復(fù)方左炔諾孕酮陰道環(huán)中有關(guān)物質(zhì)檢測的方法學(xué)研究

鄭 直 張 倩 寧美英

1.國家衛(wèi)生計生委科學(xué)技術(shù)研究所藥物和醫(yī)用材料研究中心（北京，100081）；2.北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院研究生院

復(fù)方左炔諾孕酮陰道環(huán)中有關(guān)物質(zhì)檢測的方法學(xué)研究

鄭 直1，2張 倩1，2寧美英1＊

1.國家衛(wèi)生計生委科學(xué)技術(shù)研究所藥物和醫(yī)用材料研究中心（北京，100081）；2.北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院研究生院

目的：建立復(fù)方左炔諾孕酮（LNG）陰道環(huán)中有關(guān)物質(zhì)的高效液相色譜（HPLC）檢測方法，并對該方法進(jìn)行方法學(xué)研究。方法：經(jīng)紫外光譜法確定吸收波長，利用雙波長法進(jìn)行HPLC的檢測。在強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、高溫、氧化劑、強(qiáng)光照等條件下，分別對注塑成型法制備的LNG和炔雌醇（EE）陰道環(huán)進(jìn)行破壞試驗。利用HPLC法考察陰道環(huán)的穩(wěn)定性、精密度、檢測限等。實驗方法為色譜柱DiamonsilR C18（250mm×4.6mm，5μm）；流動相乙腈－水體積比5248；LNG和EE的檢測波長分別為240nm和205nm；柱溫35℃；流速1.0ml／min。結(jié)果：專屬性實驗結(jié)果顯示，復(fù)方LNG陰道環(huán)主成分與相關(guān)雜質(zhì)及降解產(chǎn)物均分離良好，空白輔料對測定無干擾。結(jié)論：所建立的復(fù)方LNG陰道環(huán)中有關(guān)物質(zhì)的測定方法操作簡單、專屬性強(qiáng)、重復(fù)性好。

左炔諾孕酮；炔雌醇；陰道環(huán)；方法學(xué)驗證；高效液相色譜

左炔諾孕酮（LNG）是一種最為常用的第二代孕激素類避孕藥物，擁有良好的臨床使用效果和可接受性。炔雌醇（EE）是一種半合成強(qiáng)效固醇類雌激素，通常與LNG同時使用制備復(fù)方制劑，以提高避孕效果及適應(yīng)性［1］。陰道環(huán)給藥具有緩釋，甚至一定時間內(nèi)穩(wěn)定釋放的能力［2－3］，藥物經(jīng)陰道黏膜吸收入血，發(fā)揮陰道局部或全身的治療作用［4－5］。與其他制劑相比，陰道環(huán)給藥具備以下優(yōu)點：避免肝臟的首過效應(yīng)，提高藥物的生物利用度［1］；可自行取放，使用方便；加載在陰道環(huán)中的藥物能夠達(dá)到緩釋的效果，避免了大突釋產(chǎn)生的風(fēng)險。本實驗采用注塑成型法制備復(fù)方LNG陰道環(huán)，能夠使藥物均勻分散到硅膠中形成性質(zhì)穩(wěn)定的陰道環(huán)，達(dá)到緩釋的目的［811］。本文建立復(fù)方LNG陰道環(huán)中有關(guān)物質(zhì)的高效液相色譜（HPLC）檢測方法，并進(jìn)行方法學(xué)研究。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

LNG原料藥（批號：70801509004，秦皇島紫竹藥業(yè)有限公司）、EE原料藥（批號：73801506002，秦皇島紫竹藥業(yè)有限公司）、MED－6382液體硅橡膠（批號：70726，美國Nusil Technology）。

1.2 儀器

Sartorius－BT 224S電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）、CSR－4－10超純水機(jī)（北京愛斯泰克科技開發(fā)有限公司）、陰道環(huán)模具（北京東洛機(jī)電有限責(zé)任公司）、Waters 2695高效液相色譜儀、Waters 2487紫外檢測器、Waters 2414柱溫箱、自動進(jìn)樣器、Empower色譜工作站（Waters公司）。

1.3 陰道環(huán)的制備

1.3.1 EE陰道環(huán) 將陰道環(huán)模具放到80℃的烘箱中預(yù)熱15min。稱取EE 48mg、MED6382硅膠8 g，混合均勻后加入催化劑，繼續(xù)攪拌約15s?？焖賹⒒旌衔锛尤氲?0ml注射器中，勻速且快速地注入到預(yù)熱好的模具中。將模具放到80℃烘箱中加熱30min，成型后開模取出即得。

