環(huán)介導等溫擴增技術在典型食源性致病菌檢測中的應用進展

梁玉林，劉秀，丁夢璇，劉遠遠，尹建軍

（中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京100015）

環(huán)介導等溫擴增技術在典型食源性致病菌檢測中的應用進展

梁玉林，劉秀*，丁夢璇，劉遠遠，尹建軍

（中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京100015）

環(huán)介導等溫擴增（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）技術是一種新穎的核酸恒溫擴增方法。因其具有簡單、快速、特異性強的特點，在國外已經(jīng)成功應用于多個行業(yè)，并在其中發(fā)揮著越來越重要的作用。闡述LAMP技術在大腸桿菌O157、沙門氏菌、志賀氏菌和金黃色葡萄球菌4種食源性致病菌檢測中的最新研究進展，將近年來針對4種細菌建立的LAMP方法中的靶基因、靈敏度和特異性進行匯總比較，對LAMP試驗常見問題進行分析，展望其在中國食源性致病菌檢測領域的研究和應用發(fā)展前景。

環(huán)介導；大腸桿菌；沙門氏菌；志賀氏菌；金黃色葡萄球菌；靶基因

近年來，我國食品安全事件多發(fā)，由微生物污染而引起的食源性疾病危害遠超違法濫用添加劑、農藥殘留等食品化學性污染。雖然我國建立了國家食源性致病菌監(jiān)測網(wǎng)絡，為食品安全和風險評估提供了科學依據(jù)，但是食源性致病菌檢測手段還比較滯后。目前我國對食源性致病菌檢測方法主要依靠傳統(tǒng)分離、培養(yǎng)及生化鑒定[1]。該方法耗時長，操作繁瑣，容易受環(huán)境和主觀因素影響，不能滿足現(xiàn)代食品生產(chǎn)和流通的需要，因此開發(fā)快速便捷的檢測方法迫在眉睫。隨著生化、計算機等領域的發(fā)展，以ELISA為代表的免疫學檢測方法雖然具有快速便捷等優(yōu)點，但其對試劑的選擇性高，抗體昂貴且不易保存。分子生物學技術，特別是以PCR為代表的變溫核酸擴增技術在食源性致病菌檢測方面發(fā)揮著重大作用。盡管該方法操作簡單，但需要借助高精密的儀器設備，不易在基層推廣。

日本學者Notomi等[2]在2000年發(fā)明的一種全新的核酸體外擴增新技術—環(huán)介導等溫擴增（Loop-mediated isothermal amplification，LAMP）。其基本原理是利用四條特異性引物分別識別靶基因的六個特定區(qū)域，同時采用具有鏈置換活性的DNA聚合酶，在60℃～65℃恒溫條件下進行的快速擴增反應。LAMP技術具有靈敏度高、特異性強、速度快、設備簡單等優(yōu)點。該技術在靈敏度、特異性和檢測范圍等指標上能媲美甚至優(yōu)于PCR技術，不依賴任何專門的儀器設備實現(xiàn)現(xiàn)場高通量快速檢測，檢測成本遠低于實時熒光定量PCR。近年來基于LAMP技術開發(fā)的快速檢測食源性致病菌方法層出不窮，檢測的靈敏度和特異性不斷提高。

1 LAMP技術在食源性致病菌檢測領域的應用

1.1 LAMP技術在大腸桿菌O157檢測中的應用

大腸桿菌是屬于革蘭氏陰性菌，大多數(shù)沒有致病性。大腸桿菌廣泛存在水和土壤中，如果人體免疫機能降低或者大腸桿菌入侵腸道外組織時，它們會成為條件致病菌從而引起人類疾病，輕者如腹瀉，重者如腸道外出血。大腸桿菌O157感染性腹瀉是近年來新發(fā)現(xiàn)的危害嚴重的腸道傳染病，自1982年美國首次發(fā)現(xiàn)該病以來，在世界上許多國家相繼爆發(fā)和流行，已成為全球性的公共衛(wèi)生問題之一。表1為近年來基于LAMP技術對大腸桿菌O157檢測靈敏度和特異性的研究匯總。

表1 LAMP技術在EcoliO157的檢測中的應用Table 1 The application of LAMP technology in E.coliO157 detection

大腸桿菌的rfbE和fliC基因作為靶基因具有很好的保守性[3-7]，rfbE基因是O抗原的編碼基因[4]。張雪寒等[5]建立快速檢測E.coli O157的LAMP方法，以rfbE基因序列設計了兩對LAMP引物，通過肉眼觀察結果。該方法對菌液和人工污染樣品的最低檢出限分別為1 cfu/mL和1 cfu/g，除大腸桿菌O157外均沒有發(fā)生特異性擴增反應。

