SPME—GC—NPD法測(cè)定肉制品中揮發(fā)性N—亞硝胺的條件優(yōu)化

張?zhí)?樊曉盼+熊鳳嬌+王娜+楊華+馬儷珍

摘 要：利用固相微萃?。╯olid-phase microextraction，SPME）結(jié)合氣相色譜-氮磷檢測(cè)器（gas chromatography-nitrogen-phosphorus detector，GC-NPD）測(cè)定肉制品中9 種揮發(fā)性N-亞硝胺。通過(guò)優(yōu)化平衡時(shí)間、解析時(shí)間、萃取時(shí)間、萃取溫度、NaCl濃度和轉(zhuǎn)速確定9 種揮發(fā)性N-亞硝胺的最佳萃取條件。結(jié)果表明：以PDMS/DVB/CAR為萃取頭，平衡時(shí)間10 min、萃取溫度40 ℃、萃取時(shí)間30 min、攪拌速率400 r/min、NaCl質(zhì)量濃度0.36 g/mL、解吸時(shí)間3 min時(shí)能得到最佳萃取效果。采用SPME結(jié)合GC-NPD測(cè)定9 種N-亞硝胺的線性相關(guān)系數(shù)為0.994 9～0.999 7，檢出限為0.01～10.00 ng/mL，定量限為0.03～33.00 ng/mL，回收率為50.19%～93.20%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）為2.29%～9.65%。該方法可以滿足肉制品中N-二甲基亞硝胺（N-nitrosodimethylamine，NDMA）、N-二乙基亞硝胺（N-nitrosodiethylamine，NDEA）、N-二丙基亞硝胺（N-nitrosodipropylamine，NDPA）和N-二丁基亞硝胺（N-nitrosodibutylamine，NDBA）這4 種物質(zhì)含量的測(cè)定。

關(guān)鍵詞：固相微萃??；肉制品；N-亞硝胺；萃取條件

Optimization of Extraction Conditions for the Determination of Volatile N-Nitrosamines in Meat Products Using Solid-Phase Microextraction Combined with Gas Chromatography with Nitrogen-Phosphorus Detection

ZHANG Tian1， FAN Xiaopan2， XIONG Fengjiao2， WANG Na2，*， YANG Hua2， MA Lizhen2

（1.College of Food Science and Engineering， Shanxi Agricultural University， Taigu 030801， China；

2.College of Food Science and Biotechnology， Tianjin Agricultural University， Tianjin 300384， China）

Abstract： Nine volatile N-nitrosamines in meat products were extracted by solid-phase microextraction （SPME） and determined by gas chromatography with nitrogen-phosphorus detection （GC-NPD）. The optimum extraction conditions were established as follows： using PDMS/DVB/CAR fiber， equilibrium time 10 min， extraction time 30 min， extraction temperature 40 ℃， stirring speed 400 r/min， concentration of NaCl 0.36 g/mL， and desorption time 3 min. The linear correlation coefficients for the nine analytes were 0.994 9?0.999 7. The limits of detection were 0.01?10.00 ng/mL，

and the limits of quantification were 0.03?33.00 ng/mL. The recoveries of the presented method were in the range of 50.19%?93.20%， with relative standard deviation （RSD） of 2.29%?9.65%. In conclusion， the method could be used for the determination of N-nitrosodimethylamine （NDMA）， N-nitrosodiethylamine （NDEA）， N-nitrosodipropylamine （NDPA）， and N-nitrosodibutylamine （NDBA） in meat products.

Key words： solid-phase microextraction； meat product； N-nitrosamines； extraction conditions

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201707009

中圖分類號(hào)：TS251.6 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1001-8123（2017）07-0050-07

引文格式：

張?zhí)穑?樊曉盼， 熊鳳嬌， 等. SPME-GC-NPD法測(cè)定肉制品中揮發(fā)性N-亞硝胺的條件優(yōu)化[J]. 肉類研究， 2017， 31（7）：

50-56. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201707009. http：//www.rlyj.pubendprint

ZHANG Tian， FAN Xiaopan， XIONG Fengjiao， et al. Optimization of extraction conditions for the determination of volatile N-nitrosamines in meat products using solid-phase microextraction combined with gas chromatography with nitrogen-phosphorus detection[J]. Meat Research， 2017， 31（7）： 50-56. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201707009. http：//www.rlyj.pub

