黃芪注射液通過抑制EMT過程中pERK1/2信號(hào)通路減輕肺纖維化①

肖 雪 李 龍 （蘭州大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，蘭州 730000）

特發(fā)性肺纖維化（idiopathic pulmonary fibrosis，IPF）病因未明，以肺間質(zhì)纖維化改變?yōu)橹饕憩F(xiàn)，預(yù)后極差，目前治療策略療效有限。其病理特征為成纖維細(xì)胞活化、肺泡毛細(xì)血管單元破壞和細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積，導(dǎo)致肺異常修復(fù)，最終引起肺纖維化［1］。此過程中纖維化生長(zhǎng)因子，尤其是TGF-β1 發(fā)揮重要作用，可誘導(dǎo)肺成纖維細(xì)胞發(fā)生上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT），成為表達(dá)α-SMA 的肌成纖維細(xì)胞，導(dǎo)致大量細(xì)胞外基質(zhì)（Ⅰ型膠原是其主要成分）沉積。黃芪注射液有益氣養(yǎng)元、扶正祛邪、養(yǎng)心通脈、健脾利濕的功用，因其免疫調(diào)節(jié)及抗炎作用可用于過敏性氣道炎癥治療。最近一項(xiàng)研究表明，黃芪多糖具有抗小鼠心肌纖維化作用［2］，但其在TGF-β1 誘導(dǎo)的肺纖維化中的作用及機(jī)制尚不明確。本研究旨在闡明TGF-β1 誘導(dǎo)的肺成纖維細(xì)胞EMT 過程中，黃芪注射液對(duì)pERK1/2信號(hào)通路的影響及其抑制肺纖維化的可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 黃芪注射液購自上海新亞藥業(yè)高郵有限公司，國藥準(zhǔn)字：Z32021257；小鼠肺成纖維細(xì)胞L-929 購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫；TGF-β1 購自Multisciences（lianke）biotech.co.，LTD；β-ACTB、α-SMA、Ⅰ型膠原（CollagenⅠ）正反向引物購自上海生工生物工程股份有限公司；RTPCR 相關(guān)試劑購自湖南艾科瑞生物工程有限公司；內(nèi)參β-actin、一抗（pERK1/2 抗體）及二抗（兔抗鼠-HRP）均購自上海易匯生物科技有限公司；蛋白提取試劑盒及SDS-PAGE 凝膠快速配制試劑盒購自大連美侖生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組 采用含10%FBS和1%青霉素鏈霉素混合物的DMEM 完全培養(yǎng)基培養(yǎng)小鼠肺成纖維細(xì)胞L-929，0.25%胰蛋白酶消化，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)，傳至第3~4 代用于實(shí)驗(yàn)。L-929 細(xì)胞分為5 組：對(duì)照組（完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h）、模型組（完全培養(yǎng)基加入5 ng/ml TGF-β1 刺激24 h）、3 個(gè)治療組（完全培養(yǎng)基加入5 ng/ml TGF-β1，再各加入100、200、300 mg/ml黃芪注射液）。前期為明確本研究治療組實(shí)驗(yàn)濃度額外加入2 個(gè)黃芪注射液組（500、700 mg/ml）培養(yǎng)24 h。

1.2.2 形態(tài)學(xué)觀察 倒置相差顯微鏡觀察各組細(xì)胞形態(tài)變化，并拍照記錄。

1.2.3 RT-PCR 檢測(cè)α-SMA、CollagenⅠmRNA 表達(dá) RNAex 提取細(xì)胞總RNA，超微量核酸蛋白測(cè)定儀鑒定純度及濃度。采用Evo M-MLV 反轉(zhuǎn)錄試劑預(yù)混液進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)條件為37 ℃15 min，85 ℃5 s。引物由上海生工公司合成，序列見表1。取反轉(zhuǎn)錄所得DNA 模板2μl進(jìn)行PCR 反應(yīng)，反應(yīng)條件為95 ℃30 s，1 個(gè)循環(huán)，95 ℃5 s 和60 ℃30 s，共40 個(gè)循環(huán)。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀，以小鼠ACTB 為內(nèi)參，檢測(cè)各組樣本Ct值。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.2.4 pERK1/2 蛋白檢測(cè) 采用含PMSF 的裂解液裂解細(xì)胞，提取蛋白，BSA 法測(cè)定562 nm 處吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線及稀釋倍數(shù)計(jì)算各組樣品蛋白濃度。取80 μl 蛋白加入20 μl 上樣緩沖液中（4∶1），100 ℃水浴變性，進(jìn)行SDS-PAGE 凝膠電泳（濃縮膠80 V，濃縮膠100 V），轉(zhuǎn)至PVDF 膜（180 mA，30 min），封閉120 min，將β-actin 和ERK1/2 一抗在4 ℃下?lián)u床振蕩孵育過夜，二抗在室溫下孵育12 min，ECL 發(fā)光，多功能成像儀顯影，Image J 軟件分析目的蛋白及內(nèi)參條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。所有計(jì)量資料符合正態(tài)分布且方差齊性，采用±s表示。多組間比較采用單因素ANOVA 方差分析，組間比較采用Bonferroni 檢驗(yàn)。P<0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 黃芪注射液對(duì)L-929 細(xì)胞形態(tài)的影響 倒置相差顯微鏡下觀察小鼠肺纖維細(xì)胞L-929，對(duì)照組細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，細(xì)胞貼壁較牢，細(xì)胞間較牢固連接，呈多星形或梭形，邊界清晰，大小均一，呈單層“鋪路石樣”排列，胞核較大，輪廓清晰，核仁大而清楚（圖1A）；與對(duì)照組相比，模型組細(xì)胞形態(tài)變化不大，僅細(xì)胞密度增多，細(xì)胞間隙變窄（圖1B）；治療低、中、高劑量組細(xì)胞形態(tài)無明顯變化（圖1C~E）；而額外加入的兩個(gè)濃度組細(xì)胞收縮和變圓，細(xì)胞體變小，細(xì)胞間隙增寬，細(xì)胞核模糊，隨著黃芪注射液濃度升高，漂浮死亡細(xì)胞越多（圖1F、G）。

