枸杞多糖對順鉑誘導(dǎo)小鼠睪丸支持細(xì)胞TM4氧化損傷的影響

王 海，周 游，黃姍婉，高麗萍*

（北京聯(lián)合大學(xué)應(yīng)用文理學(xué)院，生物活性物質(zhì)與功能食品北京市重點實驗室，北京 100191）

枸杞多糖對順鉑誘導(dǎo)小鼠睪丸支持細(xì)胞TM4氧化損傷的影響

王 海，周 游，黃姍婉，高麗萍*

（北京聯(lián)合大學(xué)應(yīng)用文理學(xué)院，生物活性物質(zhì)與功能食品北京市重點實驗室，北京 100191）

目的：研究枸杞多糖（Lycium barbarum polysaccharides，LBP）對順鉑（cis-dichlorodiamineplatinum (Ⅱ)，CDDP）誘導(dǎo)的小鼠睪丸支持細(xì)胞TM4氧化損傷的影響，并探討其可能的作用機制。方法：噻唑藍(lán)法測定CDDP、LBP分別對TM4細(xì)胞生長的影響以及LBP對CDDP誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性的拮抗作用。硫代巴比妥酸法測定細(xì)胞中丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量，二硫代二硝基苯甲酸法測定谷胱甘肽（glutathione，GSH）含量，黃嘌呤氧化酶法測定超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活力。結(jié)果：5～100 mg/L LBP可極顯著提高TM4細(xì)胞存活率（P＜0.01），20～100 mg/L LBP能夠極顯著抑制CDDP造成的細(xì)胞毒性（P＜0.01），50 mg/L的LBP保護(hù)效果最佳。50 mg/L LBP能夠極顯著抑制CDDP（12 mg/L）引起的MDA含量升高以及GSH含量和SOD活力降低（P＜0.01）。結(jié)論：LBP能有效拮抗順鉑誘導(dǎo)的TM4細(xì)胞氧化損傷，其機制與LBP較強的抗氧化作用有關(guān)。

枸杞多糖；順鉑；小鼠睪丸支持細(xì)胞TM4；氧化損傷

王海, 周游, 黃姍婉, 等. 枸杞多糖對順鉑誘導(dǎo)小鼠睪丸支持細(xì)胞TM4氧化損傷的影響[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(17): 198-202. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201717032. http://www.spkx.net.cn

WANG Hai, ZHOU You, HUANG Shanwan, et al. Protective effect of Lycium barbarum polysaccharides on cis-dichlorodiamineplatinum (Ⅱ) -induced oxidative damage in mouse testis sertoli cells TM4[J]. Food Science, 2017, 38(17): 198-202. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201717032. http://www.spkx.net.cn

順鉑（cis-dichlorodiamineplatinum (Ⅱ)，CDDP）是臨床化療應(yīng)用較廣泛的藥物，對腫瘤的治療效果明顯，但對人體產(chǎn)生的毒副作用成為臨床應(yīng)用上的瓶頸。以CDDP為基礎(chǔ)的化療對不同的組織均有損害，如腎、肝、睪丸等，其中腎毒性是CDDP最主要的毒副作用，而生殖毒性也不能被忽視[1]。CDDP在不同動物體中具有遺傳毒性，表現(xiàn)在染色體畸變、姐妹染色體交換和骨髓與精原細(xì)胞的微核實驗中。由于CDDP的精子毒性，幾乎所有使用CDDP臨床化療的癌癥患者都表現(xiàn)出了精子缺乏癥[2-4]。

枸杞多糖（Lycium barbarum polysaccharides，LBP）是從枸杞中提取而得的一種水溶性多糖。枸杞具有藥理活性，主要是因為含有生物活性物質(zhì)LBP。LBP對機體沒有毒性，展示出廣泛的藥理活性。在生殖毒性的防護(hù)方面，有研究表明LBP可以減少熱損傷小鼠生精上皮細(xì)胞的凋亡[5]。黃曉蘭等[6]認(rèn)為LBP可通過抗氧化及調(diào)節(jié)下丘腦-垂體-性腺軸實現(xiàn)對大鼠生殖系統(tǒng)的保護(hù)。Luo Qiong等[7]發(fā)現(xiàn)LBP對高溫和H2O2引起的小鼠生精細(xì)胞及染色體損傷具有修復(fù)和保護(hù)作用?，F(xiàn)代科學(xué)研究表明，LBP除具有很高的抗氧化作用外，同時也具有調(diào)節(jié)免疫、抑制腫瘤、清除自由基、延緩衰老、降血脂和抗疲勞等作用，具有良好的開發(fā)前景[8-10]。