N-亞硝胺是一種N-亞硝基化合物，其化學(xué)通式為R1R2N—N=O。它是由二級(jí)胺與亞硝化劑反應(yīng)生成的，例如作為肉制品加工中的亞硝化劑，亞硝酸鹽或硝酸鹽與其降解產(chǎn)生的二級(jí)胺反應(yīng)就會(huì)形成N-亞硝胺[1]。許多動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明大部分N-亞硝胺有致癌、致畸和致突變性[2-3]。在日常飲食中，它會(huì)在食品的前處理、加工和保存過(guò)程中產(chǎn)生[4]。N-亞硝胺不僅可以在外界環(huán)境中形成，還可以直接在人體內(nèi)形成，尤其是在人的胃里[5]。

肉制品的組成成分十分復(fù)雜，且待測(cè)組分含量很低，因此在分析檢測(cè)N-亞硝胺前對(duì)樣品中的N-亞硝胺進(jìn)行提取和富集至關(guān)重要[5]。美國(guó)環(huán)境保護(hù)局規(guī)定在殘留物分析中要減少或代替有機(jī)溶劑的使用，特別是含有鹵族元素的有機(jī)溶劑[6]。目前提取N-亞硝胺的方法，如水蒸氣蒸餾[7-8]、低溫真空蒸餾[9]、溶劑液-液萃取[4]和固相萃取[10]等，仍然需要大量的有機(jī)溶劑，超臨界流體萃取[11]和固相微萃取[12]不需要用到有機(jī)溶劑，但是超臨界流體萃取設(shè)備成本高，提取過(guò)程復(fù)雜，被提取物的損失率高。N-亞硝胺最普遍的分析方法是氣相色譜（gas chromatography，GC）法[13-16]和液相色譜法[17-20]，也有采用膠束毛細(xì)管電動(dòng)色譜法[21-22]進(jìn)行測(cè)定的，而由于氣相色譜法能夠提供良好的分辨率，且很容易耦合具有敏感性和選擇性的檢測(cè)器往往會(huì)被作為首選[23-24]。

氮磷檢測(cè)器（nitrogen-phosphorus detector，NPD）是對(duì)氮、磷化合物有選擇地進(jìn)行高靈敏度檢測(cè)的檢測(cè)器，可用于藥品的代謝分析、聚脲系及磷系農(nóng)藥的殘留分析、亞硝基胺、三甲胺、樹(shù)脂中的丙烯脯等氮、磷化合物的選擇微量分析。盧紅兵等[25]利用NPD結(jié)合GC對(duì)煙草中特有的N-亞硝胺進(jìn)行了測(cè)定和分析，楊華等[26]用NPD結(jié)合GC測(cè)定了肉制品中的3 種揮發(fā)性N-亞硝胺。

固相微萃取（solid-phase microextraction，SPME）是一種相對(duì)較新的樣品前處理技術(shù)，集采樣、萃取、濃縮、進(jìn)樣于一體[27]，且無(wú)需溶劑，已在食品分析領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。SPME比溶劑萃取法更快速、簡(jiǎn)單，容易操作，且不需要有毒、昂貴的有機(jī)溶劑。Andrade等[12]利用頂空固相微萃取-氣相色譜-熱能分析儀（head space-solid-phase microextraction-gas chromatography-thermal analyzer，HS-SPME-GC-TEA），以發(fā)酵香腸為基質(zhì)，對(duì)SPME條件進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果表明，萃取條件對(duì)萃取效果的影響很明顯；張秋菊等[28]在用HS-SPME-GC-MS法測(cè)定7 種亞硝胺類化合物中的研究也發(fā)現(xiàn)萃取條件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果影響很大；楊華等[26]采用SPME結(jié)合氣相色譜儀測(cè)定了肉制品中的3 種N-亞硝胺，結(jié)果表明，萃取頭的選擇和萃取條件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有較大影響。

