羊肚菌液體培養(yǎng)基的篩選

程遠(yuǎn)

(五常市寶龍店種子林場，黑龍江 哈爾濱 150200)

羊肚菌液體培養(yǎng)基的篩選

程遠(yuǎn)

(五常市寶龍店種子林場，黑龍江 哈爾濱 150200)

以5種不同的液體培養(yǎng)基配方(Y1：麥麩、黃豆粉；Y2：馬鈴薯、黃豆粉；Y3：馬鈴薯、酵母膏；Y4：麥麩、酵母膏；Y5：米糠、黃豆粉)對(duì)羊肚菌進(jìn)行液體培養(yǎng)，結(jié)果表明：Y4培養(yǎng)基中菌球大小均勻、個(gè)數(shù)多為95個(gè)·(100 mL)-1，菌絲生物量最大，為10.24 g·L-1，菌絲粗多糖得率最高，為11.45%。在5種培養(yǎng)基中，麥麩、酵母膏培養(yǎng)基為最佳培養(yǎng)基。

羊肚菌；液體培養(yǎng)基；篩選

羊肚菌(morchellaesculentaL.Pars)俗稱羊肚菜，陽雀菌[1]。是一種名貴的食藥用真菌[2]。羊肚菌屬于子囊菌亞門(Ascomycotina)，盤菌綱(Discomycetes)，盤菌目(Pezizaies)，羊肚菌科(Morchellaceae)，羊肚菌屬(Morchella)[3-5]。主要分布于我國的云南、甘肅、四川、青海、黑龍江、寧夏、新疆等地[6]。羊肚菌無毒，性平，味甘寒，中醫(yī)認(rèn)為其具有益脾胃、提神、補(bǔ)腦的功能，可用于治療脾虛滑瀉，消化不良，氣虛多痰等癥[7]。近年來，研究者們發(fā)現(xiàn)羊肚菌具有抗氧化[8]、抗癌[9]、抗疲勞[10]、保肝[11]、保腎[12]、降低血脂[13]等功效。而羊肚菌的多糖是羊肚菌的重要活性物質(zhì)之一，具有抗氧化、抗疲勞、抑腫瘤、抗菌、增強(qiáng)免疫力等多種藥理活性。近年來，隨著羊肚菌研究的深入，羊肚菌在醫(yī)藥、保健品、食品等領(lǐng)域具有廣闊的開發(fā)前景。液體培養(yǎng)羊肚菌，具有速度快、周期短、成本低、無污染等優(yōu)點(diǎn)。本文用5種不同的液體培養(yǎng)液培養(yǎng)羊肚菌，通過比較羊肚菌的菌絲體生物量和菌絲中粗多糖的含量，選擇出最佳的培養(yǎng)基配方。

1 試驗(yàn)材料

1.1 平板菌種培養(yǎng)基配方

馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，蛋白胨1 g，MgSO4·7H2O 1 g，KH2PO42 g，自來水1 000 mL，pH6。

1.2 液體培養(yǎng)基配方

Y1：麥麩4%，黃豆粉2%，玉米粉2%，葡萄糖2%，MgSO4·7H2O 0.1%，KH2PO40.2%，自來水1 000 mL；Y2：馬鈴薯20%，黃豆粉2%，玉米粉2%，葡萄糖2%，MgSO4·7H2O 0.1%，KH2PO40.2%，自來水1 000 mL；Y3：馬鈴薯20%，蛋白胨0.1%，酵母膏0.2%，葡萄糖2%，MgSO4·7H2O 0.1%，KH2PO40.2%，自來水1 000 mL；Y4：麥麩4%，蛋白胨0.1%，酵母膏0.2%，葡萄糖2%，MgSO4·7H2O 0.1%，KH2PO40.2%，自來水1 000 mL；Y5：米糠4%，黃豆粉2%，玉米粉2%，葡萄糖2%，MgSO4·7H2O 0.1%，KH2PO40.2%，自來水1 000 mL。

2 試驗(yàn)方法

2.1 平板菌種的制備

按照1.1的培養(yǎng)基配方，加入18 g瓊脂，制成羊肚菌培養(yǎng)基，倒入三角瓶內(nèi)于121 ℃下的高壓滅菌鍋中滅菌20 min。滅好菌后，在無菌操作臺(tái)中趁熱將培養(yǎng)基導(dǎo)入平板中，水平放置到室溫。待平板培養(yǎng)基冷卻后，用滅菌的接菌勾取一小塊試管種置于平板培養(yǎng)基的中央。接好菌后用封口膜封好，將平板培養(yǎng)基置于培養(yǎng)箱內(nèi)，保持溫度25 ℃，待菌絲長滿平板后備用。