表1中除了常用的rfbE和fliC靶基因外，還有stex、eae和wzy等基因，其中stex是編碼志賀毒素毒力因子基因[7-8，10]，有些大腸桿菌O157缺失stx基因，以stex基因序列設計特異性引物可能不會擴增出目的基因條帶進而造成假陰性的問題。wzy是編碼O抗原聚合酶的基因[9]，eae是編碼緊密粘附素的基因[10]，然而wzy和eae基因除了存在于大腸桿菌O157外，也少量存在于一些腸道細菌中，從而引起其他腸道細菌基因片段的擴增，造成假陽性干擾。

1.2 LAMP技術在沙門氏菌檢測中的應用

沙門氏菌是公認的食源性疾病最常見的革蘭氏陰性致病菌。沙門氏菌血清型復雜，其按抗原成分，可以分為甲、乙、丙、丁、戊等基本菌組，其中與人體疾病相關的主要是丁組的傷寒沙門氏菌和腸炎沙門氏菌。人們食用了污染了沙門氏菌的食品（豬肉、牛肉等）后會導致腸道疾病，如嘔吐、發(fā)燒和腹瀉等癥狀。表2為近年來基于LAMP技術對沙門氏菌檢測靈敏度和特異性的研究匯總。

invA基因編碼的蛋白在沙門氏菌致病過程中起著重要的作用，是沙門氏菌的主要毒力因子，已發(fā)表的文獻大多是以沙門氏菌侵襲蛋白invA基因作為檢測的靶基因[12-16]。沙門氏菌有很多不同種類，O抗原決定沙門氏菌的血清組，H抗原決定血清型，沙門氏菌因此被分為50多個血清組，超過2 500個血清型。其中傷寒和腸炎沙門氏菌同屬于沙門氏菌D血清組。RAVAN等[19]以prt基因為沙門氏菌D血清組的靶基因，對5株沙門氏菌D血清組和4株其他血清組沙門氏菌進行特異性檢出。由于傷寒和腸炎沙門氏菌是導致人類疾病的主要罪魁禍首，建立快速區(qū)分傷寒和腸炎沙門氏菌的檢測方法對治療食物中毒很有必要，樊粉霞等[22]以傷寒沙門氏菌的STY3671基因為靶基因，袁發(fā)滸等[23]以腸炎沙門氏菌的lygD基因作為靶基因，所建立的沙門氏菌LAMP技術檢測體系達到了對傷寒和腸炎沙門氏菌很好的區(qū)分效果。

表2 LAMP技術在沙門氏菌的檢測中的應用Table 2 The application of LAMP technology in Salmonella detection

1.3 LAMP技術在志賀氏菌檢測中的應用

志賀氏菌屬是一類具有較強傳染性、危害嚴重的革蘭氏陰性腸道致病菌。能引起食物中毒的食品大多為肉類、乳制品等蛋白質含量比較多的食品。Igor G等[37]研究表明10 cfu～100 cfu的志賀氏菌就可通過感染腸道而致病，引發(fā)嚴重的炎癥反應，在幼兒可引起急性中毒性菌痢，死亡率甚高。表3為近年來基于LAMP技術對志賀氏菌檢測靈敏度和特異性的研究匯總。

表3 LAMP技術在志賀氏菌的檢測中的應用Table 3 The application of LAMP technology in Shigella detection

前人發(fā)現(xiàn)以志賀氏菌侵襲性質抗原H（ipaH）基因作為檢測的目的基因具有較好的靈敏度。該基因存在于菌體的質?；蛘呷旧w上，是志賀氏菌檢測中常用到的目的基因[24-29]。ipaH基因在特異性檢測志賀氏菌方面也有一些不足，以該基因序列設計的引物不但能檢測出志賀氏菌，還可以檢測出腸侵襲性大腸埃希氏菌（EIEC）。SONG等[24]和張如勝等[27]以ipaH基因為靶基因對志賀氏菌、EIEC等細菌進行檢測，結果表明志賀氏菌和EIEC檢測結果均呈陽性，這樣可能會誤將EIEC當作志賀氏菌而檢出。

1.4 LAMP技術在金黃色葡萄球菌檢測中的應用

金黃色葡萄球菌是人類的一種重要革蘭氏陽性致病菌，有“嗜肉菌”的別稱。廣泛分布于自然界中，能引起奶牛乳房炎。人們通過食用受金黃色葡萄球菌污染的食物而引起疾病，容易受金黃色葡萄球菌污染的食物有奶、肉、蛋、魚和其制品等。除通過食物傳播外，人的化膿部位也容易感染金黃色葡萄球菌。表4為基于LAMP技術對金黃色葡萄球菌檢測靈敏度和特異性的研究匯總。

