遠(yuǎn)志多糖的分離純化、結(jié)構(gòu)特征及生物活性

景永帥，張丹參，吳蘭芳*，鄭玉光

（1.河北科技大學(xué)化學(xué)與制藥工程學(xué)院，河北 石家莊 050018；2.河北中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，河北 石家莊 050200）

遠(yuǎn)志多糖的分離純化、結(jié)構(gòu)特征及生物活性

景永帥1，張丹參1，吳蘭芳2,*，鄭玉光2

（1.河北科技大學(xué)化學(xué)與制藥工程學(xué)院，河北 石家莊 050018；2.河北中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，河北 石家莊 050200）

目的：分離純化遠(yuǎn)志多糖（polysaccharide of Polygala tenuifolia，PTP），并對(duì)其理化性質(zhì)、抗氧化和降血糖活性進(jìn)行研究。方法：采用超聲波輔助提取、分級(jí)醇沉、DEAE-cellulose 52和Sephadex G-100柱色譜分離純化遠(yuǎn)志多糖；紫外-可見光譜掃描法、比旋光度法、凝膠滲透色譜法3 種方法驗(yàn)證純度；高效凝膠滲透色譜法測(cè)定相對(duì)分子質(zhì)量，高效陰離子交換色譜測(cè)定單糖組成；清除1,1-二苯基-2-苦味基肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基和羥自由基評(píng)價(jià)體外抗氧化活性；測(cè)定對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制能力以研究其降血糖活性。結(jié)果：遠(yuǎn)志多糖經(jīng)分離純化后獲得組分PTP-1，經(jīng)3 種方法驗(yàn)證PTP-1為均一性良好的多糖，相對(duì)分子質(zhì)量為4.62×104，由半乳糖、葡萄糖、甘露糖組成，物質(zhì)的量比為3.92∶1.00∶2.08?？寡趸钚匝芯拷Y(jié)果表明，PTP-1對(duì)清除DPPH自由基和羥自由基呈良好的量效關(guān)系，半數(shù)清除率濃度IC50分別為0.35 mg/mL和0.51 mg/mL。降血糖活性結(jié)果表明，PTP-1對(duì)α-葡萄糖苷酶具有較好的抑制能力，IC50值為0.52 mg/mL。結(jié)論：遠(yuǎn)志多糖PTP-1為具有抗氧化和降血糖活性的均一多糖。

遠(yuǎn)志；多糖；理化性質(zhì)；抗氧化活性；降血糖活性

景永帥, 張丹參, 吳蘭芳, 等. 遠(yuǎn)志多糖的分離純化、結(jié)構(gòu)特征及生物活性[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(17): 126-131.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201717021. http://www.spkx.net.cn

JING Yongshuai, ZHANG Danshen, WU Lanfang, et al. Purifi cation and structural characterization of polysaccharide from Polygala tenuifolia and its biological activity[J]. Food Science, 2017, 38(17): 126-131. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201717021. http://www.spkx.net.cn

遠(yuǎn)志為遠(yuǎn)志科植物遠(yuǎn)志（Polygala tenuifolia Willd.）的干燥根，具有安神益智、交通心腎、祛痰、消腫等功效[1]，已報(bào)道的化學(xué)成分主要包含三萜皂苷類、糖類、?酮類，也含有少量的生物堿、香豆素、木質(zhì)素類等[2-3]。遠(yuǎn)志始記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，被視為上品，為常用的藥食兩用資源，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明遠(yuǎn)志具有抗老年癡呆、抗抑郁、抗腫瘤、抗氧化以及改善記憶能力等作用[4-6]。

近年來(lái)，隨著多糖研究的深入，植物多糖的多種生物活性逐漸被發(fā)現(xiàn)，包括免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗氧化、降血糖以及抗病毒等，而且中藥多糖含量豐富，來(lái)源廣泛，細(xì)胞毒性低，是一種理想的保健食品開發(fā)來(lái)源[7]。據(jù)文獻(xiàn)調(diào)研，目前對(duì)于遠(yuǎn)志的研究主要集中在皂苷、揮發(fā)油、寡糖酯和生物堿等成分及其藥理活性的研究，而對(duì)于其多糖的研究報(bào)道較少，如Xin Tao等[8]從遠(yuǎn)志中分離得到2 個(gè)酸性多糖，可增強(qiáng)荷瘤小鼠的超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和過氧化氫酶（catalase，CAT）活力，且具有較好的抑制肺腺癌細(xì)A549的作用；另外，包括遠(yuǎn)志多糖的含量測(cè)定[9-10]和提取工藝[6]等方面的研究。但對(duì)于遠(yuǎn)志純化多糖的結(jié)構(gòu)表征、抗氧化以及降血糖活性等方面研究鮮見報(bào)道。

