應(yīng)用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合關(guān)節(jié)軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)修復(fù)兔軟骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究

張志勇 于光屹 陶丹丹 王惠亭 方世宇

（大連大學(xué)附屬新華醫(yī)院骨科，遼寧 大連 116021）

應(yīng)用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合關(guān)節(jié)軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)修復(fù)兔軟骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究

張志勇 于光屹 陶丹丹 王惠亭 方世宇

（大連大學(xué)附屬新華醫(yī)院骨科，遼寧 大連 116021）

目的研究骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）復(fù)合關(guān)節(jié)軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)修復(fù)兔關(guān)節(jié)軟骨缺損的效果。方法選取36只3～4個月齡的健康新西蘭兔，分離其骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs），并在體外進(jìn)行培養(yǎng)擴(kuò)增。將BMSCs與關(guān)節(jié)軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)在體外培養(yǎng)瓶中進(jìn)行復(fù)合培養(yǎng)約3 d。將實(shí)驗(yàn)對象隨機(jī)分為3組，分別進(jìn)行3種不同的處理，實(shí)驗(yàn)結(jié)果用關(guān)節(jié)軟骨組織學(xué)評分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評分。結(jié)果移植手術(shù)后12周，移植培養(yǎng)好的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和關(guān)節(jié)軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)復(fù)合物的實(shí)驗(yàn)組修復(fù)組織和周圍組織整合良好，且修復(fù)效果顯著優(yōu)于移植單獨(dú)的關(guān)節(jié)軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)組和空白對照組。結(jié)論應(yīng)用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和關(guān)節(jié)軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)的復(fù)合物能有效的修復(fù)兔關(guān)節(jié)軟骨缺損。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；關(guān)節(jié)軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)；軟骨缺損；組織工程學(xué)

關(guān)節(jié)軟骨能通過緩解關(guān)節(jié)壓力來維持關(guān)節(jié)的正常功能，在關(guān)節(jié)的活動中起著至關(guān)重要的作用[1]。軟骨損傷是一種非常常見的骨科疾病，通常由創(chuàng)傷、腫瘤或感染等原因造成，是臨床治療中一個非常棘手的問題[2-5]。本研究用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞作為種子細(xì)胞，用關(guān)節(jié)軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)作為支架材料，將二者形成的復(fù)合物移植到兔軟骨缺損部位。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物：選取36只3～4個月齡的健康新西蘭兔，體質(zhì)量約3.0 kg，購買自大連醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器：DMEM培養(yǎng)液、胰蛋白酶、胎牛血清、二氧化碳培養(yǎng)箱。

1.3 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離與體外培養(yǎng)：BMSCs的分離與體外培養(yǎng)采用密度梯度離心法，具體參見穆曉紅等[5]研究方法。

1.4 關(guān)節(jié)軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)的制備：關(guān)節(jié)軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)的制備主要利用冷凍干燥、化學(xué)去污劑等方法制備脫細(xì)胞的兔關(guān)節(jié)軟骨，具體參見武天佑等[6]文獻(xiàn)中所用方法。

1.5 BMSCs和關(guān)節(jié)軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)體外復(fù)合培養(yǎng)：BMSCs和關(guān)節(jié)軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)體外復(fù)合培養(yǎng)根據(jù)楊強(qiáng)等[7]研究中所用方法進(jìn)行。

1.6 制備兔軟骨缺損模型：通過耳緣靜脈注射方法麻醉所選取的36只新西蘭兔，用直徑為5 mm的鉆孔儀在兔股骨踝關(guān)節(jié)面鉆2～3 mm深的孔，制備兔雙側(cè)膝關(guān)節(jié)軟骨缺損模型。

1.7 實(shí)驗(yàn)分組及移植方法：將所制備的36只軟骨缺損模型的新西蘭兔隨機(jī)分成3組，每組各12只，分別進(jìn)行3種不同的處理：第Ⅰ組兔軟骨缺損部位移植培養(yǎng)好的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和關(guān)節(jié)軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)復(fù)合物；第Ⅱ組移植單獨(dú)的關(guān)節(jié)軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)；第Ⅲ組不做任何移植處理。在手術(shù)后4、8、12周分別處死4只新西蘭兔，取雙側(cè)膝關(guān)節(jié)組織，然后通過免疫組織化學(xué)的方法進(jìn)行染色，并觀察缺損組織的修復(fù)情況。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析：實(shí)驗(yàn)結(jié)果參照Sellers關(guān)節(jié)軟骨組織學(xué)評分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評分，并利用SPSS13.0分析各實(shí)驗(yàn)組間是否存在顯著性差異。數(shù)值均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，統(tǒng)計學(xué)分析采用t檢驗(yàn)，P＜0.05表示具有顯著性差異。

2 結(jié) 果

2.1 實(shí)驗(yàn)用新西蘭兔統(tǒng)計：本研究選取36只3～4個月齡的健康新西蘭兔，隨機(jī)分為3組，每組12只，整個實(shí)驗(yàn)過程中無意外死亡或損失，全部計入結(jié)果分析。