為了建立快速、有效測(cè)定肉制品中N-亞硝胺的方法，本研究用SPME-GC-NPD法測(cè)定肉制品中的N-二甲基亞硝胺（N-nitrosodimethylamine，NDMA）、N-甲乙基亞硝胺（N-nitrosomethylethylamine，NMEA）、N-二乙基亞硝胺（N-nitrosodiethylamine，NDEA）、N-二丙基亞硝胺（N-nitrosodipropylamine，NDPA）、N-亞硝基吡咯烷（N-nitrosopyrrolidine，NPYR）、N-亞硝基哌啶（N-nitrosopiperidin，NPIP）、N-二丁基亞硝胺（N-nitrosodibutylamine，NDBA）、N-亞硝基嗎啉（N-nitrosomorpholine，NMOR）、N-二苯基亞硝胺（N-nitrosodiphenylamine，NDpheA）9 種化合物。對(duì)平衡時(shí)間、解析時(shí)間、萃取溫度、萃取時(shí)間、轉(zhuǎn)速、鹽離子濃度等萃取條件以及檢測(cè)條件進(jìn)行優(yōu)化，得到最優(yōu)條件，并對(duì)肉制品中的N-亞硝胺含量進(jìn)行檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

魚(yú)肉類油炸制品16 種，均購(gòu)自當(dāng)?shù)爻小?/p>

N-亞硝胺混合標(biāo)準(zhǔn)品（含有NDMA、NDEA、NMEA、NDBA、NDPA、NPIP、NPYR、NMOR和NDPheA，質(zhì)量濃度均為2 mg/mL） 美國(guó)Sigma公司；甲醇（色譜純）、氯化鈉（分析純） 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；實(shí)驗(yàn)用水均為超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

7890A氣相色譜儀（配備NPD）、HP-INNOWax毛細(xì)管色譜柱 美國(guó)Agilent公司；PC-420D固微相萃取儀 墨西哥Corning公司；50/30 μm灰色PDMS/DVB/CAR萃取頭、1 cm磁力攪拌子、15 mL棕色樣品瓶 美國(guó)Supelco公司；HH數(shù)顯恒溫水浴鍋 江蘇省金壇市金城國(guó)勝實(shí)驗(yàn)儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 氣相色譜條件

進(jìn)樣口溫度：250 ℃，氮磷檢測(cè)器溫度：330 ℃，載氣（N2）流速10 mL/min，空氣流速60 mL/min，H2流速3 mL/min。升溫程序：初始溫度50 ℃，保持4 min；以10 ℃/min的速率上升至180 ℃，保持2 min；以20 ℃/min的速率上升至220 ℃，保持6 min，運(yùn)行溫度250 ℃，3 min。endprint

在上述條件下，分析不同流速（2、4、6 mL/min）對(duì)9 種N-亞硝胺分離效果的影響。利用安捷倫工作站對(duì)色譜圖進(jìn)行分析及數(shù)據(jù)處理，用保留時(shí)間定性，外標(biāo)法定量。

1.3.2 樣品前處理

取1 mL液體樣品于15 mL樣品瓶中，加入9 mL飽和NaCl溶液；固體樣品粉碎后取1 g于樣品瓶中，加入9 mL飽和NaCl溶液，攪拌均勻、密封后放入恒溫水浴鍋，平衡一段時(shí)間后固定于萃取臺(tái)上，設(shè)定萃取溫度和攪拌速率，將萃取針插入樣品瓶中，伸出萃取頭（至液面以上），以頂空方式萃取一定時(shí)間后縮回萃取頭。立即插入氣相色譜儀進(jìn)樣口中，伸出萃取頭，于高溫進(jìn)樣口解析一定時(shí)間，解析完成后縮回萃取頭并拔出萃取針，完成一次進(jìn)樣過(guò)程。

1.3.2.1 平衡時(shí)間的選擇

將1 mL質(zhì)量濃度為1 μg/mL的N-亞硝胺混合標(biāo)準(zhǔn)溶液置于15 mL樣品瓶中，加入9 mL飽和NaCl，置于40 ℃的恒溫水浴鍋里，N-亞硝胺不斷由液相揮發(fā)到氣相，最后達(dá)到在氣-液相中的分配平衡，平衡時(shí)間會(huì)影響采用SPME分析N-亞硝胺的結(jié)果。固定萃取溫度為35 ℃、萃取時(shí)間為45 min、攪拌速率為400 r/min、飽和NaCl作為萃取介質(zhì)、解析時(shí)間為3 min，分析平衡時(shí)間分別為0、5、10、15 min對(duì)9 種N-亞硝胺萃取效果（N-亞硝胺的峰面積）的影響。

