家蠶核型多角體病毒對(duì)寄主細(xì)胞凋亡抑制蛋白BmAPI5表達(dá)的影響

章 娜，聶作明，蔣彩英

（浙江理工大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310018）

家蠶核型多角體病毒對(duì)寄主細(xì)胞凋亡抑制蛋白BmAPI5表達(dá)的影響

章 娜，聶作明，蔣彩英＊

（浙江理工大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310018）

API5是一種新的細(xì)胞凋亡抑制蛋白因子，能有效抑制細(xì)胞凋亡。API5在結(jié)構(gòu)與功能上高度保守，并已在包括家蠶在內(nèi)的多種昆蟲中發(fā)現(xiàn)存在同源基因。本文檢測(cè)了家蠶幼蟲BmAPI5基因在BmNPV和大腸桿菌侵染后的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)變化。結(jié)果表明，微生物侵染能快速顯著誘導(dǎo)BmAPI5基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)，其中以BmNPV的誘導(dǎo)作用較為明顯。這表明BmAPI5可能參與BmNPV-宿主的互作機(jī)制。

家蠶；核型多角體病毒；BmAPI5；基因表達(dá)

細(xì)胞凋亡（Apoptosis），又稱程序性細(xì)胞死亡（Programmed cell death，PCD），是一種細(xì)胞自主有序的生理性死亡方式，旨在主動(dòng)清除那些不再需要的、損傷的或有害的細(xì)胞［1］。細(xì)胞凋亡作為進(jìn)化上高度保守的生物學(xué)現(xiàn)象，在維持機(jī)體正常發(fā)育與器官形成、維護(hù)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定和抵御外界侵害等方面具有重要作用。與哺乳動(dòng)物和線蟲等生物相似，昆蟲細(xì)胞凋亡涉及一系列的基因激活、表達(dá)與調(diào)控?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)在昆蟲體內(nèi)存在多條相互聯(lián)系的細(xì)胞凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，包括依賴于線粒體細(xì)胞色素C（Cyto?chrome C，Cytc）的釋放和胱天蛋白酶（Cysteinyl as?partate specific proteinase，Caspase）活化的信號(hào)通路、不依賴于細(xì)胞色素C的釋放但依賴于Caspase活化的信號(hào)通路和不依賴于Caspase活化的信號(hào)通路等［2］。有關(guān)昆蟲細(xì)胞凋亡機(jī)制及其信號(hào)通路的研究主要集中于黑腹果蠅Drosophilamelanogaster［3-4］。近年來，家蠶Bombyxmori作為鱗翅目模式種類在細(xì)胞凋亡及其相關(guān)基因與功能等方面已有較多研究［5-13］，特別是在其基因組測(cè)序完成后，已鑒定出52個(gè)與其他昆蟲及哺乳動(dòng)物等相似的細(xì)胞凋亡相關(guān)基因，包括凋亡信號(hào)通路中的各關(guān)鍵基因如Caspase、Bcl-2（B-cell lymphoma/leukemia-2）和凋亡抑制蛋白（In?hibitors of apoptosis，IAPs）等家族同源基因以及Cytc和凋亡蛋白酶活化因子-1（Apoptotic protease activating factor-1，Apaf-1）等［14］。Bcl-2 和IAPs是重要的凋亡調(diào)控蛋白，其中Bcl-2家族由促凋亡因子（如Bax、Bak、Bcl-Xs、Bad、Bik、Bid和Hrk等）和抑凋亡因子（Bcl-2、Bcl-xl、Mcl-1、Bcl-w和GRS等）組成，而IAPs家族則通過其保守的桿狀病毒IAP重復(fù)序列結(jié)構(gòu)域（Baculovirus inhibitor of apoptosis re?peats，BIR）與Caspase結(jié)合而阻斷細(xì)胞凋亡進(jìn)程［15］。