2.2 液體種的制備

按照1.2的不同培養(yǎng)基配方制備液體培養(yǎng)基，調(diào)節(jié)到pH6.5。將制備好的液體培養(yǎng)基導(dǎo)入500 mL三角瓶內(nèi)，每瓶200 mL，將倒好培養(yǎng)基的三角瓶放入121 ℃高壓滅菌鍋內(nèi)滅菌30 min。滅菌的液體培養(yǎng)基冷卻至室溫，在無菌操作臺(tái)中，將平板培養(yǎng)基用打孔器在同一半徑上取菌，接種到液體培養(yǎng)基中,每瓶3個(gè)菌塊兒。將接種好的液體培養(yǎng)基封好封口膜，靜置24 h后放入恒溫培養(yǎng)箱中，以25 ℃，150 r·min-1，避光培養(yǎng)10 d。

2.3 菌球數(shù)量及干質(zhì)量的測定

分別在每種液體培養(yǎng)基中取出100 mL菌液，計(jì)算菌絲球的數(shù)量。重復(fù)3次取平均值。

將菌絲培養(yǎng)液3 000 r·min-1離心10 min，棄上清液，向沉淀中加入等體積蒸餾水，搖勻后3 000 r·min-1離心10 min，重復(fù)3次。將分離出的菌絲放入50 ℃的恒溫鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)烘干至恒質(zhì)量，用電子天平稱質(zhì)量。

2.4 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

將葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品置于100 ℃的烘箱內(nèi)烘干至恒質(zhì)量，準(zhǔn)確稱取葡萄糖純品100 mg，加蒸餾水溶解后加入5 mL鹽酸，定容至1 000 mL容量瓶中，得到葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液。精密吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mL，分別置于試管中，分別加入蒸餾水補(bǔ)至2 mL，依次加入6%的苯酚溶液1 mL和濃硫酸5 mL。室溫放置10 min，冷卻后用分光光度計(jì)在490 nm處測定吸光度，用蒸餾水做對(duì)照。以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)對(duì)吸光度值回歸，求得標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程。

2.5 胞內(nèi)粗多糖含量的測定

胞內(nèi)粗多糖的提?。簩⒑娓芍梁阗|(zhì)量的羊肚菌菌絲研磨成細(xì)粉，過200目篩備用。稱取羊肚菌菌絲1 g，置于離心管中，加入30倍體積的蒸餾水搖勻，放入超聲儀器中50 ℃超聲30 min。超聲后立即以5 000 r·min-1離心10 min，收集上清液，重復(fù)3次，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至10 mL，加入40 mL無水乙醇震蕩搖勻，然后置于4 ℃下沉淀12 h，沉淀后放入離心機(jī)5 000 r·min-1離心5 min，收集沉淀，用丙酮洗滌后將沉淀物置于50 ℃的烘箱中烘干至恒質(zhì)量，即得羊肚菌粗多糖，將得到的粗多糖定容至1 L。羊肚菌胞內(nèi)粗多糖含量的測量方法同2.4，計(jì)算羊肚菌多糖的含量。用公式y(tǒng)=m/M×100%，得出胞內(nèi)多糖得率，式中：y-羊肚菌胞內(nèi)多糖得率(%)；m-胞內(nèi)多糖質(zhì)量(g)；M-菌絲體的質(zhì)量(g)。

3 試驗(yàn)結(jié)果

3.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

根據(jù)吸光度值繪制出來葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線表現(xiàn)出了很好的線性關(guān)系，圖中橫坐標(biāo)為多糖的濃度(mg·mL-1)，縱坐標(biāo)為吸光度(A)，得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程y=15.885 x+0.010 4，R2=0.998 5。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

3.2 不同液體培養(yǎng)基對(duì)羊肚菌菌球生長的影響

根據(jù)表1所示，不同培養(yǎng)基配方的100 mL培養(yǎng)基中菌球個(gè)數(shù)的比較結(jié)果為Y4>Y3>Y1>Y2>Y5;菌絲干質(zhì)量的比較結(jié)果為Y4>Y3>Y2>Y1>Y5?？梢姡瑹o論是菌球個(gè)數(shù)還是菌絲的質(zhì)量，Y4培養(yǎng)基都是最利于菌球生長的液體培養(yǎng)基，Y4培養(yǎng)基中菌絲球的個(gè)數(shù)為95個(gè)·(100 mL)-1，菌絲干質(zhì)量為10.24 g·L-1，菌絲個(gè)數(shù)是Y5培養(yǎng)基的10.6倍，菌絲干質(zhì)量是Y5培養(yǎng)基的5.6倍。

表1 不同液體培養(yǎng)基對(duì)羊肚菌菌球生長的影響

3.3 不同液體培養(yǎng)基對(duì)羊肚菌菌絲粗多糖得率的影響

由表2可知，不同培養(yǎng)基的多糖得率從大到小分別是Y4、Y3、Y2、Y5、Y1。Y4培養(yǎng)基的粗多糖得率最高為11.45%，是粗多糖得率最低的Y1培養(yǎng)基的5倍。