目前，LBP對CDDP所致睪丸支持細(xì)胞（sertoli cell，SC）氧化損傷的影響鮮見報道，本課題探討LBP對CDDP誘導(dǎo)的生殖毒性的防護(hù)作用及其作用機制，為其應(yīng)用于臨床、提高CDDP的化療效果及為癌癥化療提供有效的輔助品提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小鼠睪丸SC（TM4）由中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)提供。

CDDP（注射用凍干粉劑） 齊魯制藥有限公司；LBP（純度≥90%） 南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司；DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清 美國Hyclone公司；噻唑藍(lán)（3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT） 美國Sigma公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒 北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司；丙二醛（malondialdehyde，MDA）、谷胱甘肽（glutathione，GSH）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）測定試劑盒 南京建成生物工程研究所；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

TE2000-M倒置顯微鏡 日本Nikon公司；3K15臺式高速冷凍離心機 德國Sigma公司；MQX-200微孔板分光光度計 美國Bio-Tek公司；WFZ UV-4802H紫外-可見分光光度計 上海尤尼柯儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)

TM4細(xì)胞采用含雙抗和10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基，并置于37 ℃、5% CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。選擇對數(shù)生長期的細(xì)胞進(jìn)行實驗。

1.3.2 CDDP對TM4細(xì)胞生長的影響

將細(xì)胞（1×105個/mL）接種于96 孔板，每孔200 μL。待細(xì)胞生長到融合狀態(tài)，棄掉培養(yǎng)液，每孔加入200 μL含不同質(zhì)量濃度的CDDP（0.0（對照）、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0、32.0、64.0、128.0 mg/L）的無血清培養(yǎng)基。每組設(shè)置6 個平行。在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，棄掉培養(yǎng)液，各孔加入200 μL終質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL MTT，繼續(xù)孵育4 h后，棄去廢液，每孔加入150 μL二甲基亞砜，用酶標(biāo)儀在570 nm波長處測吸光度。按照下式計算細(xì)胞存活率。

1.3.3 LBP對TM4細(xì)胞生長的影響

同1.3.2節(jié)的方法，將CDDP換成不同質(zhì)量濃度的LBP（0（對照）、1、2、5、10、16、25、32、50、64、100、200、400、600、800 mg/L和1 000 mg/L）。計算細(xì)胞存活率。

1.3.4 LBP對CDDP所致TM4細(xì)胞毒性的影響

根據(jù)1.3.1的結(jié)果，實驗分為3組：對照組未加入CDDP和LBP；CDDP組，TM4細(xì)胞CDDP質(zhì)量濃度為12 mg/L；CDDP＋LBP組，在加入12 mg/L CDDP前24 h分別加入不同質(zhì)量濃度的LBP（10、20、30、40、50、60、70、80 mg/L和100 mg/L），不加藥組以相應(yīng)量的無菌水作為對照，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，計算細(xì)胞存活率。

1.3.5 TM4細(xì)胞蛋白濃度及細(xì)胞內(nèi)MDA、GSH含量、SOD活力的測定

根據(jù)1.3.4節(jié)的結(jié)果，將細(xì)胞分為4 個組：對照組，未加入CDDP和LBP；CDDP組，加入12 mg/L CDDP；LBP組，加入50 mg/L LBP；CDDP＋LBP組，加入12 mg/L CDDP和50 mg/L LBP。將2 mL（濃度為1×105個/mL）處于生長期的細(xì)胞接種到6 孔板，待細(xì)胞生長至融合狀態(tài)時，按照實驗分組加藥處理。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，棄去培養(yǎng)液，每孔加入300 μL 0.01 mol/L pH 7.4的磷酸鹽緩沖液，用細(xì)胞刮收集細(xì)胞后，1 000 r/min離心10 min，棄上清液，1 mL上述磷酸鹽緩沖液重懸，于細(xì)胞破碎儀上30 Hz破碎10 s；取勻漿液10 000 r/min離心10 min，收集上清液，按照測試盒說明進(jìn)行操作，測定細(xì)胞蛋白質(zhì)量濃度、MDA、GSH含量以及SOD活力。