研究表明，外界刺激如病毒感染、紫外線輻射、化學(xué)藥物和氨基酸饑餓等都可誘導(dǎo)昆蟲細(xì)胞發(fā)生凋亡［2］。其中，桿狀病毒是最早發(fā)現(xiàn)能誘導(dǎo)與抑制宿主細(xì)胞凋亡的病毒之一［15］。宿主細(xì)胞能通過啟動(dòng)細(xì)胞凋亡來應(yīng)答防御病毒的感染［16］，同時(shí)作為對(duì)宿主抗病毒防御的適應(yīng)策略，病毒在感染早期利用自身編碼的抗凋亡基因表達(dá)來抑制宿主細(xì)胞凋亡，以利于其復(fù)制與增殖，而在感染晚期的促進(jìn)宿主細(xì)胞凋亡則利于病毒的傳播與擴(kuò)散［17］。目前，在桿狀病毒中已發(fā)現(xiàn)P35和IAP等抗凋亡基因［18-19］。宿主細(xì)胞凋亡不僅受到其自身抗凋亡因子的調(diào)控，而且在感染病毒后還受到病毒編碼的抗凋亡因子調(diào)控。有關(guān)昆蟲與病毒的抗凋亡基因及其調(diào)控機(jī)制以及在病毒-寄主互作中的功能作用至今尚未完全明了［20］。

在各種抗凋亡因子中，API5（Apoptosis inhibi?tor-5），又稱為AAC-11（Anti-apoptosis clone 11）和FIF（Fibroblast growth factor-2-interacting factor），是一種新發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞凋亡抑制蛋白因子，能有效抑制因缺乏血清和生長(zhǎng)因子而引發(fā)的細(xì)胞凋亡［21-22］。API5基因在哺乳類、兩棲類、昆蟲和植物等生物中高度保守，因其在人類癌細(xì)胞中高水平表達(dá)以促進(jìn)癌細(xì)胞發(fā)生、并受microRNA-1等負(fù)調(diào)控抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)而倍受關(guān)注［23］。在人類細(xì)胞中，API5通過其亮氨酸拉鏈基序與Acinus蛋白活性位點(diǎn)結(jié)合，抑制Caspase-3對(duì)Acinus的裂解，從而阻止凋亡細(xì)胞的DNA片段化［24］。此外，在人和果蠅中，API5還能負(fù)向調(diào)控E2F1（E2-promoter binding factor 1）依賴的細(xì)胞凋亡［25］。目前，已在家蠶基因組中發(fā)現(xiàn)存在同源基因BmAPI5（GenBank編號(hào)：XM_004927989），但一直未有其相關(guān)研究報(bào)道。近年來，我們開展了家蠶BmAPI5基因的克隆、表達(dá)與功能等研究，發(fā)現(xiàn)該基因的開放閱讀框?yàn)?，668 nt，編碼556個(gè)氨基酸，分子量63.13 K道爾頓，與黑腹果蠅同源基因Aac11的序列相似性為46%，具有API5基因家族的特征結(jié)構(gòu)域［26］，并且在家蠶不同發(fā)育時(shí)期均有表達(dá)。本文報(bào)道家蠶核型多角體病毒（Bombyxmorinucleopoly?hedrovirus，BmNPV）對(duì)該基因轉(zhuǎn)錄與表達(dá)的影響，旨為探明BmAPI5在家蠶-桿狀病毒互作中的功能作用以及用于家蠶抗病毒防治提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

家蠶大造品種（P50）由浙江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院魯興萌教授提供，家蠶桿狀病毒BmNPV由浙江理工大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院陳健副教授提供。陽性對(duì)照大腸桿菌Escherichiacoli菌株Trans-T1購自北京全式金生物技術(shù)（TransGen Biotech）有限公司。

家蠶BmAPI5蛋白的兔源多克隆抗體委托杭州華安生物技術(shù)有限公司制備合成。RNA提取試劑Trizol購自美國Invitrogen公司；TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒購自大連寶生公司；Tubulin抗體購自美國Proteintech公司；HRP標(biāo)記二抗購自美國Cell Signaling公司。定量PCR引物由上海生工生物工程公司合成。其它試劑均為國產(chǎn)或進(jìn)口分裝AR級(jí)產(chǎn)品。

1.2 樣品制備

取家蠶5齡第1 d幼蟲用75%酒精消毒蟲體后，采用微量注射器分別在每頭腹部注射5m l以0.15 M NaCl按1∶25稀釋的大腸桿菌Trans-T1菌株（OD600=1.0）和家蠶桿狀病毒BmNPV（1.25×106pfu/m l），并以注射0.15 M NaCl為陰性對(duì)照，各處理分別重復(fù)3次。處理后飼喂新鮮桑葉，在1 h、3 h、6 h、12 h、1 d和3 d后分別取樣，在去除腸道內(nèi)容物后，按Trizol操作說明書分別提取各樣品的總RNA和蛋白質(zhì)，并置于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 家蠶Bm API5基因的定量PCR檢測(cè)