因此，本實(shí)驗(yàn)在前期提取工藝及抗氧化活性追蹤的基礎(chǔ)上[6]，對(duì)遠(yuǎn)志多糖進(jìn)行分離純化，并對(duì)其理化性質(zhì)及其抗氧化和降血糖活性進(jìn)行研究，旨在為更好地開發(fā)和利用遠(yuǎn)志中的多糖組分，同時(shí)可為明確遠(yuǎn)志的活性物質(zhì)基礎(chǔ)提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

遠(yuǎn)志購(gòu)自河北安國(guó)藥材市場(chǎng)，經(jīng)河北中醫(yī)學(xué)院鄭玉光教授鑒定為遠(yuǎn)志科植物遠(yuǎn)志（Polygala tenuifolia Willd.）的干燥根。

DEAE-cellulose 52、Sephadex G-100、Sephacryl S-300 HR 美國(guó)GE Healthcare公司；標(biāo)準(zhǔn)品葡聚糖Dextran系列（T4、T7、T10、T70、T200）、藍(lán)葡聚糖、各標(biāo)準(zhǔn)單糖、1,1-二苯基-2-苦味基肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、VC、α-葡萄糖苷酶、4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷（4-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside，PNPG） 美國(guó)Sigma公司；阿卡波糖德國(guó)拜耳公司；其他化學(xué)試劑為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

DBS-100自動(dòng)部分收集器、恒流泵 上海滬西分析儀器廠有限公司；EYELA N-1000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀日本東京理化器械公司；QP2010氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）聯(lián)用儀、TU-2450紫外-可見分光光度計(jì) 日本島津公司；傅里葉變換紅外光譜儀 德國(guó)Bruker公司；WZZ-2B自動(dòng)旋光儀 上海精密科學(xué)儀器廠；Dionex ICS-2500高效離子色譜 美國(guó)戴安公司；3110型酶標(biāo)儀 美國(guó)Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 遠(yuǎn)志粗多糖的提取

準(zhǔn)確稱取遠(yuǎn)志粉末500 g，使用10 倍體積的95%食用乙醇回流提取2 次，每次2 h，以除去其中的脂溶性成分，過濾后取濾渣風(fēng)干，備用。稱量醇提后的遠(yuǎn)志殘?jiān)?30 g，加入10 倍體積的蒸餾水提取，在超聲波輔助的條件下，67 ℃恒溫提取2 次，每次0.5 h，合并水提液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至一定體積，使用4 倍體積的無(wú)水乙醇沉淀（乙醇終體積分?jǐn)?shù)為80%），4 ℃靜置24 h，離心，沉淀為粗多糖PTP80[6]。PTP80使用木瓜蛋白酶結(jié)合Sevag法除蛋白，用XAD-7型大孔樹脂進(jìn)行脫色處理，分別用自來(lái)水、蒸餾水各透析48 h[11]，減壓濃縮，真空冷凍干燥后得到遠(yuǎn)志粗多糖PTP。

1.3.2 遠(yuǎn)志粗多糖的分離純化

將粗多糖溶于少量蒸餾水中，配制成50 mg/mL多糖溶液，在多糖分離純化系統(tǒng)上，采用DEAE-cellulose 52柱（4.0 cm×80.0 cm）以0.0～1.0 mol/L NaCl線性洗脫，根據(jù)線性洗脫結(jié)果確定梯度洗脫的條件，自動(dòng)部分收集（每管收集5.0 mL），以苯酚-硫酸法檢測(cè)各梯度中多糖組分的位置，分別收集相應(yīng)梯度的多糖組分，透析脫鹽后濃縮凍干得純化后多糖樣品，下一步采用Sephadex G-100柱（2.6 cm×100.0 cm）以蒸餾水為洗脫液，自動(dòng)部分收集（每管收集3.0 mL），以苯酚-硫酸法檢測(cè)多糖洗脫情況，分別收集相應(yīng)的多糖組分，透析后濃縮凍干，得純化后多糖樣品。

1.3.3 遠(yuǎn)志多糖的純度驗(yàn)證

1.3.3.1 紫外-可見光譜分析

將樣品配制成質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL的溶液，在200～700 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描。

1.3.3.2 比旋光度法分析

在20 ℃鈉光下，分別使用體積分?jǐn)?shù)30%、60%、80%的乙醇沉淀多糖溶液，測(cè)定沉淀物的旋光度值。

1.3.3.3 凝膠滲透色譜法分析

樣品上樣于Sephacryl S-300 HR凝膠柱，以蒸餾水為洗脫液，苯酚-硫酸法檢測(cè)多糖洗脫情況，以流出液的管數(shù)為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制洗脫曲線[12]。