1.4 統(tǒng)計分析

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，結(jié)果表示為±s，單因素方差分析對數(shù)據(jù)進(jìn)行Duncan檢驗，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。用Origin 9.1軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 CDDP對TM4細(xì)胞生長的影響

圖 1 CDDP對TM4細(xì)胞存活率的影響Fig. 1 Effect of CDDP on the survival of TM4 cells

用不同質(zhì)量濃度的CDDP處理TM4細(xì)胞24 h，如圖1所示，隨著CDDP質(zhì)量濃度的增大，TM4細(xì)胞存活率逐漸降低。CDDP從1 mg/L開始，各加藥組抑制率與對照組相比有極顯著性差異（P＜0.01）。通過SPSS軟件計算CDDP對TM4細(xì)胞抑制率的半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）為12.276 mg/L，因此選擇12 mg/L質(zhì)量濃度的CDDP用于后續(xù)實驗。

2.2 LBP對TM4細(xì)胞生長的影響

圖 2 LBP對TM4細(xì)胞存活率的影響Fig. 2 Effect of LBP on the survival of TM4 cells

圖2 為LBP處理TM4細(xì)胞24 h后的實驗結(jié)果。當(dāng)LBP質(zhì)量濃度小于50 mg/L時，TM4細(xì)胞存活率隨LBP質(zhì)量濃度升高而增大，與對照組比較，LBP（5mg/L）各組存活率極顯著升高（P＜0.01）。當(dāng)LBP質(zhì)量濃度大于64 mg/L時，TM4細(xì)胞存活率隨LBP質(zhì)量濃度升高呈明顯下降趨勢，除200 mg/L質(zhì)量濃度外，LBP各組細(xì)胞存活率較對照組極顯著降低（P＜0.01）。在LBP質(zhì)量濃度大于200 mg/L后細(xì)胞存活率小于正常細(xì)胞，且存活率大幅度下降，在1 000 mg/L的LBP作用下，細(xì)胞存活率幾乎為0%。這表明在一定程度上LBP可以促進(jìn)細(xì)胞生長，但較高質(zhì)量濃度條件下會抑制細(xì)胞存活。

2.3 LBP對CDDP所致TM4細(xì)胞毒性的影響

圖 3 LBP對CDDP誘導(dǎo)TM4細(xì)胞存活率的影響Fig. 3 Effect of LBP on the survival of TM4 cells exposed to CDDP

用質(zhì)量濃度為12 mg/L的CDDP建立TM4細(xì)胞損傷模型，用不同質(zhì)量濃度LBP提前24 h處理TM4細(xì)胞。結(jié)果如圖3所示，當(dāng)LBP質(zhì)量濃度大于等于20 mg/L時，與CDDP模型組對比，CDDP＋LBP組細(xì)胞存活率極顯著提高（P＜0.01），但隨著LBP濃度的升高細(xì)胞存活率先升高后降低，在LBP濃度為50 mg/L時，細(xì)胞存活率達(dá)到最高62.30%。這表明在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，LBP對CDDP所致細(xì)胞損傷具有明顯的保護(hù)作用，50 mg/L質(zhì)量濃度的LBP保護(hù)效果最佳。

2.4 LBP對CDDP誘導(dǎo)TM4細(xì)胞內(nèi)抗氧化指標(biāo)的影響

表 1 LBP對CDDP誘導(dǎo)TM4細(xì)胞內(nèi)抗氧化指標(biāo)的影響Table 1 Effect of LBP on antioxidant indexes in TM4 cells exposed to CDDP

LBP對CDDP誘導(dǎo)TM4細(xì)胞內(nèi)抗氧化指標(biāo)的影響的實驗結(jié)果見表1。和對照組相比，CDDP組MDA含量極顯著增加（P＜0.01），GSH含量和SOD活力極顯著降低（P＜0.01）；LBP組MDA含量極顯著減少（P＜0.01），GSH含量和SOD活力無顯著差異（P＞0.05），說明CDDP引起TM4細(xì)胞抗氧化水平降低。提前加入LBP預(yù)處理后，和CDDP組比較，CDDP＋LBP組細(xì)胞內(nèi)MDA含量極顯著減少（P＜0.01），GSH含量和SOD活力均極顯著提高（P＜0.01）。結(jié)果表明，LBP可有效拮抗CDDP誘導(dǎo)的TM4細(xì)胞氧化損傷。