1.3.2.2 萃取條件的優(yōu)化

在確定平衡時(shí)間后，對(duì)SPME的萃取條件進(jìn)行單因素試驗(yàn)。選擇萃取溫度分別為25、35、40、45、50、55 ℃（萃取時(shí)間30 min、攪拌速率400 r/min、飽和NaCl溶液），萃取時(shí)間分別為20、30、40、45、50 min（萃取溫度35 ℃、攪拌速率400 r/min、飽和NaCl溶液），攪拌速率分別為200、300、400、500、600 r/min（萃取溫度40 ℃、萃取時(shí)間30 min、飽和NaCl溶液），NaCl質(zhì)量濃度分別為0、0.20、0.36 g/mL（萃取溫度40 ℃、萃取時(shí)間30 min、攪拌速率400 r/min），研究各因素對(duì)9 種N-亞硝胺的萃取效果。

1.3.2.3 解析時(shí)間的選擇

以質(zhì)量濃度為1 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液為萃取對(duì)象，在平衡時(shí)間10 min、萃取溫度40 ℃、攪拌速率400 r/min、

飽和NaCl溶液作為萃取介質(zhì)的條件下萃取30 min，解析時(shí)間分別設(shè)定為2、3、4、5 min。根據(jù)色譜圖的出峰面積，確定最佳解析時(shí)間。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

9 種N-亞硝胺的混合標(biāo)準(zhǔn)品用甲醇配制成質(zhì)量濃度為200 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，置于棕色瓶中，-20 ℃避光保存；取0.5 mL上述標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用甲醇定容至10 mL棕色容量瓶中，配制成質(zhì)量濃度為10 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液；將N-亞硝胺混合標(biāo)準(zhǔn)工作液進(jìn)行逐級(jí)稀釋至質(zhì)量濃度為0.01、0.02、0.05、0.08、0.10、0.20、0.50、0.80、1.00 μg/mL，于最適分離條件下分別進(jìn)樣，以N-亞硝胺的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)。

1.3.4 方法的檢出限和定量限

分別將信噪比為3和10時(shí)測(cè)得的N-亞硝胺的濃度作為方法的檢出限（limit of detection，LOD）和定量限（limit of quantitation，LOQ）。

1.3.5 回收率實(shí)驗(yàn)

采用空白基質(zhì)加標(biāo)的方法測(cè)定回收率，準(zhǔn)確稱取肉樣1 g，分別添加1 mL質(zhì)量濃度為0.8、1.0、2.0 μg/mL的N-亞硝胺混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入8 mL飽和NaCl溶液，采用優(yōu)化后的條件進(jìn)行樣品前處理和GC-NPD分析。按照下式計(jì)算回收率。

式中：A2為加標(biāo)后樣品中9 種N-亞硝胺的峰面積/pA；

A1為加標(biāo)前樣品中9 種N-亞硝胺的峰面積/pA；A0為混合標(biāo)準(zhǔn)品中9 種N-亞硝胺的峰面積/pA。

1.3.6 精密度實(shí)驗(yàn)

計(jì)算加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)中5 次回收率平行測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative sandard deviation，RSD），分析加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)的精密度。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)均重復(fù)測(cè)定3 次，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及分析采用Statistix 8.1軟件包（St Paul，MN）中線性模型程序進(jìn)行方差分析，采用Tukey HSD程序進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 氣相色譜條件優(yōu)化及9 種N-亞硝胺標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖

樣品不經(jīng)SPME處理，采用氣相色譜結(jié)合氮磷檢測(cè)器，用HP-INNOWax石英毛細(xì)管柱對(duì)9 種N-亞硝胺進(jìn)行分離。由圖1可知，9 種N-亞硝胺都實(shí)現(xiàn)了基線分離，且各峰的峰形尖銳、對(duì)稱。采用程序升溫，50～180 ℃范圍內(nèi)，以10 ℃/min的速率升溫，NDMA、NMEA、NDEA、NDPA、NDBA、NPIP、NPYR和NMOR依次出峰，當(dāng)溫度以20 ℃/min升到220 ℃時(shí)，NDpheA出峰。在分離過(guò)程中，流速分別選擇2、4、6 mL/min，當(dāng)流速為4 mL/min和6 mL/min時(shí)，NDBA和NPIP沒(méi)有實(shí)現(xiàn)基線分離，當(dāng)流速為2 mL/min時(shí)，二者實(shí)現(xiàn)基線分離。