1.3.4 遠(yuǎn)志多糖分子質(zhì)量測(cè)定

采用高效凝膠滲透色譜（high performance gel permeation chromatography，HPGPC）測(cè)定遠(yuǎn)志多糖PTP-1的相對(duì)分子質(zhì)量（Mr）[12]。以T系列葡聚糖T4、T7、T10、T70、T200制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，用Mr為200萬(wàn)的藍(lán)葡聚糖確定凝膠柱的空體積V0，以葡萄糖確定凝膠柱的總柱體積Vt，以有效分配系數(shù)Kav為縱坐標(biāo)，lgMr為橫坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，分配系數(shù)Kav根據(jù)公式（1）計(jì)算。

式中：Ve為待測(cè)樣品的洗脫體積/mL；V0為色譜柱空體積/mL；Vt為色譜柱總體積/mL。

配制成質(zhì)量濃度為2.0 mg/mL的多糖PTP-1溶液，上Sephacyl S-300 HR凝膠柱，根據(jù)出峰體積，計(jì)算Kav，代入上述標(biāo)準(zhǔn)曲線中，可計(jì)算PTP-1的Mr。

1.3.5 遠(yuǎn)志多糖的理化性質(zhì)測(cè)定

采用硫酸-苯酚法[12]測(cè)定總糖含量；采用Folin-酚法[13]測(cè)定蛋白含量；采用咔唑-硫酸法[14]測(cè)定糖醛酸含量；采用氯化鋇-明膠比濁法[15]測(cè)定硫酸根含量；自動(dòng)旋光儀測(cè)定其比旋光度[11]。

1.3.6 遠(yuǎn)志多糖的紅外光譜分析

稱取1.0 mg遠(yuǎn)志多糖PTP-1，以KBr混合研磨成粉，壓片，在4 000～400 cm－1范圍內(nèi)進(jìn)行紅外光譜掃描[11]。

1.3.7 遠(yuǎn)志多糖的DSC-TGA分析

稱取10.0 mg的遠(yuǎn)志多糖PTP-1，溫度由室溫升至800 ℃，升溫速率為10 ℃/min，進(jìn)行熱重分析，包括差示掃描量熱（differential scanning calorimetry，DSC）法和熱重分析（thermal gravimetric analysis，TGA）。以溫度為X軸，以質(zhì)量損失率（某一溫度下失質(zhì)量后樣品的實(shí)測(cè)質(zhì)量與樣品總質(zhì)量的比值）為Y軸，繪制熱重變化曲線。

1.3.8 遠(yuǎn)志多糖的單糖組成分析

配成質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液（L-阿拉伯糖、L-鼠李糖、L-巖藻糖、D-果糖、D-甘露糖、D-葡萄糖和D-半乳糖），量取20.0 μL進(jìn)行高效陰離子交換色譜-脈沖電流探測(cè)（high performance anion-exchange chromatography with pulsed amperometric detection，HPAEC-PAD）法測(cè)定。稱取PTP-1多糖2.0 mg，加入2.0 mL的2 mol/L三氟乙酸（trifi uoroacetic acid，TFA），封管后110 ℃水解6 h，減壓濃縮蒸干TFA，加入適量蒸餾水溶解，取20.0 μL進(jìn)行HPAEC-PAD測(cè)定，根據(jù)各峰的保留時(shí)間和峰面積比計(jì)算出各單糖的組成和物質(zhì)的量比[13]。

1.3.9 遠(yuǎn)志多糖的甲基化反應(yīng)及GC-MS分析

甲基化反應(yīng)的方法，參考改良的Hakomori法及文獻(xiàn)[11,13]方法進(jìn)行，反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)紅外光譜檢測(cè)，在3 500～3 300 cm－1處無(wú)羥基的特征吸收峰，說(shuō)明樣品甲基化完全。取甲基化完全的多糖樣品，依次使用TFA水解，硼氫化鈉還原，醋酸酐乙酰化后，對(duì)乙?；a(chǎn)物進(jìn)行GC-MS分析。