圖1 各組L-929細(xì)胞形態(tài)觀察（×400）Fig.1 Observation on morphology of L-929 cells in each group（×400）

2.2 黃芪注射液降低α-SMA、CollagenⅠmRNA 表達(dá) 與對(duì)照組（1.00±0.05，1.00±0.01）相比，模型組2 種基因表達(dá)升高（1.97±0.03，1.88±0.00，P<0.05），治療低劑量組2 種基因表達(dá)升高（1.62±0.03，1.64±0.02，P<0.05）；治療中劑量組2 種基因表達(dá)升高（1.33±0.02，1.43±0.00，P<0.05），治療高劑量組2 種基因表達(dá)升高（1.16±0.01，1.21±0.00，P<0.05）。與模型組相比，治療低、中、高劑量組2種基因表達(dá)均降低（P<0.05，圖2）。

圖2 RT-PCR 檢測(cè)小鼠肺成纖維細(xì)胞中α-SMA 和Colla?gen Ⅰ表達(dá)Fig.2 Expression of α-SMA and Collagen Ⅰin mice lung fibroblasts detected by RT-PCR

2.3 黃芪注射液降低pERK1/2 蛋白表達(dá) 與對(duì)照組（1.00±0.00）相比，模型組pERK1/2 蛋白表達(dá)升高（1.65±0.02，P<0.05），治療低、中、高劑量組表達(dá)降低（0.67±0.01，0.44±0.03，0.11±0.00，P<0.05）。與模型組相比，治療低、中、高劑量組pERK1/2 蛋白表達(dá)降低（P<0.05，圖3）。5組間差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=267.515，P<0.05）。

圖3 Western blot 檢測(cè)各組小鼠肺成纖維細(xì)胞pERK1/2表達(dá)Fig.3 Western blot to detect expression of pERK1/2 in lung fibroblasts of mice in each group

3 討論

肺纖維化是一種慢性進(jìn)展性疾病，可由環(huán)境因素、藥物、治療手段、疾病原因及遺傳導(dǎo)致，但多數(shù)肺纖維化患者病因未知，稱為特發(fā)性間質(zhì)性肺炎，屬于間質(zhì)性肺疾病，而IPF 是最常見的特發(fā)性間質(zhì)性肺炎。IPF 的特征為炎癥細(xì)胞浸潤、成纖維細(xì)胞增生和膠原蛋白沉積，最終導(dǎo)致肺功能不可逆轉(zhuǎn)損害。由于缺乏針對(duì)IPF 的有效藥物，患者確診后壽命僅為2~5 年。兩種FDA 批準(zhǔn)的藥物（吡非尼酮和尼達(dá)尼布）僅能改善肺功能卻無法治愈肺纖維化［3］，因此，進(jìn)一步明確IPF 的機(jī)制有助于新藥開發(fā)。本研究形態(tài)學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組L-929 細(xì)胞加入TGF-β1 后有明顯促增殖現(xiàn)象，而治療組L-929 細(xì)胞形態(tài)與對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。為明確合理給藥劑量，本課題組前期在治療組外設(shè)置兩個(gè)更高的黃芪注射液劑濃度組（TGF-β1+黃芪注射液500、700 mg/ml），顯微鏡下發(fā)現(xiàn)，過高濃度的黃芪注射液可引起肺成纖維細(xì)胞死亡，因此得出超過300 mg/ml的黃芪注射液可能會(huì)引起肺損害的結(jié)論，故確定本研究治療組濃度分別為：100 mg/ml（低劑量組）、200 mg/ml（中劑量組）、300 mg/ml（高劑量組）。

