LC-MS指紋圖譜結(jié)合一測多評法評價(jià)沒食子藥材質(zhì)量

龍飛，馬尚智，于瑋，陳海君，張珂，陳文，韓博*

（1石河子大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，新疆 石河子 832002；2石河子大學(xué)藥學(xué)院，新疆 石河子，832002）

LC-MS指紋圖譜結(jié)合一測多評法評價(jià)沒食子藥材質(zhì)量

龍飛1,2，馬尚智2，于瑋2，陳海君2，張珂2，陳文2，韓博2*

（1石河子大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，新疆 石河子 832002；2石河子大學(xué)藥學(xué)院，新疆 石河子，832002）

為建立不同產(chǎn)地沒食子水提液的LC-MS指紋圖譜，測定定沒食子藥材中主要成分的含量。采用LC-MS分析技術(shù)對不同產(chǎn)地的沒食子水提液中的化合物進(jìn)行分析與鑒定，并以沒食子酸為參照物，采用一測多評的方法同時(shí)測定沒食子藥材中沒食子酸及其主要成分的含量。結(jié)果顯示，LC-MS指紋圖譜共檢測到14個(gè)特征峰，8個(gè)主要特征峰被鑒定。8個(gè)不同產(chǎn)地沒食子藥材中4個(gè)多酚類化合物的含量無明顯差異。不同產(chǎn)地沒食子藥材的相似度在0.883-0.944之間。由此可知，LC-MS指紋圖譜與一測多評方法的結(jié)合可方便，快速評價(jià)沒食子的質(zhì)量，靈敏度高，重復(fù)性好。該工作為富含鞣質(zhì)藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供了可借鑒的方法。

沒食子；指紋圖譜；一測多評；相似性評價(jià)；層次聚類分析

沒食子 (Gall ofQ.infectoriaOliv.)為沒食子蜂科（癭蜂科）昆蟲沒食子蜂 (Cynips gallae-tinctoriae Oliv.)的幼蟲，寄生于殼斗科植物沒食子樹 (Q.infectoriaOliv.)幼枝上，產(chǎn)生的一種蟲癭。主產(chǎn)于土耳其、敘利亞、希臘、伊朗及印度等地，尤以小亞細(xì)亞和阿勒頗產(chǎn)量大、質(zhì)量優(yōu)[1]。

沒食子作為我國維吾爾醫(yī)傳統(tǒng)特色藥，具有其獨(dú)特的生物學(xué)特性和多方面的藥理活性。近十年來，沒食子中一些固醇類、黃酮類、生物堿類、鞣質(zhì)類、揮發(fā)油、皂苷、蒽醌類等化合物逐漸被發(fā)現(xiàn)[1]。在早期階段的生物活性研究中，藥理學(xué)家對鞣質(zhì)類化合物產(chǎn)生了極大的興趣。因?yàn)轺焚|(zhì)是沒食子藥材中的主要化合物，其含量高達(dá)50-70%。到目前為止，約有10個(gè)單寧化學(xué)成分已經(jīng)被鑒定。鞣質(zhì)具有多種生物活性，包括抗炎[2]、抗菌、抗真菌[3]、抗氧化[4]、抗病毒和抗腫瘤[5]的性質(zhì)。

在新疆維吾爾醫(yī)院，西帕依固齦液 (KJA)在治療某些疾病的藥理研究和臨床研究方面是非常有效的制劑。KJA的主要成分是沒食子多酚類化合物，并已證實(shí)在治療大鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型的結(jié)腸組織形態(tài)和病變方面效果顯著[6]，卻沒有被廣泛使用，重要原因之一是缺乏一個(gè)有效的方法來評估藥材的質(zhì)量。