選擇家蠶微管蛋白α-Tubulin基因（GenBank編號(hào)：NM_001043419）為實(shí)時(shí)熒光定量PCR的內(nèi)參基因。根據(jù)家蠶BmAPI5和α-Tubulin的mRNA序列，采用Primer3在線分析軟件（http：//primer3.ut.ee/）分別設(shè)計(jì)定量PCR引物，BmAPI5上游引物：5’-GCT CGT CTC ACA CAA GGC TA-3’和下游引物：5’-AAA TGA TGG TGG GGT ACG GA-3’；α-Tubulin上游引物：5’-TGA CCA CAA GTT CGA CCT CA-3’和下游引物：5’-GTA CTC TTCGGC TCC CTC AC-3’。驗(yàn)證引物的特異性，以保證溶解曲線為平滑單峰且峰值單一，無雜峰；并對(duì)目的PCR產(chǎn)物測(cè)序，確認(rèn)引物擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物為特異性目的基因片段。

取各樣品總RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，用作PCR模板。實(shí)時(shí)熒光定量PCR參照SYBR Premix Ex Taq II試劑盒說明書，在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（型號(hào)7300，美國ABI公司）上操作進(jìn)行。PCR反應(yīng)體系20 μL，其中cDNA 5 μL，引物終濃度為100 nmol/L；反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性10 min；95℃ 15 s，60℃15 s，40個(gè)循環(huán)。比較目的基因與內(nèi)參基因的Ct值，即可獲得基因相對(duì)表達(dá)量［27］。

1.4 家蠶Bm API5蛋白的W estern印跡檢測(cè)

將提取的各蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳，結(jié)束后把蛋白從SDS-PAGE膠上轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，然后用封閉液封閉2 h；接著與BmAPI5兔多抗（1∶1000）稀釋液抗室溫反應(yīng)1 h，用洗脫液PBST洗膜3次；加入HRP二抗（1∶10000）稀釋液室溫反應(yīng)1 h，用洗脫液洗膜3次；用ECL顯色液顯色，并在化學(xué)發(fā)光分析儀Luminoskan Ascent（美國Thermo公司）上掃描成像。

1.5 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用DPS軟件［28］進(jìn)行單因素方差分析，用最小顯著差數(shù)法（LSD法）比較各平均數(shù)間的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 家蠶Bm API5基因的轉(zhuǎn)錄動(dòng)態(tài)分析

對(duì)家蠶5齡幼蟲的注射處理可誘導(dǎo)BmAPI5基因轉(zhuǎn)錄水平快速升高（圖1）。在處理后1 h時(shí)，注射BmNPV處理組的轉(zhuǎn)錄水平極顯著增高（p＜0.01），而在注射大腸桿菌（陽性對(duì)照）和無菌PBS（陰性對(duì)照）之間無顯著差異。注射大腸桿菌和注射無菌PBS的BmAPI5轉(zhuǎn)錄水平分別在處理后12 h和3 h時(shí)顯著回落，并隨時(shí)間延長(zhǎng)而再無顯著變化；注射BmNPV的BmAPI5轉(zhuǎn)錄水平隨時(shí)間延長(zhǎng)而降低，并在處理后3 h和12 h時(shí)各出現(xiàn)一次顯著性回落，但其總體上均顯著高于注射無菌PBS的對(duì)照。

圖1 家蠶幼蟲注射處理對(duì)BmAPI5基因轉(zhuǎn)錄的影響Figure 1 Effects of injection treatments on the gene transcription of BmAPI5 inB.morilarvae.

圖2 家蠶幼蟲注射處理對(duì)BmAPI5蛋白表達(dá)的影響Figure 2 Effects of injection treatments on the protein expression of BmAPI5 inB.morilarvae

2.2 家蠶Bm API5蛋白的表達(dá)動(dòng)態(tài)分析

對(duì)家蠶5齡幼蟲的注射大腸桿菌和BmNPV可誘導(dǎo)BmAPI5基因的蛋白表達(dá)水平（圖2）。與注射無菌PBS的對(duì)照相比，家蠶幼蟲在BmNPV注射1 h后，體內(nèi)BmAPI5蛋白的表達(dá)水平仍相對(duì)較低，3 h后明顯升高，并于6～12 h達(dá)到峰值，后隨時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸降至對(duì)照水平；注射大腸桿菌后，BmAPI5表達(dá)量在處理后3 h開始升高，12 h達(dá)到最高，后漸趨于對(duì)照水平。盡管注射BmNPV的BmAPI5表達(dá)變化與注射大腸桿菌的相似，但在誘導(dǎo)的表達(dá)量上明顯以注射Bm?NPV的為高。BmAPI5在不同處理后的蛋白表達(dá)變化趨勢(shì)與其基因轉(zhuǎn)錄的相似，但存在明顯的滯后現(xiàn)象。