1.3.2 LNG陰道環(huán) 將陰道環(huán)模具放到80℃的烘箱中預(yù)熱約15min。稱取LNG 400mg、MED6382硅膠8g，混合均勻后加入催化劑，繼續(xù)攪拌約15s?？焖賹⒒旌衔锛尤氲?0ml注射器中，均勻快速的注入到預(yù)熱好的模具中。將模具放到80℃烘箱中加熱30min，成型后開模取出即得［3－4］。

1.4 實驗方法

1.4.1 色譜條件 色譜柱DiamonsilR C18（250mm ×4.6mm，5μm）；流動相乙腈－水（52：48，v／v）；LNG和EE的檢測波長分別為240nm和205nm；柱溫35℃；流速1.0ml／min。

1.4.2 供試品溶液的配制 分別取1／2的LNG陰道環(huán)和1／8EE陰道環(huán)，切成0.5mm薄片，分別置于裝有100ml甲醇的錐形瓶中，室溫下磁力攪拌36h和24h后冰浴超聲2h，經(jīng)0.45μm濾膜濾過。LNG組取續(xù)濾液1.0ml于50ml量瓶中，EE組取續(xù)濾液3.4ml于25ml量瓶中，分別用乙腈－水（體積比5248）稀釋至刻度，搖勻，分別作為LNG、EE供試品溶液，于4℃冷藏備用。

1.4.3 自身對照溶液的配制 精密量取LNG、EE供試品溶液各1.0ml，分別置于100ml量瓶中，用乙腈－水（體積比5248）稀釋至刻度，搖勻，得LNG、EE對照溶液，于4℃冷藏備用。

1.5 專屬性試驗

1.5.1 空白干擾試驗 按照1.3的方法，制備兩個空白陰道環(huán)，再將其均勻切成薄片（厚度0.5mm）置于裝有100ml甲醇的具塞錐形瓶中，分別磁力攪拌36h和24h后分別冰浴超聲2h，經(jīng)0.45μm濾膜濾過，配置供試品溶液，進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。

1.5.2 酸破壞 分別取1／2的LNG陰道環(huán)和1／8EE陰道環(huán)，切成0.5mm薄片，分別置于具塞錐形瓶中，再分別加1mol／L鹽酸溶液適量，于室溫放置24h，加0.1mol／L NaOH溶液調(diào)節(jié)至中性，加100 ml甲醇。對于LNG溶液，室溫下磁力攪拌24h后冰水浴下超聲2h；對于EE溶液，室溫下磁力攪拌36h后冰水浴下超聲2h。經(jīng)0.45μm濾膜濾，取續(xù)濾液3.5ml稀釋成25ml。HPLC進(jìn)樣得到峰面積數(shù)據(jù)。

1.5.3 堿破壞 分別取1／2的LNG陰道環(huán)和1／8EE陰道環(huán)，切成0.5mm薄片，分別置于具塞錐形瓶中，加入0.1mol／L NaOH溶液適量，于室溫放置24h，加0.1mol／L鹽酸溶液調(diào)節(jié)至中性，再加100ml甲醇。同上述方法制備供試品溶液，HPLC進(jìn)樣得到峰面積數(shù)據(jù)。

1.5.4 氧化破壞 分別取1／2的LNG陰道環(huán)和1／8EE陰道環(huán)，切成0.5mm薄片。加3%過氧化氫試液適量，室溫放置8h，加100ml甲醇。同上述方法制備供試品溶液，HPLC進(jìn)樣得到峰面積數(shù)據(jù)。

1.5.5 高溫破壞 分別取1／2的LNG陰道環(huán)和1／8EE陰道環(huán)，切成0.5mm薄片，分別置于具塞錐形瓶中，于60℃烘箱中放置24h后取出，放至室溫，加100ml甲醇。同上述方法制備供試品溶液，HPLC進(jìn)樣得到峰面積數(shù)據(jù)。

1.5.6 光照破壞 分別取1／2的LNG陰道環(huán)和1／8EE陰道環(huán)，切成0.5mm薄片。分別于（4500± 500）Lx光照條件下放置48h，置于具塞錐形瓶中，加100ml甲醇。同上述方法制備供試品溶液，HPLC進(jìn)樣得到峰面積數(shù)據(jù)。

1.5.7 檢測限 分別取兩溶液的0.01μg／ml的標(biāo)準(zhǔn)溶液不斷稀釋，按照1.4.1色譜條件進(jìn)行檢測，直到S／N為3／1，分別得到兩者的檢測限。

1.6 重復(fù)性試驗

取同一批號樣品，平行制備供試品溶液6份，以預(yù)定的方法測定，得到HPLC結(jié)果，計算測定的結(jié)果相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。