3 結(jié)論與討論

最近，化療引起的睪丸功能性障礙已引起人們廣泛的關(guān)注。Ishikawa等[11]報道CDDP化學(xué)療法是一種治療生精細(xì)胞腫瘤最有效的化學(xué)療法，然而對精子有嚴(yán)重的毒性。另外，有研究表明以CDDP為基礎(chǔ)的化學(xué)療法引起了精子中線粒體異常，暫時或永久性的精子活力缺乏或精子減少[12]。Turk等[13]報告說CDDP處理組中睪丸和附睪質(zhì)量的減少歸因于生發(fā)層細(xì)胞厚度在薄壁組織的萎縮和其他病理結(jié)果的惡化。許多研究證明大鼠精子游動性的顯著性降低與注射CDDP有關(guān)[13-14]。

SC是存在于睪丸生精小管內(nèi)皮，從曲細(xì)精管基底膜直達(dá)管腔的長錐形上皮樣貼壁生長的細(xì)胞，其主要作用是支持生精細(xì)胞生長，為生精細(xì)胞的分化發(fā)育提供合適的微環(huán)境。在哺乳動物的睪丸組織中，SC在形成和保護(hù)精子的過程中起關(guān)鍵作用[15]，是生精小管的重要組成部分。SC數(shù)量決定生精細(xì)胞數(shù)量、睪丸大小以及精子產(chǎn)量等[16]。任何可能影響男性幼年SC數(shù)量處于正常值范圍內(nèi)的生殖毒性物質(zhì)將間接影響其在成年后的生育情況。因此，減輕CDDP造成的生殖毒性顯得至關(guān)重要。LBP作為一種天然活性物質(zhì)，具有較強的細(xì)胞保護(hù)作用和免疫活性[17]。在本實驗中，LBP在0～50 mg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)可劑量依賴性地提高TM4細(xì)胞存活率，在20～100 mg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)可極顯著提高CDDP損傷的細(xì)胞存活率（P＜0.01），以終質(zhì)量濃度50 mg/L效果最佳，表明一定質(zhì)量濃度的LBP對CDDP誘導(dǎo)的TM4細(xì)胞毒性有明顯的保護(hù)作用。

但是，關(guān)于CDDP所致生殖毒性的機制尚未完全闡述清楚，一種觀點認(rèn)為，脂質(zhì)過氧化和氧化應(yīng)激是CDDP細(xì)胞毒性機制之一[18]。氧自由基廣泛存在于體內(nèi)各種組織中，可以破壞氧化與抗氧化的平衡。機體內(nèi)氧自由基能引發(fā)生物膜中脂質(zhì)過氧化作用，形成脂質(zhì)過氧化物如MDA、酮基等，導(dǎo)致細(xì)胞代謝、功能和結(jié)構(gòu)的改變[19]。體內(nèi)產(chǎn)生過多的自由基或清除自由基的能力降低將引發(fā)機體和組織功能障礙[20]。由于藥物毒性的分子生物學(xué)機制，活性氧和氧化性損傷可能通過減弱精子的功能引起雄性不育。已經(jīng)確定在低生育或不育男性的精漿和精子中有過多的氧自由基產(chǎn)生[21]。本實驗指出，CDDP可極顯著提高TM4細(xì)胞中MDA含量（P＜0.01），Atessahin等[14]在一項研究中報道，CDDP能夠引起血漿、精子和睪丸組織中MDA水平的增加，與本研究結(jié)果一致。另外，在用50 mg/L的LBP進(jìn)行干預(yù)后發(fā)現(xiàn)，LBP保護(hù)組TM4細(xì)胞中MDA含量極顯著減少（P＜0.01），LBP和CDDP聯(lián)合處理組的MDA含量同樣極顯著降低，趨于正常對照組水平（P＞0.05）。王建華等[22-23]經(jīng)過提取，研究了LBP不同組分的抗羥基氧化和抗脂質(zhì)過氧化的作用。結(jié)果表明，LBP可以清除羥基所導(dǎo)致的MDA的產(chǎn)生，抑制羥基所致細(xì)胞膜流動性下降和線粒體膨脹程度，減少紅細(xì)胞出現(xiàn)溶血現(xiàn)象，從而起到抗羥基氧化的作用。本研究結(jié)果說明一定質(zhì)量濃度的LBP能夠清除TM4細(xì)胞內(nèi)過多的脂質(zhì)過氧化物，從而保護(hù)細(xì)胞免受因自由基引起的氧化損傷。