1.3.10 遠(yuǎn)志多糖的抗氧化活性測(cè)定

遠(yuǎn)志多糖清除DPPH自由基、羥自由基（?OH）的測(cè)定參照文獻(xiàn)[16-18]方法進(jìn)行測(cè)定。

1.3.11 體外降血糖活性測(cè)定

[19]方法，以PNPG為底物，測(cè)定α-葡萄糖苷酶的活性。具體操作為：以pH 6.8的磷酸緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）配制反應(yīng)液，PTP-1（0.05～6.4 mg/mL）和阿卡波糖（0.05～6.4 mg/mL）分別與α-葡萄糖苷酶（1 U/mL）20 μL混勻，37 ℃孵育10 min，再加入底物5 mmol /L PNPG 20 μL，混勻，37 ℃反應(yīng)30 min 后，加入0.2 mol/L Na2CO3終止反應(yīng)。反應(yīng)產(chǎn)物于405 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以等體積溶劑PBS作為空白對(duì)照，阿卡波糖作為陽(yáng)性對(duì)照。樣品對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率根據(jù)公式（2）計(jì)算。

式中：A0為以等量PBS代替樣品溶液的吸光度；AS為加入PTP-1或阿卡波糖溶液反應(yīng)后的吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 遠(yuǎn)志多糖的提取、分離和純化

遠(yuǎn)志經(jīng)乙醇除脂、超聲波輔助提取、乙醇沉淀、除蛋白質(zhì)、除色素、透析凍干后，得到遠(yuǎn)志粗多糖PTP 27.3 g，提取率為5.46%。粗多糖PTP經(jīng)DEAE-cellulose 52離子交換柱分離，分別在水洗脫與梯度鹽洗脫部分得到2 個(gè)主峰，分別為PTP-A和PTP-B。選取PTP-B為下一步分離對(duì)象，經(jīng)Sephadex G-100凝膠柱純化，得到對(duì)稱的單峰組分，透析后濃縮凍干得純化后多糖樣品PTP-1。

2.2 遠(yuǎn)志多糖的純度驗(yàn)證

紫外-可見分光光度計(jì)結(jié)果表明，PTP-1在260 nm和280 nm波長(zhǎng)處均無(wú)明顯特征吸收，說(shuō)明多糖中不含有蛋白質(zhì)和核酸，在620 nm波長(zhǎng)處無(wú)吸收峰則表明不含色素類物質(zhì)。在3 種乙醇體積分?jǐn)?shù)下，PTP-1的比旋光度基本相同，分別為：＋71.7°、＋71.4°、＋72.0°，表明其為相對(duì)均一多糖。

圖 1 PTP-1的Sephacryl S-300 HR凝膠柱層析洗脫曲線Fig. 1 Elution profi le of PTP-1 in Sephacryl S-300 HR column

由圖1可知，分離純化后的PTP-1在Sephacryl S-300 HR凝膠柱層析中獲得單一、對(duì)稱的洗脫峰。經(jīng)紫外-可見光譜掃描法、比旋光度法、HPGPC驗(yàn)證多糖PTP-1的純度，表明PTP-1為均一性良好的多糖。

2.3 遠(yuǎn)志多糖相對(duì)分子質(zhì)量及理化性質(zhì)

根據(jù)葡聚糖Dextran系列制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為：Y=－0.439 3X＋14.010 0（R2=0.998 9）。計(jì)算出PTP-1的相對(duì)分子質(zhì)量為4.62×104。理化性質(zhì)分析結(jié)果表明：遠(yuǎn)志多糖PTP-1為總糖含量為98.6%，比旋光度平均值為＋71.7°，且不含有蛋白、糖醛酸和硫酸根的中性多糖。

2.4 遠(yuǎn)志多糖的紅外光譜分析

圖 2 遠(yuǎn)志多糖PTP-1的紅外光譜圖Fig. 2 FT-IR spectrum of PTP-1

如圖2所示，3 420 cm－1附近處強(qiáng)吸收峰為—OH的伸縮振動(dòng)峰；在2 960、1 652、1 403、1 190、1 065 cm－1處的吸收均為多糖的特征吸收，824 cm－1和896 cm－1處的吸收顯示在結(jié)構(gòu)中同時(shí)含有α和β兩種糖苷鍵構(gòu)型存在[16]。

2.5 遠(yuǎn)志多糖的DSC-TGA分析

圖 3 PTP-1的熱重分析曲線Fig. 3 DSC-TGA curve of PTP-1

由圖3可知，遠(yuǎn)志多糖PTP-1有4 次明顯的質(zhì)量損失過程。第1次質(zhì)量損失出現(xiàn)在100 ℃左右，質(zhì)量損失率為7.495%，推測(cè)其可能是多糖受熱失去部分吸附水造成的；第2次質(zhì)量損失出現(xiàn)在200 ℃左右，質(zhì)量損失率為9.497%，推測(cè)其可能是多糖受熱失去層間結(jié)合水或膠體水造成的；第3次質(zhì)量損失出現(xiàn)在250～600 ℃，質(zhì)量損失率為48.77%，在此溫度區(qū)間內(nèi)多糖快速質(zhì)量損失，表明PTP-1在該溫度區(qū)間內(nèi)發(fā)生了劇烈的分解，推測(cè)為碳鏈和氫鍵斷裂造成的；600 ℃以后，質(zhì)量損失趨勢(shì)減緩，PTP-1進(jìn)一步分解。