TGF-β1是公認(rèn)的最強(qiáng)纖維化刺激因子，在調(diào)節(jié)炎癥、細(xì)胞生長(zhǎng)和組織纖維化中起重要作用。ERK1/2 是絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）超家族成員，是普遍表達(dá)的親水性非受體蛋白，參與Ras-Raf-MEK-ERK 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，可通過磷酸化各種胞漿或核目標(biāo)多樣化和放大信號(hào)，介導(dǎo)途徑激活的復(fù)雜生物學(xué)結(jié)果。TGF-β1 處理小鼠腎小球系膜細(xì)胞（mesangial cells，MCs），可激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)急和促進(jìn)MCs 增殖，同時(shí)激活ERK1/2 信號(hào)通路，而抑制ERK1/2信號(hào)通路可減弱上述作用延遲腎纖維化，提示TGF-β1 可促進(jìn)ERK1/2 通路激活［4］。最新研究證實(shí)，下調(diào)TGF-β1 介導(dǎo)的ERK1/2 通路水平可抑制肺成纖維細(xì)胞增殖和ECM 沉積［5］。提示TGF-β1 介導(dǎo)的ERK1/2 信號(hào)通路是肺纖維化的潛在治療靶標(biāo)。本研究模型組結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，TGF-β1 誘導(dǎo)的L-929細(xì)胞α-SMA、CollagenⅠ基因表達(dá)、pERK1/2通路表達(dá)升高（P<0.05），證明TGF-β1 可使小鼠肺成纖維細(xì)胞發(fā)生EMT，轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞并產(chǎn)生細(xì)胞外基質(zhì)，pERK1/2通路水平在TGF-β1誘導(dǎo)后顯著升高，體現(xiàn)出TGF-β1的促纖維化作用。

黃芪注射液主要成分為黃芪，黃芪用于疾病治療已有兩千多年歷史，在免疫調(diào)節(jié)、抗衰老、減弱胰島素抵抗和抗纖維化等方面具有巨大治療潛力，且副作用?。?］。席雪琴等［7］研究表明，黃芪的主要成分對(duì)肺癌具有抑制作用。現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，黃芪能抑制腹膜間皮細(xì)胞和PD 大鼠模型EMT，揭示了黃芪在預(yù)防或治療腹膜纖維化中的潛在治療作用［8］。既往研究報(bào)道，黃芪注射液可能通過抑制TGF-β1/Smad 通路活化，抑制肺纖維化發(fā)展［9］。但黃芪注射液是否對(duì)肺成纖維細(xì)胞有抗纖維化作用，是否通過EMT 過程影響pERK1/2 信號(hào)通路，目前國內(nèi)外相關(guān)報(bào)道較少。

為明確上述疑問，本研究發(fā)現(xiàn)，黃芪注射液對(duì)TGF-β1 誘導(dǎo)的肺成纖維細(xì)胞EMT 過程有明顯抑制作用。RT-PCR 結(jié)果顯示，與模型組對(duì)比，治療組α-SMA、CollagenⅠmRNA 表達(dá)均降低（P<0.05），表明黃芪注射液可減弱TGF-β1 誘導(dǎo)的肺纖維化過程。黃芪多糖是從黃芪根中提取的活性成分，可通過降低ERK1/2 信號(hào)通路表達(dá)促進(jìn)人肝癌HepG2 細(xì)胞凋亡［10］。與該研究結(jié)果一致，本研究Western blot結(jié)果顯示，與模型組對(duì)比，低、中、高治療組隨黃芪注射液濃度升高，pERK1/2 信號(hào)通路水平降低（P<0.05）。此外，量效關(guān)系分析顯示，隨著治療組加入黃芪注射液終濃度升高，α-SMA、CollagenⅠmRNA表達(dá)及pERK1/2 蛋白表達(dá)均顯著降低（P<0.05），說明黃芪注射液抗纖維化作用具有濃度依賴性，本實(shí)驗(yàn)中黃芪注射液終濃度為300 mg/ml 時(shí)抗纖維化作用最強(qiáng)。

綜上，本研究探討了黃芪注射液對(duì)TGF-β1 誘導(dǎo)的小鼠肺成纖維細(xì)胞纖維化過程的保護(hù)作用及機(jī)制，結(jié)果表明，黃芪注射液可減輕肺纖維化，其抗纖維化作用通過下調(diào)pERK1/2 信號(hào)通路水平、抑制TGF-β1 誘導(dǎo)的EMT 過程中α-SMA 和CollagenⅠ基因表達(dá)實(shí)現(xiàn)，為臨床肺纖維化治療提供了基礎(chǔ)資料，并為科學(xué)研究提供了新思路及理論基礎(chǔ)。