目前已經(jīng)查明的細菌性食物中毒事件中，由金黃色葡萄球菌產(chǎn)生的腸毒素引起的中毒案例所占比例較大。臨床分離的金黃色葡萄球菌有三分之一的菌株能產(chǎn)生腸毒素，且腸毒素穩(wěn)定不易受高溫和胃液蛋白酶的破壞。腸毒素有SEA-SEO等幾個血清型，GOTO等[30]在2007年以腸毒素基因SEA、SEB、SEC和SED序列為擴增靶序列。最終在44株金黃色葡萄球菌中檢出30株產(chǎn)腸毒素金黃色葡萄球菌，其中以SEB序列為擴增靶序列檢測靈敏度最高。

表4 LAMP技術在金黃色葡萄球菌檢測中的應用Table 4 The application of LAMP technology in Staphylococcus aureus detection

金黃色葡萄球菌可以產(chǎn)生一種與凝固酶相關的細胞外耐熱核酸酶[31-34]，近來以編碼耐熱核酸酶的基因為靶基因設計LAMP引物成為熱點，趙玥明等[34]以編碼耐熱核酸酶的nuc基因序列設計特異性引物，結果表明純菌的檢測靈敏度達到2.01 cfu/mL，是普通PCR靈敏度的100倍。

2 LAMP實驗常見問題分析

LAMP技術雖然發(fā)展至今已有十余年，但是在現(xiàn)實推廣過程中屢次遇到瓶頸，主要由于該種核酸檢測方法假陽性率高。造成假陽性的原因可分為LAMP實驗污染問題和引物非特異性擴增問題。

2.1 LAMP污染問題

LAMP反應具有較高的靈敏度，易受到反應試劑、反應器材及環(huán)境中污染的微量的DNA模板而導致假陽性的出現(xiàn)。最初LAMP擴增產(chǎn)物的檢測方法為瓊脂糖凝膠電泳，電泳出現(xiàn)梯狀條帶即可判斷擴增反應發(fā)生。因LAMP反應產(chǎn)物較PCR大，開蓋檢測容易造成氣溶膠污染。因此整個實驗過程應該嚴格分區(qū)，試管等工具專用，盡量避免開蓋。

在閉管檢測方面，前人做了大量工作。在2001年MORI等[37]提出LAMP擴增反應產(chǎn)生一種叫焦磷酸鎂的衍生物，該衍生物與生成的擴增產(chǎn)物成正比。通過觀察白色渾濁的有無，可驗證是否有靶基因的存在。由于肉眼觀測白色渾濁具有人為主觀性，為了降低誤判，有人從指示劑和染色劑方面進行研究。2008年TOMIA等在反應中加入鈣黃綠素對擴增產(chǎn)物進行檢測[38]。鈣黃綠素與試劑中的鎂離子處于淬滅狀態(tài)，擴增反應的副產(chǎn)物焦磷酸離子與鎂離子結合釋放鈣黃綠素，淬滅狀態(tài)解除，發(fā)出黃綠色熒光。2013年呂恒等[4]在反應體系中加入染料羥基萘酚藍（HNB）作為LAMP擴增的指示劑。羥基萘酚藍是鎂離子的滴定劑，隨著鎂離子與反應析出的焦磷酸根離子形成焦磷酸鎂沉淀，羥基萘酚藍失去鎂離子而呈現(xiàn)天藍色，未發(fā)生擴增反應的體系中羥基萘酚藍則為紫羅蘭色。

2.2 引物非特異性擴增問題

2007年，ZYRINA N V等[39]發(fā)現(xiàn)LAMP反應Bst聚合酶將寡核苷酸隨機摻入有缺口的DNA模板進行跨片段擴增。為消除非特異性擴增問題，通常做法是降低體系中的環(huán)引物濃度，設計合理的引物，添加特異性探針或對環(huán)引物標記。

反應體系中只含有內外引物一般不容易出現(xiàn)非特異性擴增。NAGAMINE在2002年提出在LAMP內外引物基礎上使用額外的一對引物，稱之為環(huán)引物（LF和LB），增加環(huán)引物后能夠減少LAMP的反應時間，有助于提高反應靈敏度[16]。環(huán)引物的添加除了能帶來反應效率的提高，同時也可能產(chǎn)生非特異擴增，造成假陽性的問題。通過降低反應體系中環(huán)引物的濃度能減少非特異性擴增的發(fā)生。設計合理的引物是LAMP反應最重要的一步，在經(jīng)過軟件設計出引物后，需要對引物進行比對和篩選，盡量減少引物間的非特異性配對。對擴增產(chǎn)物能夠進行特異性和非特異性區(qū)分在一定程度上也能解決非特異性擴增問題。一般是設計特異性探針，通過熒光信號檢測是否為特異性擴增產(chǎn)物[40]。該方法需要向體系中另外添加酶，可能會對體系中的原有成分產(chǎn)生影響。有人提出對體系中原有的環(huán)引物LF和LB進行標記可以避免由于其他成分的添加而造成的影響，只需要確定LF和LB不會發(fā)生非特異性配對并且擴增產(chǎn)物能夠同時檢測到LF和LB。