2.6 遠(yuǎn)志多糖的單糖組成分析

圖 4 標(biāo)準(zhǔn)單糖的高效離子色譜圖Fig. 4 HPAEC-PAD chromatograms of standard monosaccharides

圖 5 PTP-1完全酸水解的高效離子色譜圖Fig. 5 HPAEC-PAD chromatogram of PTP-1

經(jīng)與標(biāo)準(zhǔn)單糖的高效離子色譜保留時(shí)間和峰面積對(duì)照分析（圖4、5），結(jié)果表明：PTP-1由半乳糖（galactose，Gal）、葡萄糖（glucose，Glc）、甘露糖（mannose，Man）組成，其物質(zhì)的量比為3.92∶1.00∶2.08。

2.7 遠(yuǎn)志多糖的甲基化分析

表 1 遠(yuǎn)志多糖PTP-1甲基化分析Table 1 Methylation analysis of PTP-1

根據(jù)Hakomori法對(duì)遠(yuǎn)志多糖PTP-1進(jìn)行甲基化5 次后，進(jìn)行紅外光譜分析，在3 600～3 300 cm－1范圍內(nèi)無(wú)—OH的特征吸收峰，說(shuō)明樣品甲基化完全。對(duì)乙?；a(chǎn)物進(jìn)行GC-MS分析，結(jié)果見表1，結(jié)果表明，PTP-1由3 種單糖：Gal、Glc、Man組成，這與HPAEC-PAD單糖組成分析結(jié)果一致，其中，Gal主要以1→鍵型存在，Man主要以1→4鍵型存在，Glc主要以1→3,6、1→6鍵型存在。根據(jù)以上結(jié)果可以推測(cè)，構(gòu)成PTP-1的主鏈為1→4連接的Man和1→6連接的Glc，該糖鏈的分枝點(diǎn)殘基為1,3,6→Glc，分枝點(diǎn)應(yīng)在O-6上；Gal構(gòu)成糖鏈的末端。

2.8 遠(yuǎn)志多糖的抗氧化活性

圖 6 遠(yuǎn)志多糖PTP-1和VC對(duì)DPPH自由基的清除活性Fig. 6 DPPH radical scavenging activity of PTP-1 and VC

由圖6可知，在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，隨著多糖質(zhì)量濃度的增加，對(duì)DPPH自由基清除率逐漸增加，其中，在質(zhì)量濃度為0.8 mg/mL時(shí)，遠(yuǎn)志多糖的清除率達(dá)到72.8%，但清除率低于VC。遠(yuǎn)志多糖PTP-1和VC對(duì)DPPH自由基的半數(shù)清除率濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）分別為0.35 mg/mL和0.15 mg/mL。

圖 7 遠(yuǎn)志多糖PTP-1和VC對(duì) OH的清除活性Fig. 7 Hydroxyl radical scavenging activity of PTP-1 and VC

如圖7所示，在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，隨著PTP-1質(zhì)量濃度的增加，對(duì)?OH清除率逐漸增加，呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系。其中，在質(zhì)量濃度為0.8 mg/mL時(shí)，遠(yuǎn)志多糖的清除率達(dá)到63.3%，但清除效果不如對(duì)照品VC明顯。PTP-1和VC對(duì)?OH清除率的IC50值分別為0.51 mg/mL和0.16 mg/mL。

體外抗氧化研究結(jié)果表明，遠(yuǎn)志多糖具有較強(qiáng)的清除自由基的能力，推測(cè)可能與多糖分子含有的單糖種類和糖苷鍵連接方式有關(guān)，多糖分子中含有大量的羥基，羥基上的氫和化學(xué)性質(zhì)活潑的?OH反應(yīng)，生成穩(wěn)定碳自由基和水，達(dá)到清除?OH的目的；或者多糖環(huán)上的羥基可與產(chǎn)生?OH等所必需的金屬離子（如Fe2＋、Cu2＋等）絡(luò)合，使其不能產(chǎn)生啟動(dòng)脂質(zhì)過氧化的?OH，從而抑制活性自由基的產(chǎn)生[20]。另外，多糖自身大分子具有空間結(jié)構(gòu)，可對(duì)DPPH自由基或?OH產(chǎn)生包合作用，從而抑制自由基反應(yīng)[21]。如封燕等[22]報(bào)道的金蟬花多糖由Glc、Man和Gal組成，當(dāng)質(zhì)量濃度為0.8 mg/mL時(shí)，對(duì)DPPH自由基和?OH的清除率分別為79.16%和94.12%，和本研究的結(jié)果相一致。