GSH是細(xì)胞防御有毒化合物或氧化應(yīng)激化學(xué)反應(yīng)的最重要的分子之一。細(xì)胞中GSH的含量減少和GSH合成能力的降低使細(xì)胞對特定的藥物變得敏感，GSH含量升高是保持細(xì)胞內(nèi)巰基氧化還原狀態(tài)的主要機制[24]。細(xì)胞內(nèi)GSH合成量增加，GSH用于解毒提示機體內(nèi)存在著抵抗化學(xué)損傷的重要保護(hù)機制[25]。SOD是一種金屬蛋白，和GSH有相似的功能，都能夠清除氧自由基，從而保護(hù)細(xì)胞免受超氧化物自由基的損傷[26]。邵鴻娥等[27]在LBP對小鼠體內(nèi)抗氧化酶活性及耐力的影響的實驗中發(fā)現(xiàn)，LBP可使小鼠血中SOD活力明顯升高、MDA含量明顯降低，認(rèn)為LBP具有良好的體內(nèi)抗氧化作用，可以延緩衰老。本研究結(jié)果表明，CDDP模型組GSH含量和SOD活力明顯低于對照組，提示CDDP誘發(fā)產(chǎn)生的自由基超出細(xì)胞抗氧化系統(tǒng)的代償能力，最終引起細(xì)胞的氧化損傷。本實驗中，50 mg/L LBP＋CDDP組較CDDP組GSH含量和SOD活力極顯著提高（P＜0.01）。實驗同時測定LBP對正常TM4細(xì)胞抗氧化指標(biāo)的影響，結(jié)果表明LBP可極顯著降低MDA水平，提高GSH含量和SOD活力（P＜0.01）。提示LBP對CDDP誘導(dǎo)的TM4細(xì)胞氧化損傷具有明顯的拮抗作用。

綜上所述，LBP能夠在一定質(zhì)量濃度范圍提高TM4細(xì)胞存活率，可拮抗CDDP所致TM4細(xì)胞的氧化損傷，然而LBP對CDDP誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡及是否通過阻滯細(xì)胞周期來拮抗CDDP生殖毒性，仍需進(jìn)一步研究。

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Protective Effect of Lycium barbarum Polysaccharides on cis-Dichlorodiamineplatinum (Ⅱ)-Induced Oxidative Damage in Mouse Testis Sertoli Cells TM4

WANG Hai, ZHOU You, HUANG Shanwan, GAO Liping*
(Beijing Key Laboratory of Bioactive Substances and Functional Foods, College of Arts and Sciences, Beijing Union University, Beijing 100191, China)

Objective: To explore the effect of Lycium barbarum polysaccharides (LBP) on cis-dichlorodiamineplatinum (II) (CDDP)-induced oxidative damage in mouse testis sertoli cells TM4 and its possible mechanism. Methods: The survival rate of the cells was evaluated by MTT assay. Superoxide dismutase (SOD) activity was examined by xanthine oxidase method. Malondialdehyde (MDA) content was measured by thiobarbituric acid assay. Glutathione (GSH) content was determined by nitrobenzoic acid method. Results: LBP at 5–100 mg/L could signifi cantly enhance the survival rate of TM4 cells (P ＜ 0.01), and at 20–100 mg/L could signifi cantly inhibit the toxic effect of CDDP on TM4 cells (P ＜ 0.01), and the best protective effect was observed as 50 mg/L. LBP at 50 mg/L could significantly reduce intracellular MDA content, increase SOD activity and GSH levels drop compared with CDDP control group (P ＜ 0.01). Conclusion: CDDP-induced damage in TM4 cells could be remarkably reversed by LBP, which may be related with the strong antioxidant potential of LBP.

Lycium barbarum polysaccharides (LBP); cis-dichlorodiamineplatinum (Ⅱ); mouse testis sertoli cells TM4; oxidative damage

10.7506/spkx1002-6630-201717032

R285.6

A

1002-6630（2017）17-0198-05引文格式：

2016-12-10

北京市自然科學(xué)基金項目（7163211）

王海（1992—），男，碩士，研究方向為生物活性物質(zhì)對機體的生化作用。E-mail：916319176@qq.com

*通信作者：高麗萍（1962—），女，教授，博士，研究方向為生物活性物質(zhì)對機體的生化作用。E-mail：gaolip62@163.com