本文建立了不同產(chǎn)地沒食子多成分LC-MS指紋圖譜，鑒定了8個(gè)特征化合物，并采用一標(biāo)多測的方法同時(shí)測定了4個(gè)化合物的含量。指紋圖譜技術(shù)和一測多評含量測定技術(shù)相結(jié)合，為沒食子藥材質(zhì)量控制和評價(jià)提供了更好的技術(shù)手段，也為富含鞣質(zhì)藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Waters LC-MS色譜儀：配515 HPLC蠕動(dòng)泵，2545二元泵，489紫外檢測器，2767自動(dòng)進(jìn)樣樣品架 (Waters，USA)，Symmetry C18 柱(Ф4.6×250 mm，5 μm，Waters)，SB25-12DTD 超聲清洗器 (寧波生物科技有限公司，中國)，電子天平 (KERN ABT 220-5DM，德國)，Milli-Q 制水機(jī) (0.22 μm，默克密理博)。

沒食子中4個(gè)多酚類化合物的對照品（沒食子酸，沒食子酸甲酯，沒食子酸乙酯，雙-沒食子酸）購買于成都Biopurity植物化學(xué)產(chǎn)品公司。通過HPLC分析檢測，利用峰面積歸一化法來計(jì)算這4個(gè)化合物的純度均大于98%。LC-MS用的甲醇和其他相關(guān)試劑（甲酸）購買于國藥化學(xué)試劑有限公司（色譜純，中國），準(zhǔn)備樣品及流動(dòng)相用的水是由Milli-Q制水機(jī)制備。

1.2 藥材

沒食子藥材購買于8個(gè)不同的產(chǎn)地，實(shí)驗(yàn)中所有的樣品藥材均由石河子大學(xué)藥學(xué)院韓博副教授鑒定為沒食子 (Q.infectoria Oliv.)。將沒食子藥材粉碎，過40-80目篩，得到?jīng)]食子粉末，采用加熱回流的方法提取得到的浸膏含量（表1）。所有樣品保存在4℃環(huán)境下，存放于新疆特種植物藥資源教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

表1 不同產(chǎn)地收集的沒食子藥材Tab.1 The galls of Q.infectoria were collected from different regions

1.3 供試品的制備

精密稱定8個(gè)不同產(chǎn)地的沒食子粉末各10 g，加入10倍量的蒸餾水，采用回流提取方法，提取3次，每次2 h，過濾合并濾液。然后將不同含量的沒食子提取液稀釋為固形物的含量為1 mg/mL的溶液，然后再過0.45 μm的濾膜，即得供試液。

1.4 對照品溶液的制備

精密稱定沒食子酸、沒食子酸甲酯、沒食子酸乙酯、雙-沒食子酸等4種對照品約20 mg，分別加入1 mL甲醇，制備成濃度1 mg/mL的溶液，再稀釋10倍，制成0.1 mg/mL的溶液，過0.45 μm的濾膜，即得對照品溶液。

1.5 LC-MS分析色譜條件

流動(dòng)相：甲醇 (A)-0.2% 甲酸水溶液 (B)，梯度洗脫程序（表 2）。柱溫∶35 ℃；體積流量∶1 mL/min；進(jìn)樣量：20 μL；檢測波長：254 nm 和 270 nm。質(zhì)譜全掃描分析條件：在負(fù)離子模式下，離子源為ESI，檢測的質(zhì)量范圍為100-2000 m/z[7]，毛細(xì)管電壓為2.64 KV，干燥氣溫度為350℃，離子源溫度為150℃，脫溶劑的氣體為N2(800 L/Hr)。

表2 LC-MS梯度洗脫程序Tab.2 LC-MS elution procedure

1.6 待測組分含量計(jì)算

采用QAMS法計(jì)算待測成分質(zhì)量的公式為Wi= (Ws×Ai)/ (fs/i×As)。其中Wi為待測組分的質(zhì)量，Ws為內(nèi)參物的質(zhì)量，Ai為待測組分的峰面積，fs/i為待測組分與內(nèi)參物的RCF，As為內(nèi)參物峰面積，其中相對校正因子RCF計(jì)算公式fs/i=(Ws×As)/(Wi×As)。精密吸取 S1～S8 供試品溶液，進(jìn)行LC-MS測定，記錄待測峰峰面積。將各樣品中參照物峰面積 (As)代入回歸方程計(jì)算其質(zhì)量 (Ws)。以內(nèi)參物沒食子酸及待測組分質(zhì)量為進(jìn)樣量，根據(jù)進(jìn)樣體積、供試品溶液體積及樣品稱樣量計(jì)算各成分在樣品中的含量。

