟組織[30]。研究表明CCl4導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，產(chǎn)生大量自由基，Mn-SOD和Cu/Zn-SOD可抑制體內(nèi)的自由基，起到預(yù)防肝損傷的作用[31]。

NF-κB是調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵因子，對包括IL-6和TNF-α等早期炎癥應(yīng)答基因均有影響，炎癥反應(yīng)下體現(xiàn)出強(qiáng)表達(dá)；一般情況下NF-κB和IκB-α處于結(jié)合狀態(tài)體現(xiàn)出無活性，在外因誘發(fā)炎癥狀態(tài)下NF-κB和IκB-α分離，IκB-α可以結(jié)合活化的NF-κB抑制炎癥[32]。NO是一種高活性氧化劑，在肝臟內(nèi)由肝細(xì)胞內(nèi)由活化的NOS產(chǎn)生，在肝損傷發(fā)展到失代償期后，能夠促進(jìn)iNOS的基因高表達(dá)[33]。肝損傷發(fā)生時(shí)由于肝細(xì)胞發(fā)生氧化性應(yīng)激反應(yīng)，炎性因子大量釋放；iNOS是重要的炎癥因子，iNOS活動(dòng)活躍，同時(shí)iNOS誘導(dǎo)產(chǎn)生的NO也促進(jìn)肝臟進(jìn)一步發(fā)生損傷[22]。COX-2也是重要的炎癥因子，機(jī)體組織在正常狀態(tài)下不表達(dá)，肝損傷出現(xiàn)后由于肝細(xì)胞出現(xiàn)損傷，Kupffer細(xì)胞被激活，出現(xiàn)大量的COX-2表達(dá)及合成，加劇肝臟的炎性損傷[33-34]。

蓮子生物堿是一類生物堿混合物，包括蓮心堿、異蓮心堿、甲基蓮心堿等多種成分，研究表明蓮子生物堿具有有清除自由基作用和抗炎作用，本研究通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也得到相似的研究結(jié)果[35]。AEBLS對CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝損傷有較好的預(yù)防作用。AEBLS可以降低肝損傷小鼠的肝質(zhì)量和肝指數(shù)；AEBLS還可以下調(diào)肝損傷小鼠血清中的AST、ALT、ALP、TG、TC、BUN、NO、MDA水平和上調(diào)ALB、SOD、CAT、GSH-Px水平；AEBLS通過其抗炎作用下調(diào)肝損傷小鼠血清中的炎癥細(xì)胞因子IL-6、IL-12、TNF-α和IFN-γ水平；通過RT-PCR實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)AEBLS可以有效上調(diào)肝損傷小鼠肝組織中Mn-SOD、Cu/Zn-SOD、CAT、GSH-Px、IκB-α的mRNA表達(dá)和下調(diào)NF-κB-p65、iNOS、COX-2、TNF-α、IL-1β、IL-6的mRNA表達(dá)。由此可見，AEBLS對CCl4引發(fā)的肝損傷有較好的預(yù)防作用，且效果接近于藥物水飛薊素，是一類具有開發(fā)利用潛質(zhì)的活性物質(zhì)。

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Preventive Effects of Alkaloids Extracted from Ba Lotus Seeds on CCl4-Induced Hepatic Injury in Mice

FENG Xia1, SUN Peng1, YI Ruokun1, PENG Deguang2, ZHAO Xin1,*
(1. Chongqing Engineering Laboratory for Research and Development of Functional Food, Chongqing Engineering Research Center of Functional Food, Chongqing Collaborative Innovation Center for Functional Food, College of Biological and Chemical Engineering, Chongqing University of Education, Chongqing 400067, China; 2. Chongqing Enterprise Engineering Research Center of Ba-lotus Breeding and Deep Processing, Chongqing 400041, China)

The aim of this study was to determine the preventive effects of alkaloids extracted from Ba lotus seeds (AEBLS) on CCl4-induced hepatic injury in mice. AEBLS was purifi ed using 732 exchange resin and then orally administered to mice. Afterwards, the mice were injected with CCl4to induce hepatic injury, and liver index, serum biochemical parameters, and the mRNA expression of related genes in hepatic tissue were evaluated. The results showed that AEBLS could reduce liver weight and liver index in mice with hepatic injury. AEBLS could decrease aspartate aminotransferase (AST), aminotransferase (ALT), alkaline phosphatase (ALP), triglyceride (TG), total cholesterol (TC), urea nitrogen (BUN), nitric oxide (NO) and malondialdehyde (MDA) levels and increase albumin (ALB), superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT) and glutathione peroxidase (GSH-Px) levels of the serum of mice with hepatic injury. Meanwhile, it could also increase serum levels of cytokines such as interleukin-6 (IL-6), IL-12, tumor necrosis factor-alpha (TNF-α) and interferon-γ (IFN-γ). RT-PCR results also confi rmed that AEBLS could upregulate Mn-SOD, Cu/Zn-SOD, CAT, GSH-Px and IκB-α mRNA expression and downregulate NF-κB-p65, iNOS, COX-2, TNF-α, IL-1β and IL-6 mRNA expression in the liver tissue of mice with hepatic injury. Therefore, AEBLS has a good preventive effect on CCl4-induced hepatic injury, which is close to that of silymarin.

Ba lotus seed; alkaloid; mRNA expression; liver index; glutathione peroxidase

10.7506/spkx1002-6630-201717035

TS201.4

A

1002-6630（2017）17-0216-07引文格式：

2017-02-12

重慶高校創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)建設(shè)計(jì)劃資助項(xiàng)目（CXTD201601040）；

重慶市工程技術(shù)研究中心建設(shè)項(xiàng)目（cstc2015yfpt_gcjsyjzx0027）；重慶第二師范學(xué)院校級科研項(xiàng)目（KY201523B）作者簡介：馮霞（1976—），女，副教授，碩士，研究方向?yàn)槭称坊瘜W(xué)與營養(yǎng)學(xué)。E-mail：fengxiacqec@126.com

*通信作者：趙欣（1981—），男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称坊瘜W(xué)與營養(yǎng)學(xué)。E-mail：zhaoxin@cque.edu.cn