2.9 遠(yuǎn)志多糖的體外降血糖活性

表 2 阿卡波糖及遠(yuǎn)志多糖PTP-1對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活性Table 2 Inhibitory effects of PTP-1 and acarbose on α-glucosidase activity

如表2所示，PTP-1對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活性隨質(zhì)量濃度增加而增大，在6.40 mg/mL時(shí)達(dá)到81.66%。計(jì)算得到阿卡波糖的IC50值為0.45 mg/mL，PTP-1與阿卡波糖的IC50值較為接近，為0.52 mg/mL。由結(jié)果可知，PTP-1具有較強(qiáng)的α-葡萄糖苷酶抑制活性。研究者發(fā)現(xiàn)，荔枝多糖、蛹蟲草多糖以及南瓜多糖等具有較強(qiáng)的抑制α-葡萄糖苷酶的活性，并且這些活性多糖主要由Gal、Glc、Man等構(gòu)成，如蛹蟲草多糖由Gal、Glc、Man組成，比例為3.22∶39.90∶2.39[23]；南瓜多糖也由Man、Glc、Gal組成，比例為5.50∶1.00∶7.47[24]；荔枝多糖主要是由Glc、Gal、Man、阿拉伯糖、鼠李糖等組成[25]，本實(shí)驗(yàn)的中遠(yuǎn)志多糖由Gal、Glc、Man組成，比例為3.92∶1.00∶2.08，具有較強(qiáng)的對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活性，與文獻(xiàn)報(bào)道的單糖組成相似，只是單糖組成比例有所不同。

3 結(jié) 論

采用超聲波輔助提取法、經(jīng)過分級(jí)醇沉、除蛋白、除色素、透析、冷凍干燥后得到遠(yuǎn)志粗多糖。遠(yuǎn)志粗多糖經(jīng)DEAE-cellulose 52和Sephadex G-100柱依次分離純化得到組分PTP-1，采用3 種方法驗(yàn)證了其純度，表明遠(yuǎn)志多糖PTP-1為均一性良好的多糖。PTP-1的相對(duì)分子質(zhì)量為4.62×104，是由Gal、Glc、Man組成，物質(zhì)的量比為：3.92∶1.00∶2.08，總糖含量為98.6%，比旋光度平均值為＋71.7°，且不含有蛋白質(zhì)、糖醛酸和硫酸根的中性多糖。

抗氧化活性結(jié)果表明，在一定的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)遠(yuǎn)志多糖PTP-1對(duì)DPPH自由基和?OH均具有明顯的劑量效應(yīng)，IC50值分別為0.35 mg/mL和0.51 mg/mL，相對(duì)于遠(yuǎn)志粗多糖清除DPPH自由基和?OH的IC50值分別為0.83、1.29 mg/mL[5]，純化后抗氧化能力得到提高，說(shuō)明遠(yuǎn)志多糖具有較強(qiáng)的抗氧化能力，推測(cè)可能與多糖分子中含有的單糖種類、糖苷鍵連接方式、羥基基團(tuán)以及空間結(jié)構(gòu)等相關(guān)。降血糖活性研究表明，遠(yuǎn)志多糖PTP-1具有較強(qiáng)的α-葡萄糖苷酶抑制活性，IC50值為0.52 mg/mL，說(shuō)明遠(yuǎn)志多糖與α-葡萄糖苷酶形成競(jìng)爭(zhēng)抑制效應(yīng)可能是遠(yuǎn)志降血糖的途徑之一。遠(yuǎn)志多糖PTP-1以其優(yōu)良的抗氧化和降血糖活性在醫(yī)藥、保健品及化妝品工業(yè)中擁有一定的潛力，本研究可為遠(yuǎn)志的深加工和進(jìn)一步研究開發(fā)提供一定的理論依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1] 國(guó)家藥典委員會(huì). 中華人民共和國(guó)藥典(一部)[M]. 北京: 中國(guó)醫(yī)藥科技出版社, 2015: 156-157.

[2] 劉大偉, 康利平, 馬百平. 遠(yuǎn)志化學(xué)及藥理作用研究進(jìn)展[J]. 國(guó)外醫(yī)學(xué)(藥學(xué)分冊(cè)), 2012, 39(1): 32-36. DOI:10.3969/j.issn.1674-0440.2012.01.007.