1.7 溶液穩(wěn)定性試驗

取LNG、EE供試品溶液，照預(yù)定的色譜條件，分別于0、4、8、12、24h時進(jìn)樣，記錄主成分、有關(guān)物質(zhì)及雜質(zhì)的峰面積，考察樣品穩(wěn)定性。

1.8 有關(guān)物質(zhì)檢查

取3批LNG和EE陰道環(huán)，制備LNG、EE供試品溶液及自身對照溶液，分別精密量取100μl及自身對照溶液100μl注入液相色譜儀，調(diào)節(jié)檢測靈敏度，使主成分色譜峰的峰高約為滿量程的10%，再精密量取供試品溶液和對照液各100μl，分別進(jìn)樣，記錄色譜圖至主成分峰保留時間的2倍。供試品溶液色譜圖中如有雜質(zhì)峰，用自身對照法計算雜質(zhì)的含量。

2 結(jié)果

2.1 專屬性實驗

2.1.1 空白干擾試驗 LNG和EE載藥陰道環(huán)經(jīng)過各自相同處理的空白陰道環(huán)提取液的HPLC圖譜顯示，在相應(yīng)的保留時間（箭頭所示）下并無其他的吸收峰出現(xiàn)，說明空白硅橡膠輔料環(huán)并不會對LNG和EE的相關(guān)檢測產(chǎn)生干擾。見圖1、圖2。

2.1.2 強(qiáng)制降解試驗 結(jié)果見圖3～14所示。圖4～8與圖譜3的對比和圖9與圖10～14的對比均表明，樣品經(jīng)酸、堿、氧化、高溫、光照破壞后，兩藥會有輕微的降解，但是各降解產(chǎn)物峰與主要兩峰之間均可達(dá)到良好分離。

圖1 LNG檢測條件下輔料的HPLC圖譜

圖2 EE檢測條件下輔料的HPLC圖譜

圖3 未經(jīng)破壞的陰道環(huán)中LNG的HPLC圖譜（tR＝12.98min）

圖4 陰道環(huán)中LNG在酸破壞下的HPLC圖譜（tR＝12.98min）

圖5 陰道環(huán)中LNG在堿破壞條件下的HPLC圖譜（tR＝12.98min）

圖6 陰道環(huán)中LNG在氧化破壞條件下的HPLC圖譜（tR＝12.98min）

圖7 陰道環(huán)中LNG在高溫破壞條件下的HPLC圖譜（tR＝12.98min）

圖8 光照破壞條件下陰道環(huán)中LNG的HPLC圖譜（tR＝12.98min）

圖9 陰道環(huán)中EE在未處理時的HPLC圖譜（tR＝8.28min）

圖10 陰道環(huán)中EE在酸破壞條件下的HPLC圖譜（tR＝8.28min）

圖11 陰道環(huán)中EE在堿破壞條件下的HPLC圖譜（tR＝8.28min）

圖12 陰道環(huán)中EE在氧化破壞條件下的HPLC圖譜（tR＝8.28min）

圖13 陰道環(huán)中EE在高溫破壞條件下的HPLC圖譜（tR＝8.28min）

圖14 陰道環(huán)中EE在光照破壞條件下的HPLC圖譜（tR＝8.28min）

2.2 檢測限

由樣品HPLC進(jìn)樣后出峰結(jié)果分析可知，LNG和EE的檢測限分別為3ng／ml和5ng／ml。

2.3 重復(fù)性實驗

6份供試品溶液中LNG和EE的雜質(zhì)總合RSD分別為1.7%和0.7%，統(tǒng)計學(xué)計算結(jié)果表明方法的重復(fù)性良好。

2.4 溶液穩(wěn)定性實驗

LNG和EE供試品溶液在24h內(nèi)雜質(zhì)峰面積綜合RSD分別為1.6%和0.9%，表明兩供試藥物在24h內(nèi)均基本穩(wěn)定。

2.5 有關(guān)物質(zhì)檢查

3批樣品定量測定結(jié)果見表1。統(tǒng)計結(jié)果顯示，所制備的3批樣品分別在LNG、EE檢測下的每種檢測到的雜質(zhì)的含量，即單雜質(zhì)和雜質(zhì)含量的總和，即總雜質(zhì)含量均低于0.5%。

表1 兩種檢測樣本有關(guān)物質(zhì)的檢測雜質(zhì)情況（%）

3 討論

2015版藥典并未收錄LNG陰道環(huán)有關(guān)物質(zhì)的檢測方法，本實驗采用控制變量法等對復(fù)方LNG陰道環(huán)中有關(guān)物質(zhì)檢測進(jìn)行了方法學(xué)研究，所用標(biāo)準(zhǔn)為2010版藥典二部藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)指導(dǎo)原則。