2.2 樣品前處理?xiàng)l件優(yōu)化

2.2.1 平衡時(shí)間的選擇

平衡過(guò)程，即樣品于萃取瓶中在一定的溫度、攪拌速率下進(jìn)行萃取，使溶液中的N-亞硝胺與頂空部分的

N-亞硝胺基本達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡。本研究選擇在40 ℃恒溫水浴鍋中進(jìn)行平衡。由表1可知，9 種N-亞硝胺在平衡時(shí)間為10 min時(shí)的出峰面積最大，且NDMA、NMEA、NDEA、NPIP、NPYR、NMOR的峰面積顯著高于其他平衡時(shí)間（P<0.05），此結(jié)果與Andrade等[12]報(bào)道的平衡時(shí)間為10 min時(shí)臘腸中的NDMA和NDEA的峰面積最大一致，因此選擇10 min作為9 種N-亞硝胺的平衡時(shí)間。endprint

2.2.2 萃取條件的優(yōu)化

2.2.2.1 萃取溫度的選擇

由表2可知，溫度為25～40 ℃時(shí)，除了NMEA，其他8 種N-亞硝胺的峰面積隨溫度升高而增加，且NDPA、NDBA、NPIP、NDpheA的峰面積增加顯著（P<0.05）。溫度為40～45 ℃時(shí)，NMEA、NDPA、NDBA、NMOR和NDpheA的峰面積隨溫度升高而增加，但差異不顯著（P>0.05），而NDMA、NDEA、NPIP和NPYR的峰面積隨溫度升高而減小，其中NDMA、NDEA和NPYR顯著降低；溫度繼續(xù)升高到55 ℃時(shí)，NMEA的峰面積顯著降低，NDPA和NMOR變化不顯著，NDBA和NDpheA顯著增加。這可能是因?yàn)?5 ℃時(shí)的水蒸氣氣壓增加，造成萃取頭在吸附的同時(shí)也在進(jìn)行脫附，當(dāng)溫度升高到55 ℃時(shí)，其峰面積變化不顯著。考慮到NDMA、NDEA和NPYR是食品中的主要致癌物，且其他N-亞硝胺在45 ℃以上溫度的峰面積與40 ℃差異不顯著，因此選擇40 ℃作為最適萃取溫度。

2.2.2.2 萃取時(shí)間的選擇

由表3可知，除了NDEA，其他8 種N-亞硝胺的峰面積隨著萃取時(shí)間的增加整體呈增大趨勢(shì)，萃取50 min后萃取頭吸附N-亞硝胺基本上達(dá)到平衡，且NMEA、NDEA和NPYR在萃取30 min和50 min時(shí)的差異不顯著

（P<0.05），而且固相微萃取本身就是一種不完全萃取，考慮到快速萃取操作及進(jìn)樣分析時(shí)間的可行性，最終選取30 min作為萃取時(shí)間。

2.2.2.3 攪拌速率的選擇

由表4可知，攪拌速率對(duì)9 種N-亞硝胺的峰面積有顯著影響（P<0.05），隨著攪拌速率的加快，9 種N-亞硝胺的峰面積并沒(méi)有明顯遞增趨勢(shì)，當(dāng)攪拌速率為400 r/min

時(shí)，出峰面積達(dá)到最大。雖然攪拌速率為400 r/min和

300 r/min時(shí)，除NDBA、NPYR和NdpheA的峰面積差異顯著（P<0.05）外，其他6 種N-亞硝胺的峰面積差異均不顯著（P>0.05），但由于攪拌速率較好控制，因此為了使萃取效率達(dá)到最大，本研究選擇攪拌速率為400 r/min。

2.2.2.4 NaCl質(zhì)量濃度的選擇

在待萃取的樣品中加入NaCl是為了降低待分析物在水溶液中的溶解度，促進(jìn)待分析物的揮發(fā)，使水相和空氣相中的分析物達(dá)到平衡[29]。由表5可知，除NMOR外，其他8 種N-亞硝胺的峰面積隨著NaCl質(zhì)量濃度的增加而增大；除NPYR和NMOR外，其他種類的N-亞硝胺在NaCl溶液飽和時(shí)，其出峰面積最大，且顯著高于質(zhì)量濃度為0.00 g/mL和0.20 g/mL的NaCl溶液作為萃取介質(zhì)時(shí)的峰面積（P<0.05）。因此選擇飽和NaCl溶液作為萃取介質(zhì)進(jìn)行萃取。