2.2 體外分離及培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞：常規(guī)方法分離培養(yǎng)兔骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，并利用免疫染色的方法鑒定了骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)BMSCs特異性高表達(dá)抗原CD44，而不表達(dá)層粘連蛋白和CD34，表明我們分離機(jī)培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞是正確的。

2.3 制備關(guān)節(jié)軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)的支架材料，并研究其特性：Massion染色結(jié)果可見關(guān)節(jié)軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)中存在很多的軟骨陷窩且其周圍存在大量的膠原纖維。掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)脫細(xì)胞基質(zhì)中沒有殘存的細(xì)胞器或細(xì)胞核，表明脫細(xì)胞基質(zhì)的分離非常干凈。

2.4 觀察并評估BMSCs和關(guān)節(jié)軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)的復(fù)合物對兔軟骨缺損的修復(fù)效果：對3組新西蘭兔進(jìn)行移植處理后首先觀察其運(yùn)動狀態(tài)和健康情況，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過手術(shù)處理的兔子剛開始很少運(yùn)動，但隨著時間不斷地進(jìn)行自我恢復(fù)后，其運(yùn)動情況逐漸恢復(fù)正常，步態(tài)姿勢正常且術(shù)后2周左右基本恢復(fù)健康。

形態(tài)學(xué)觀察，發(fā)現(xiàn)第Ⅰ組新西蘭兔在移植手術(shù)后，修復(fù)效果較好，對3組實(shí)驗(yàn)觀察評分具體結(jié)果見表1。統(tǒng)計學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，第Ⅰ組移植骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合關(guān)節(jié)軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)的修復(fù)效果與第Ⅱ組單獨(dú)移植關(guān)節(jié)軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)和第Ⅲ組不做移植處理的空白組相比都有顯著提高（P＜0.05）。見表1。

表1 各組術(shù)后12周大體觀察評分統(tǒng)計結(jié)果（

表1 各組術(shù)后12周大體觀察評分統(tǒng)計結(jié)果（

注：*代表與第Ⅲ組比較P＜0.05，#代表與第Ⅰ組比較P＜0.05

組別表面平整填補(bǔ)缺損深度與正常軟骨組織融合總分Ⅰ0.79±0.32*0.83±0.411.02±0.57*2.63±0.78Ⅱ1.57±0.65*1.71±0.86#1.63±0.45*4.93±1.14#Ⅲ2.45±0.872.48±0.81#2.57±0.827.85±1.23#

3 討 論

組織工程研究的核心內(nèi)容是將細(xì)胞和生物材料通過一定的方法構(gòu)建成具有生命力的活體組織，進(jìn)一步用重新構(gòu)建的具有正常生物功能的活體組織來替換機(jī)體內(nèi)相應(yīng)的受損組織，并通過與周圍的正常組織完整的融合來達(dá)到治療目的，最終維持機(jī)體的正常功能。

本研究應(yīng)用體外分離培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)的種子細(xì)胞，用關(guān)節(jié)軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)作為支架材料，在體外將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞和關(guān)節(jié)軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)通過生物醫(yī)學(xué)的方法構(gòu)建成具有生命力的活體組織，進(jìn)而將二者形成的復(fù)合物移植到兔關(guān)節(jié)軟骨的缺損部位并觀察修復(fù)結(jié)果。從組織學(xué)和免疫組織化學(xué)的角度分別觀察和對比了實(shí)驗(yàn)組和對照組，發(fā)現(xiàn)該復(fù)合物相比對照組而言能有效地與周圍組織融合并維持兔軟骨的正常代謝和功能，從而非常有效地修復(fù)兔關(guān)節(jié)軟骨的損傷，這表明應(yīng)用骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合關(guān)節(jié)軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)可以用于修復(fù)兔軟骨損傷。

[1] 徐敬,趙建寧,徐海棟,等.關(guān)節(jié)軟骨損傷修復(fù)研究進(jìn)展[J].臨床與病理雜志,2015,35(3):455-461.

[2] 阮征,尹慶水,張余.關(guān)節(jié)軟骨損傷修復(fù)技術(shù)的研究與進(jìn)展[J].中國組織工程研究,2014(29):4724-4729.

[3] 王巖,李德華.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)合多肽凝膠及成軟骨生成因子修復(fù)兔關(guān)節(jié)軟骨缺損[J].中國組織工程研究,2015,19(1):30-36.

[4] 張志勇.轉(zhuǎn)導(dǎo)人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶基因致人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞永生化的研究[D].大連:大連醫(yī)科大學(xué),2009.

[5] 穆曉紅,趙子義,徐林,等.密度梯度離心法體外培養(yǎng)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分化能力[J].中國組織工程研究,2011,15(27):4955-4958.

[6] 武天佑,夏亞一,王栓科,等.關(guān)節(jié)軟骨脫細(xì)胞支架材料的制備[J].中國組織工程研究,2007,11(18):3601-3603.

[7] 楊強(qiáng),彭江,盧世璧,等.軟骨脫細(xì)胞基質(zhì)多孔支架與骨髓基質(zhì)干細(xì)胞體外構(gòu)建組織工程軟骨的研究[J].中華醫(yī)學(xué)雜志,2011,91 (17):1161-1166.

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1671-8194（2017）22-0053-02