表2 不同液體培養(yǎng)基對(duì)羊肚菌菌絲粗多糖含量的影響

試驗(yàn)表明Y4培養(yǎng)基無論從菌絲生物量還是多糖得率方面均是最高的，且又是顯著。

4 結(jié)果與討論

本試驗(yàn)以5種不同的液體培養(yǎng)基配方(Y1：麥麩、黃豆粉；Y2：馬鈴薯黃豆粉；Y3馬鈴薯、酵母膏；Y4麥麩、酵母膏；Y5米糠、黃豆粉)對(duì)羊肚菌進(jìn)行液體培養(yǎng)，試驗(yàn)表明，Y4培養(yǎng)基中菌球大小均勻、個(gè)數(shù)多，菌絲生物量最大，菌絲粗多糖得率最高。有研究表明，麥麩中含有豐富的氨基酸、維生素E、維生素B族和胡蘿卜素等[14]，以麥麩、酵母膏為培養(yǎng)基質(zhì)，為羊肚菌提供了優(yōu)質(zhì)豐富的碳氮源，這些碳氮源可以被羊肚菌菌絲體直接利用[15]。因此，本研究用麥麩、酵母膏培養(yǎng)液體羊肚菌可得到較多的菌球，菌絲的生長量也高。

[1] Jacquetant E.Les Morilles.La Bibliotheque des Arts Pairs[M].LBDA，1984

[2] Fu L H，Wang Y P，Wang J J，et a1.Evaluation of the antioxidant activity of extracellular polysaccharides from morchellaesculenta[J].Food&function，2013，4(6):871-879

[3] 熊亞，李敏杰.羊肚菌菌絲體基礎(chǔ)培養(yǎng)基的優(yōu)化[J].中國釀造，2013，32(5)： 114-118

[4] 趙琪，康平德，戚淑威，等.羊肚菌資源現(xiàn)狀及可持續(xù)利用對(duì)策[J].西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2010，23 (1):266-269

[5] 朱永真，杜雙田，車進(jìn)等.無機(jī)鹽及生長因子對(duì)羊肚菌菌絲生長的影響[J].西北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，39(4)：211-215

[6] 劉蓓，吳素蕊，朱萍.滇西北地區(qū)四種羊肚菌營養(yǎng)成分分析比較[J].食品工業(yè)科技，2012，33(1):363-365

[7] 李娟，王臻，姚良同.羊肚菌多糖研究進(jìn)展[J].微生物學(xué)雜志，2005, 25(4)：89-91

[8] Duncan C J G，Pugh N，Pasco D S，et al.Isolation of a galactomannan that enhances macrophage activation from the edible fungus morchella esculenta[J].Journal of agricultural and food chemistry，2002，50(20):5683-5685

[9] 李華，包海鷹，李玉.羊肚菌研究進(jìn)展[J].菌物研究，2005, 2(4):53-60

[10] 孫曉明，張衛(wèi)明.羊肚菌抗疲勞作用研究[J].中國野生植物資源，2001(1)：17-18,32

[11] 孫玉軍，陳彥，周正義，等.羊肚菌胞內(nèi)多糖對(duì)小鼠急性肝損傷的影響[J].中國食用菌雜志，2008，27(2)：41-42

[12] Nitha B, Janardhanan K K. Aqueous-ethanolic extract of morel mushroom mycelium Morchella esculenta, protects cisplatin and gentamicin induced nephrotoxicity in mice[J].Food and Chemical Toxicology，2008，46(9):3193-3199

[13] 殷偉偉，張松，吳金鳳.尖頂羊肚菌活性提取物降血脂作用的研究[J].菌物學(xué)報(bào)，2009，28(6):873-877

[14] 賈天廣，劉邦迪，郭亞輝. 麥麩的功能成分及其應(yīng)用研究進(jìn)展[J].食品研究與開發(fā)，2014,35(7)：122-126

[15] 張松.食用菌學(xué)[M].廣州:華南理工大學(xué)出版社，2000:23-216

Selection of Liquid Culture Medium ofMorehellaesculenta

Cheng Yuan

(Baolongdian Seed Forest Farm,Wuchang City,Harbin 150200,China)

Morehellaesculentawas conducted liquid culture by five different liquid culture recipes (Y1: wheat bran, soybean powder; Y2: potato, soybean powder; Y3: potato, yeast extract; Y4: wheat bran, yeast extract; Y5: rice bran, soybean powder).Result shows that size of bacteria in Y4 medium is uniform, the number is 95·(100 mL)-1, the biomass of mycelial is 10.24 g·L-1, the highest rate of mycelial polysaccharide is 11.45%, indicating that the medium of wheat bran and yeast extract are the optimal medium among five kinds of medium.

Morehellaesculenta; liquid culture medium; selection

1005-5215(2017)08-0048-03

2017-05-25

程遠(yuǎn)(1982-)，男，黑龍江巴彥人，大學(xué)，工程師，從事小漿果及食用菌等培養(yǎng)研究.

S723.132.6

A

10.13601/j.issn.1005-5215.2017.07.015