2.2.3 解析時(shí)間的選擇

萃取頭吸附的待測(cè)物在氣相色譜儀進(jìn)樣口解析時(shí)間的長(zhǎng)短對(duì)萃取效果有一定的影響。由表6可知，除NDBA、NPIP和NDpheA外，其他N-亞硝胺在解析時(shí)間為3 min時(shí)的出峰面積最大；NDEA解析3 min時(shí)的出峰面積顯著高于其他解析時(shí)間（P<0.05）；NDBA解析3 min時(shí)的出峰面積顯著高于解析2 min（P<0.05），與解析4、5 min時(shí)的差異不顯著（P>0.05）；NPIP解析3 min時(shí)的出峰面積顯著高于解析2、5 min（P<0.05），與解析4 min時(shí)的差異不顯著（P>0.05）；NDpheA解析3 min時(shí)的出峰面積與其他解析時(shí)間差異不顯著（P>0.05）。在對(duì)解析3 min后的萃取頭進(jìn)行老化操作時(shí)，并沒(méi)有出現(xiàn)殘留峰及雜質(zhì)峰，3 min的解析時(shí)間也確保了萃取頭的老化操作，因此選擇3 min作為最佳解析時(shí)間。

2.3 PDMS/DVB/CAR萃取頭萃取9 種N-亞硝胺的色譜圖

通過(guò)對(duì)平衡時(shí)間、萃取條件和解析時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化，得到最優(yōu)條件為平衡時(shí)間10 min、萃取溫度40 ℃、萃取時(shí)間30 min、轉(zhuǎn)速400 r/min、飽和NaCl溶液作為萃取介質(zhì)，在此條件下將100 ng/mL的9 種N-亞硝胺的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液萃取后，進(jìn)行氣相色譜檢測(cè)。由圖2可知，9 種N-亞硝胺全部分離，但響應(yīng)強(qiáng)度差異較大，這與萃取材料對(duì)目標(biāo)物的吸附強(qiáng)度有關(guān)。

2.4 方法的線性范圍、檢出限、定量限、回收率和精密度

由表7可知，該方法的線性相關(guān)性較好，相關(guān)系數(shù)均大于0.99。9 種N-亞硝胺的檢出限為0.01～10.00 ng/mL，NDMA、NDEA、NDPA、NDBA的檢出限較低，可以滿足肉制品中這4 種N-亞硝胺的痕量檢測(cè)，其精密度和準(zhǔn)確度均能滿足痕量分析的要求。

2.5 實(shí)際樣品測(cè)定

用SPME-GC-NPD方法，采用優(yōu)化得到的最佳條件測(cè)定16 種魚(yú)肉類油炸制品中9 種N-亞硝胺的含量。由表9可知，16 種被測(cè)肉制品中存在的N-亞硝胺主要為NDMA、NMEA和NDEA，只有個(gè)別樣品中含有NDBA和NPIP。目前GB 2762—2012《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中污染物限量》[30]中只對(duì)NDMA有限量規(guī)定（3 μg/kg），由本研究的測(cè)定結(jié)果可知，16 種被測(cè)肉制品中的NDMA含量均超過(guò)了此限量標(biāo)準(zhǔn)，特別是沒(méi)有限量規(guī)定的NMEA和NDEA的測(cè)定值特別高，如有的樣品中NMEA的測(cè)定值高達(dá)48.581 μg/kg。油炸制品中常被報(bào)道檢出的NPYR在本研究的樣品中并未檢出，主要原因是N-亞硝胺的檢測(cè)采用固微相萃取儀進(jìn)行前處理，采用PDMS/DVB/CAR萃取頭，對(duì)NPYR的吸附力較差，因此NPYR含量較低的產(chǎn)品檢測(cè)不出來(lái)。N-亞硝胺是一種致癌性很強(qiáng)的化合物，應(yīng)該予以重視。今后的研究應(yīng)分析造成產(chǎn)品中N-亞硝胺含量較高的原因及N-亞硝胺形成的影響因素，跟蹤產(chǎn)品的加工過(guò)程，尋找控制措施。endprint