3 討論

API5是與已知的IAPs在結(jié)構(gòu)上完全不同的一類新的凋亡抑制蛋白［21，30］，從酵母、線蟲、昆蟲到人類都表現(xiàn)出高度的保守性［25］。目前，在GenBank數(shù)據(jù)庫已登錄有92條昆蟲API5同源基因序列，涉及70種昆蟲。有關(guān)API5的研究主要集中在與人類癌細(xì)胞凋亡調(diào)控機(jī)制及抗癌治療等方面［30-33］，在昆蟲中僅限于以黑腹果蠅為疾病模型的調(diào)控作用機(jī)制研究［25］。在作為鱗翅目模式種類的家蠶中開展API5基因功能及其調(diào)控機(jī)制等相關(guān)研究，對(duì)于深入理解細(xì)胞凋亡這一生物學(xué)現(xiàn)象的本質(zhì)以及為人類疾病研究與治療提供不同模型等頗有意義。

本文結(jié)果顯示，家蠶幼蟲被微生物侵染后可快速誘導(dǎo)BmAPI5基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)，其中以BmNPV的誘導(dǎo)作用較為明顯。這表明BmAPI5不僅參與家蠶正常細(xì)胞的凋亡調(diào)控，而且還涉及病毒-宿主的互作反應(yīng)。桿狀病毒對(duì)家蠶細(xì)胞的凋亡調(diào)控，在感染早期主要通過病毒編碼的IAPs抑制宿主細(xì)胞凋亡以利于其復(fù)制與增殖；在后期促進(jìn)家蠶細(xì)胞凋亡以利于病毒釋放與傳播［17］。因此，BmNPV侵染后誘導(dǎo)家蠶BmAPI5高水平表達(dá)來抑制宿主細(xì)胞的凋亡，推測(cè)可能是BmNPV作為其調(diào)控宿主細(xì)胞凋亡的一種間接手段，是利用其IAPs直接抑制凋亡的補(bǔ)充途徑。有關(guān)病毒對(duì)宿主API5基因的表達(dá)調(diào)控機(jī)制至今尚乏研究。在人類研究中，發(fā)現(xiàn)甲型流感病毒（Influ?enza A virus，IAV）可通過其編碼的核蛋白（Nucleo?protein，NP）與API5互作，促進(jìn)細(xì)胞凋亡而有利于IAV的復(fù)制［34］。由于桿狀病毒對(duì)宿主細(xì)胞凋亡的作用方式與IAV誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡不同，因此，有關(guān)BmA?PI5在與BmNPV-家蠶細(xì)胞互作中的調(diào)控機(jī)制有待進(jìn)一步研究，以期為家蠶抗病毒育種提供基礎(chǔ)。

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Effects of Bombyx mori Nucleopolyhedrovirus on the Expression of Apoptosis Inhibitor,Bm API5 in Bombyx mori

ZHANG Na,NIE Zuo-m ing,JIANG Cai-ying＊
（College of Life Sciences,Zhejiang Sci-Tech University,Hanghzou 310018,China）

The apoptosis inhibitor-5(API5)is a recently discovered inhibitor of apoptosis,which can effectively inhibit cell apoptosis.API5 is highly conserved in structure and function,and has been found in a variety of insects,including the silkworm,Bombyxmori.In this paper,the changes of the transcription and expression of BmAPI5 gene inB.morilarvae infected by BmNPV andEscherichiacoliwere detected.The results showed that microbial infection could significantly induce the transcription and expression of BmAPI5 gene,and the induction of BmNPV wasmore obvious.It suggests that BmAPI5may be involved in themechanism of BmNPV-host interaction.

Bombyxmori;nucleopolyhedrovirus;BmAPI5;gene expression

S884.5

A

0258-4069［2017］02-029-05

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31200974）

章娜（1990-），女，浙江衢州人，碩士研究生，從事家蠶生理生化與分子生物學(xué)研究。E-mail：491917586@qq.com

蔣彩英，女，副研究員。E-mail：jcy@zstu.edu.cn