[3] 劉筱筱, 夏忠庭, 何毅, 等. 遠(yuǎn)志UPLC多指標(biāo)成分的測(cè)定及指紋圖譜研究[J]. 中草藥, 2016, 47(12): 2167-2174. DOI:10.7501/ j.issn.0253-2670.2016.12.026.

[4] 滕紅梅, 張書鋒, 胡正海, 等. 遠(yuǎn)志主產(chǎn)區(qū)藥材中遠(yuǎn)志皂苷元和多糖量的比較[J]. 中草藥, 2009, 40(7): 1143-1146. DOI:10.3321/ j.issn:0253-2670.2009.07.045.

[5] 劉超, 馬海英. 傳統(tǒng)中藥遠(yuǎn)志研究概述[J]. 河北農(nóng)業(yè)科學(xué), 2014, 18(5): 75-81. DOI:10.3969/j.issn.1088-1631.2014.05.023.

[6] 景永帥, 吳蘭芳, 王乾, 等. 遠(yuǎn)志多糖提取工藝優(yōu)化及其抗氧化活性研究[J]. 食品與機(jī)械, 2016, 32(5): 152-157. DOI:10.13652/ j.issn.1003-5788.2016.05.036.

[7] LIU J, STEFAN W, XU C L. A review of bioactive plant polysaccharides: biological activities, functionalization, and biomedical applications[J]. Bioactive Carbohydrates and Dietary Fibre, 2015, 5(1): 31-36. DOI:10.1016/j.bcdf.2014.12.001.

[8] XIN Tao, ZHANG Fubin, JIANG Qiuying, et al. Purification and antitumor activity of two acidic polysaccharides from the roots of Polygala tenuifolia[J]. Carbohydrate Polymers, 2012, 90: 1671-1676. DOI:10.1016/j.carbpol.2012.04.040.

[9] 裴瑾, 萬(wàn)德光, 楊林. 苯酚-硫酸比色法測(cè)定遠(yuǎn)志及地上部分多糖的含量[J]. 華西藥學(xué)雜志, 2005, 20(4): 337-339. DOI:10.3969/ j.issn.1006-0103.2005.04.023.

[10] 趙云生, 嚴(yán)鑄云, 李占林, 等. 晉產(chǎn)遠(yuǎn)志品種資源多糖含量測(cè)定[J]. 時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥, 2005, 16(9): 867-868. DOI:10.3969/ j.issn.1008-0805.2005.09.020.

[11] JING Y S, CUI X L, CHEN Z Y, et al. Elucidation and biological activities of a new polysaccharide from cultured Cordyceps militaris[J]. Carbohydrate Polymers, 2014, 102: 288-296. DOI:10.1016/j.carbpol.2013.11.061.

[12] 景永帥, 張丹參, 吳蘭芳, 等. 荔枝低分子量多糖的分離純化及抗氧化吸濕保濕性能分析[J]. 農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào), 2016, 32(9): 277-283. DOI:10.11975/j.issn.1002-6819.2016.09.039.

[13] JING Y S, HUANG L J, LV W J, et al. Structure characterization of a novel polysaccharide from pulp tissues of Litchi chinensis and its immnunomodulatory activity[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2014, 62: 902-911. DOI:10.1021/jf203179y.

[14] WANG L S, HU X J, BI S X, et al. A novel polysaccharide isolated from Litchi chinensis by using a simulated gastric medium and its immunomodulatory activity[J]. Drug Discoveries & Therapeutics, 2015, 9(2): 107-115. DOI:10.5582/ddt.2015.01023.

[15] JIN M L, LU Z Q, HUANG, M, et al. Sulfated modification and antioxidant activity of exopolysaccahrides produce by Enterobacter cloacae Z0206[J]. International Journal of Biological Macromolecules, 2011, 48: 607-612. DOI:10.1016/j.ijbiomac.2011.01.023.

[16] HU X Q, WANG J L, JING Y S, et al. Structural elucidation and in vitro antioxidant activities of a new heteropolysaccharide from Litchi chinensis[J]. Drug Discoveries & Therapeutics, 2015, 9(2): 116-122. DOI:10.5582/ddt.2015.01022.

[17] JING Y S, ZHU J H, LIU T, et al. Structural characterization and biological activities of a novel polysaccharide from cultured Cordyceps militaris and its sulfated derivative[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2015, 63(13): 3464-3471. DOI:10.1021/jf505915t.

[18] 潘瑩, 許經(jīng)偉. 冬棗多糖的分離純化及抗氧化活性研究[J]. 食品科學(xué), 2016, 37(13): 89-94. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201613016.