3 結(jié) 論

本研究建立了SPME結(jié)合GC-NPD測(cè)定肉制品中

9種N-亞硝胺的方法，該方法簡(jiǎn)單、快速、不使用有機(jī)溶劑、易操作。以PDMS/DVB/CAR為萃取頭，解析時(shí)間3 min、平衡時(shí)間10 min、萃取溫度40 ℃、攪拌速率400 r/min、萃取時(shí)間30 min、飽和NaCl溶液作為萃取介質(zhì)時(shí)，9 種N-亞硝胺的峰面積最大。9 種N-亞硝胺的質(zhì)量濃度與對(duì)應(yīng)峰面積間的線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)為0.994 9～0.999 7，檢出限為0.01～10.00 ng/mL，定量限為0.03～33.00 ng/mL，回收率為50.19%～93.20%，RSD為2.29%～9.65%。由于檢出限和回收率的限制，本研究中的方法僅可以滿足肉制品中NDMA、NDEA、NDPA和NDBA的定量測(cè)定。

參考文獻(xiàn)：

[1] LISTED N. IARC monographs on the evaluation of the carcinogenic risk of chemicals to humans： some N-nitroso compounds[J]. Biologia Plantarum， 1987， 29（6）： 452. DOI：10.1007/BF02882220.

[2] CRADDOCK V M. Nitrosamines， food and cancer： assessment in Lyon[J]. Food and Chemical Toxicology， 1990， 28（1）： 63-65. DOI：10.1016/0278-6915（90）90137-C.

[3] HOTCHKISS J H. A review of current literature on N-nitroso compounds in foods[J]. Advances in Food Research， 1988， 31： 53-115. DOI：10.1016/S0065-2628（08）60166-4.

[4] CAMPILLO N， VI?AS P， MART?NEZ-CASTILLO N， et al. Determination of volatile nitrosamines in meat products by microwave-assisted

extraction and dispersive liquid-liquid microextraction coupled to gas chromatography-mass spectrometry[J]. Journal of Chromatography A， 2011， 1218（14）： 1815-1821. DOI：10.1016/j.chroma.2011.02.010.

[5] SCANLAN R A. Nitrosamines[J]. Encyclopedia of Food Sciences and Nutrition， 2003： 4142-4147.

[6] United States Environmental Protection Agency. Pollution prevention strategy[Z]. Washington D C： Federal Register， 1991.

[7] DRABIK-MARKIEWICZ G， DEJAEGHER B， DE MEY E， et al.

Influence of putrescine， cadaverine， spermidine or spermine on the formation of N-nitrosamine in heated cured pork meat[J]. Food Chemistry， 2011， 126（4）： 1539-1545. DOI：10.1016/j.foodchem.2010.11.149.

[8] WEI Fashan， XU Xinglian， ZHOU Guanghong， et al. Irradiated Chinese rugao ham： changes in volatile N-nitrosamine， biogenic amine and residual nitrite during ripening and post-ripening[J]. Meat Science， 2009， 81（3）： 451-455. DOI：10.1016/j.meatsci.2008.09.005.

[9] RAOUL S， GREMAUD E， BIAUDET H， et al. Rapid solid-phase extraction method for the detection of volatile nitrosamines in food[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry， 1997， 45（12）： 4706-4713. DOI：10.1021/jf970232q.

[10] YURCHENKO S， M?LDER U. The occurrence of volatile N-nitrosamines in Estonian meat products[J]. Food Chemistry， 2007， 100（4）： 1713-1721. DOI：10.1016/j.foodchem.2005.10.017.

[11] PENSABENE J W， FIDDLER W， MAXWELL R J， et al. Supercritical fluid extraction of N-nitrosamines in hams processed in elastic rubber nettings[J]. Journal of Aoac International， 1995， 78（3）： 744-748.endprint

[12] ANDRADE R， FELIX G R， RATH S. A method for the determination of volatile N-nitrosamines in food by HS-SPME-GC-TEA[J].

Food Chemistry， 2005， 91（1）： 173-179. DOI：10.1016/j.foodchem.2004.08.015.

[13] 李玲， 徐幸蓮， 周光宏. 氣質(zhì)聯(lián)用檢測(cè)傳統(tǒng)中式香腸中的9 種揮發(fā)性亞硝胺[J]. 食品科學(xué)， 2013， 34（14）： 241-244. DOI：10.7506/spkx1002-6630-201314049.

[14] 魏法山， 徐幸蓮， 周光宏. 揮發(fā)性N-亞硝基化合物的分析方法[J]. 食品科學(xué)， 2008， 29（7）： 479-484. DOI：10.3321/j.issn：1002-6630.2008.07.109.