3 總結和展望

通過對近年來大腸桿菌O157、沙門氏菌、志賀氏菌和金黃色葡萄球菌建立的LAMP方法進行綜合分析，我們可以得出靶基因選取和引物設計對實驗的成敗起著至關重要的作用，在設計實驗時應該充分考慮靶基因的保守性和代表性。靶基因不具有特異性，導致致病菌不能被特異性檢出，進而出現(xiàn)假陰性和假陽性的問題。對選好的靶基因進行引物設計，在提高引物擴增反應效率的同時，也應該避免引物對之間的非特異性擴增。建立的LAMP方法對4種食源性致病菌檢出限一般能達到每毫升幾個菌落單位甚至更低，比PCR檢出限低兩個數(shù)量級。

隨著LAMP技術的應用不斷深入，我們對LAMP檢測方法又提出新的要求。目前已知的大多數(shù)LAMP實驗只能在一個體系中檢測一種致病菌，在需要快速篩查多個致病菌時，需要對其進行分別檢測，這會耗費較大的人力物力。為了充分利用LAMP技術優(yōu)勢、提高診斷檢測的效率與可靠性、擴展其應用范圍，同時節(jié)約試劑成本，多重LAMP技術將會是未來的發(fā)展方向。姜侃等[41]對沙門氏菌、單增李斯特和金黃色葡萄球菌建立三重LAMP方法。實驗采取多重LAMP體系對3種致病菌單獨檢測，3種致病菌的檢測靈敏度均約為10 cfg/μL，取得了滿意的檢測效果。食品檢測中，死菌DNA長期存在使基因水平的檢測方法高估了樣品中活菌的水平，也有可能造成假陽性問題。RT-LAMP在以核糖核酸為基礎的擴增檢測中具有獨特的優(yōu)勢，因為體系中所用的模板為提取的致病菌RNA，擴增結果呈陽性表明所檢測的致病菌是處于活的增殖狀態(tài)，應用于現(xiàn)場檢測時，更能體現(xiàn)樣本中的活菌狀態(tài)，反映樣本潛在的感染性。CHAYAPA等[15]對腸炎沙門氏菌建立RT-LAMP檢測方法，經(jīng)16 h富集培養(yǎng)后，純菌加DNA酶處理與不加DNA酶處理的檢出限分別為100cfu/mL和101cfu/mL。熒光染料疊氮溴化丙錠（PMA）與快速檢測技術LAMP相結合也能區(qū)分死菌和活菌。PMA是對DNA具有高度親和力的DNA熒光染料，不能透過完整的細胞膜，只能選擇性地通過不完整的死細胞，PMA與死菌DNA結合使之不能發(fā)生擴增。CHEN等[14]建立了PMA-LAMP方法，通過該方法可有效的在農產(chǎn)品中快速檢測有繁殖能力沙門氏菌。

LAMP技術是在本世紀發(fā)展起來的一種恒溫核酸擴增技術，雖然還存在許多有待解決的問題，但它在不斷地完善和改進。隨著我國快檢技術的不斷發(fā)展，有理由相信LAMP技術將會有更廣闊的應用前景。

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Application of Loop-mediated Isothermal Amplification in the Detection of Typical Foodborne Pathogens

LIANG Yu-lin，LIU Xiu*，DING Meng-xuan，LIU Yuan-yuan，YIN Jian-jun
（China National Research Institute of Food&Fermentation Industries，Beijing 100015，China）

Loop-mediated isothermal amplification （LAMP）is a novel nucleic acid amplification method.For its simplicity，rapidity and specificity，it has been successfully applied in many industries abroad and plays an increasingly significant role.In this paper，the latest research progress of LAMP technology in the detection of four foodborne pathogens of E.coli O157，Salmonella，Shigella and Staphylococcus aureus was described.The target gene，sensitivity and specificity of the pathogenic bacteria were summarized and compared in the established LAMP method for four bacteria in recent years.The shortcomings of this technique in detection of pathogenic bacteria and the prospects of its application in China were put forward.

Loop-mediated；Escherichia coli；Salmonella；Shigella，；Staphylococcus aureus；target gene

2016-12-26

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.18.044

梁玉林（1991—），男（漢），碩士研究生，發(fā)酵工程專業(yè)。

*通信作者：劉秀（1979—），男（漢），高級工程師，主要從事食品真實性檢測。