[19] QIAN J Y, BAI Y Y, TANG J, et al. Antioxidation and α-glucosidase inhibitory activities of barley polysaccharides modified with sulfation[J]. LWT-Food Science and Technology, 2015, 64: 104-111. DOI:10.1016/j.lwt.2015.05.034.

[20] 田敏, 王榮榮, 馮翠萍, 等. 珊瑚狀猴頭菌多糖抗氧化作用研究[J]. 中國(guó)食品學(xué)報(bào), 2015, 15(1): 25-33. DOI:10.16429/j.1009-7848.2015.01.005.

[21] 潘悠優(yōu), 花佩, 王允祥, 等. 無(wú)花果多糖提取、分離純化及生物活性的研究進(jìn)展[J]. 食品科學(xué), 2016, 37(17): 289-295. DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201617048.

[22] 封燕, 貢小輝, 韋德群, 等. 金蟬花多糖的抗氧化活性及結(jié)構(gòu)分析[J]. 食品科學(xué), 2016, 37(13): 19-24. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201613004.

[23] 朱振元, 劉曉翠, 郭蓉, 等. 蛹蟲草多糖對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制研究[J]. 現(xiàn)代食品科技, 2014, 30(12): 55-60. DOI:10.13982/ j.mfst.1673-9078.2014.12.010.

[24] 趙婧, 袁馳, 周春麗, 等. 南瓜多糖降血糖作用研究進(jìn)展[J]. 食品研究與開發(fā), 2014, 35(7): 108-110. DOI:10.3969/j.issn.1005-6521.2014.07.029.

[25] 張鐘, 吳文婷, 王萍, 等. 荔枝水溶性多糖作為α-葡萄糖苷酶抑制劑的活性測(cè)定[J]. 食品科學(xué), 2013, 34(13): 175-179. DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201313038.

Purifi cation and Structural Characterization of Polysaccharide from Polygala tenuifolia and Its Biological Activity

JING Yongshuai1, ZHANG Danshen1, WU Lanfang2,*, ZHENG Yuguang2
(1. College of Chemistry and Pharmaceutical Engineering, Hebei University of Science and Technology, Shijiazhuang 050018, China; 2. College of Pharmacology, Hebei University of Chinese Medicine, Shijiazhuang 050200, China)

Objective: To isolate and purify a polysaccharide from dried roots of Polygala tenuifolia and to determine its physicochemical properties and biological activity. Methods: The purified polysaccharide was obtained by ultrasonicassisted extraction, alcohol fractional precipitation, deproteinization, decolorization, dialysis, DEAE-cellulose 52 and Sephadex G-100 gel column chromatography. The purity of the final purified product was determined by UV-visible spectroscopy, spin spectrophotometry and gel filtration chromatography (GPC). The relative molecular mass of the polysaccharide was determined by high performance gel permeation chromatography, the monosaccharide composition was analyzed by high performance anion-exchange chromatography with pulsed amperometric detection (HPAEC-PAD), the antioxidant activity was evaluated by 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) and hydroxyl free radical scavenging assays, and the hypoglycemic activity was evaluated by α-glucosidase-inhibiting activity. Results: A homogeneous polysaccharide (PTP-1) was obtained. The relative molecular mass of PTP-1 was 4.62 × 104. Its monosaccharide composition was composed of galactose, glucose and mannose with a molar ratio of 3.92:1.00:2.08. The polysaccharide showed DPPH and hydroxyl radical scavenging capacity in a dose-dependent manner in a certain concentration range, with IC50of 0.35 and 0.51 mg/mL, respectively. In addition, it was able to signifi cantly inhibit α-glucosidase activity with IC50 of 0.52 mg/mL. Conclusion: PTP-1 is a pure polysaccharide with antioxidant and hypoglycemic activity.

Polygala tenuifolia; polysaccharide; physicochemical property; antioxidant activity; hypoglycemic activity

10.7506/spkx1002-6630-201717021

TS201.2

A

1002-6630（2017）17-0126-06引文格式：

2016-08-01

河北省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（H2016208059；H2016208058；H2017423023）；河北省教育廳高等學(xué)?？茖W(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目（QN2016187；QN2016099；ZD2016009）；河北省食藥監(jiān)局食品藥品安全科技項(xiàng)目（QN2015016；QN2016013）

景永帥（1985—），男，講師，博士，研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物化學(xué)。E-mail：cjys1985@126.com

*通信作者：吳蘭芳（1985—），女，講師，博士，研究方向?yàn)樗幨硟捎觅Y源開發(fā)與利用。E-mail：wulanfang757@163.com