[15] 王瑞， 馬儷珍， 方長(zhǎng)發(fā)， 等. 氣相色譜法測(cè)定熟肉制品中揮發(fā)性N-亞硝胺類化合物[J]. 中國(guó)食品學(xué)報(bào)， 2007， 7（2）： 124-127. DOI：10.3969/j.issn.1009-7848.2007.02.024.

[16] 何淑娟， 趙麗敏， 李強(qiáng)， 等. 氣相色譜-質(zhì)譜法測(cè)定肉制品中的9 種揮發(fā)性N-亞硝胺類物質(zhì)[J]. 肉類研究， 2015， 29（1）： 27-30. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-201501007.

[17] 楊寧， 陳穎慧， 鄧?yán)颍?等. 雙填料固相萃取-高效液相色譜-質(zhì)譜法同時(shí)檢測(cè)腌菜中9 種N-亞硝胺[J]. 分析化學(xué)， 2013， 41（7）： 1044-1049.

[18] HERRMANN S S， DUEDAHLOLESEN L， GRANBY K. Simultaneous determination of volatile and non-volatile nitrosamines in processed meat products by liquid chromatography tandem mass spectrometry using atmospheric pressure chemical ionisation and electrospray ionisation[J]. Journal of Chromatography A， 2014， 1330（4）： 20-29. DOI：10.1016/j.chroma.2014.01.009.

[19] MCDAY J. Ecological method development for detecting N-nitrosodimethylamine in water using HPLC-PDAD[D]. Ypsilanti： Eastern Michigan University， 2010： 1-88.

[20] 蔡魯峰， 李娜， 杜莎， 等. 固相萃取凈化-高效液相色譜法測(cè)定肉制品中的9 種N-亞硝基化合物[J]. 食品科學(xué)， 2016， 37（12）： 217-221. DOI：10.7506/spkx1002-6630-201612039.

[21] FILHO P J S， RIOS A， VALC?RCEL M， et al. Development of a new method for the determination of nitrosamines by micellar electrokinetic capillary chromatography[J]. Water Research， 2003， 37（16）： 3837-3842.

[22] YANG Youyou， NIE Honggang， LI Chenchen， et al. On-line concentration and determination of tobacco-specific N-nitrosamines by cation-selective exhaustive injection-sweeping-micellar electrokinetic chromatography[J]. Talanta， 2010， 82（5）： 1797-1801. DOI：10.1016/j.talanta.2010.07.075.

[23] BYUN M W， AHN H J， KIM J H， et al. Determination of volatile N-nitrosamines in irradiated fermented sausage by gas chromatography coupled to a thermal energy analyzer[J]. Journal of Chromatography A， 2004， 1054（1/2）： 403-407. DOI：10.1016/S0021-9673（04）01302-0.

[24] GREBEL J E， （MEL）SUFFET I H. Nitrogen-phosphorus detection and nitrogen chemiluminescence detection of volatile nitrosamines in water matrices： optimization and performance comparison[J]. Journal of Chromatography A， 2007， 1175（1）： 141-144. DOI：10.1016/j.chroma.2007.09.073.

[25] 盧紅兵， 鐘科軍， 毛友安， 等. 毛細(xì)管氣相色譜-氮磷檢測(cè)器法測(cè)定卷煙煙氣中TSNA的研究[J]. 湖南城市學(xué)院學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）， 2004， 13（4）： 55-60. DOI：10.3969/j.issn.1672-7304.2004.04.018.

[26] 楊華， 方長(zhǎng)發(fā)， 張?zhí)穑?等. SPME-GC-NPD法測(cè)定肉制品中揮發(fā)性N-亞硝胺[J]. 食品研究與開(kāi)發(fā)， 2016， 37（3）： 150-155. DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.03039.

[27] ALDURADA M D. Solid-phase microextraction： a promising technique for sample preparation in environmental analysis[J]. Journal of Chromatography A， 2000， 889（1/2）： 3-14. DOI：10.1016/S0021-9673（00）00453-2.

[28] 張秋菊， 郭祖鵬， 李明珠， 等. 頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜法測(cè)定7 種亞硝胺類化合物[J]. 中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志， 2009， 19（6）： 1234-1236.

[29] GREBEL J E， YOUNG C C， SSUFFET I H. Solid-phase microextraction of N-nitrosamines[J]. Journal of Chromatography A， 2006， 1117（1）： 8-11. DOI：10.1016/j.chroma.2006.03.044.

[30] 中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部. GB 2762—2012 食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中污染物限量[S]. 北京： 中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社， 2012.endprint