3.1 流動性相的選擇

本實驗是從原有基礎(chǔ)上的乙腈水體積比為7030的比例不斷調(diào)節(jié)，使得保留時間停留在合適的區(qū)段，最終選擇了乙腈水為5248的比例。在該比例下，末端吸收無影響，分離效果好，選擇性好，峰形好。紫外可見光波長掃描結(jié)果顯示，LNG和EE的最大吸收波長分別為240nm和205nm，且在各自的最大吸收波長下，另一種藥物的吸收很小。在陰道環(huán)載藥的體外試驗中，LNG和EE的釋藥量相對較小，在介質(zhì)中濃度低，所以在HPLC檢測中，采用了兩者的最大紫外吸收波長進(jìn)行雙波長檢測，相較于原有的單一波長檢測更準(zhǔn)確且直觀。

3.2 實驗條件的設(shè)定原理

兩種藥物制得的陰道環(huán)的提取方法和EE的檢測方法參考了李春曉［9］的研究數(shù)據(jù)；LNG則是采用了控制變量的方法不斷對各個項目進(jìn)行實驗最終確定，磁力攪拌24h，加冰水浴下超聲2h，得到的提取效率最佳。硅橡膠中加入了交聯(lián)催化劑，使得其交聯(lián)良好，因此加載在陰道環(huán)中的藥物，提取有一定的困難。所以在磁力攪拌的條件下繼續(xù)進(jìn)行了超聲提取，使其中藥物能夠很好被提取出來。

3.3 方法學(xué)驗證

本文中采用了不加校正因子的主成分自身對照法對復(fù)方LNG陰道環(huán)中的有關(guān)物質(zhì)進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示有關(guān)物質(zhì)及雜質(zhì)含量均低于限定量（0.5%），不會對主藥的測定產(chǎn)生干擾。專屬性實驗結(jié)果表明，LNG及EE能夠與降解產(chǎn)物良好分離，且空白陰道環(huán)不對主藥的HPLC檢測結(jié)果產(chǎn)生干擾。從而證明該HPLC檢測方法專屬性強(qiáng)，可用于復(fù)方LNG陰道環(huán)中有關(guān)物質(zhì)的檢測。

復(fù)方LNG陰道環(huán)中有關(guān)物質(zhì)的測定方法還未見報道，本研究著重優(yōu)化了檢測波長，采用了雙波長檢測法，經(jīng)方法學(xué)驗證此法專屬性強(qiáng)，靈敏度高，且符合藥典等相關(guān)規(guī)定要求，能夠為復(fù)方LNG陰道環(huán)中有關(guān)物質(zhì)的測定提供科學(xué)依據(jù)。

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［責(zé)任編輯：張 璐］

The methodology study on the detection of the related substance in compound levonorgestrel vaginal ring

Zheng Zhi1，2，Zhang Qian1，2，NING Meiying1＊
1.Centre of Drugs and Medical Polymer Materials，National Research Institute for Family Planning，Beijing，100081；2.Graduate School of Peking Union Medical College.
＊

mayning999＠126.com

Objective：To construct High Performance Liquid Chromatography（HPLC）method for detecting the relative substance in compound Levonorgestrel vaginal ring，and then to study on methodology of this HPLC method.Methods：The absorbing wavelength was decided by the ultraviolet ultraviolet spectrometry method.Then the HPLC method was detected by the dual wavelength detection method.The compound LNG vaginal ring was synthesized by the way of injection molding，and then breaking test of the compound LNG vaginal ring conducted under the condition of strong acid，strong alkaline，high temperature，oxidizing agent and strong illumination.And the repeatability，stability，accuracy，and the limit of detection（LOD）of the ring were also detected by HPLC method.The chromatographic condition included that，chromatographic column was Diamonsil R C18（250mm×4.6mm，5μm），mobile phase was acetonitrile water 52：48，detection wavelength of LNG was 240nm and detection wavelength of EE was 205nm，column temperature was 35℃and flow rate was 1.0ml／min.Results：The result of specificity test showed that，the main peak and the correlated peaks were well separated.Blank excipient couldn’t affect the main peaks.Conclusion：The established method for testing compound LNG vaginal ring has the characteristics of operative simplicity，strong specificity and good repeatability.

Levonorgestrel；Ethinyloestradol；Vaginal ring；Methodology study；HPLC

10.3969／j.issn.1004－8189.2017.05.002

“十三五”國家重點研發(fā)計劃課題（2016YFC1000904）

2016－10－08

2016－12－21

＊通訊作者：mayning999＠126.com