1.7 指紋譜圖相似度評價(jià)

采用相似度評價(jià)的方法對8個(gè)不同產(chǎn)地沒食子色譜圖數(shù)據(jù)，采用由國家食品和藥物管理局認(rèn)可的中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)軟件進(jìn)行分析評價(jià)，得到不同產(chǎn)地沒食子的色譜圖差異。將不同產(chǎn)地沒食子藥材的測試數(shù)據(jù)導(dǎo)入相似性評價(jià)系統(tǒng)軟件中，將圖3中選定特征峰進(jìn)行譜峰匹配，通過中位數(shù)矢量計(jì)算得出其共有圖譜標(biāo)準(zhǔn)模板（參考標(biāo)準(zhǔn)值為1），然后進(jìn)行各樣品的相似度評價(jià)[8]，其相似度是通過相似度余弦計(jì)算公式計(jì)算而得[9]，余弦計(jì)算公式如下：

其中Cx為保留時(shí)間，Cy為峰面積，n為樣品數(shù)。

1.8 聚類分析

采用SPSS19.0數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)軟件 (SPSS 19.0，IBM Inc.，USA)[10]，將8個(gè)不同產(chǎn)地沒食子LC-MS色譜圖中的8個(gè)共有峰面積數(shù)據(jù)，選用組間對比進(jìn)行聚類，用余弦法計(jì)算樣品相似性程度[11]。

2 結(jié)果

2.1 LC-MS分析結(jié)果

對沒食子水提液進(jìn)行LC-MS分析，得到?jīng)]食子水提液的LC-MS色譜圖（圖1），沒食子水提液質(zhì)譜圖（圖1A），紫外 (269 nm)吸收光譜圖（圖1B），標(biāo)識出14個(gè)共有峰。結(jié)果表明：沒食子藥材中包含8個(gè)主要化合物，其分子量分別為m/z 331.15，m/z 169.09，m/z 320.74，m/z 483.13，m/z 634.93，m/z 786.98，m/z 939.41和 m/z 1091.28。在圖 1A 中，通過對比對照品的相對保留時(shí)間、分子量，峰2被鑒定為沒食子酸，紫外吸收最高，具有良好的分離效果。因此，本選擇峰2為參照峰，獲得沒食子中其他峰的相對保留時(shí)間和相對峰面積。

圖1 沒食子水提液的LC-MS色譜圖Fig.1 LC-MS analysis of the gall ofQ.infectoriawater-extracting solution

通過LC-ESI-MS數(shù)據(jù)將不同產(chǎn)地沒食子中的8個(gè)化合物分別鑒定為沒食子酸 (Gallic acid)，對-二-沒食子酸 (Digallic acid)，以及6個(gè)鞣質(zhì)類化合物 分 別 為 Monogalloyl-glucoside，Digalloyl-glucoside，Trigalloyl-glucoside，Tetragalloyl-glucoside，Pentagalloylglucoside，Hexagalloyl-glucoside。通過文獻(xiàn)查閱[12]，沒食子中還包括一些沒有出峰的化合物，如沒食子酸甲酯、沒食子酸乙酯和鞣花酸，其分子量分別為m/z 184.1461、m/z 198.1727和m/z 302.19。其化合物結(jié)構(gòu)（圖 2）。

圖2 沒食子藥材中共有鞣質(zhì)類化合物的結(jié)構(gòu)Fig.2 Structures of the tannins were identified in the gall ofQ.infectoria

2.2 化合物的結(jié)構(gòu)解析

在負(fù)離子模式下，設(shè)置固定的碰撞電壓，得到?jīng)]食子水提液中酚類物質(zhì)質(zhì)譜全掃總離子流圖。在不同的碰撞電壓下，得到不同分子量的酚類物質(zhì)的質(zhì)譜離子碎片以及化合物信息（表3）。

通過對離子碎片進(jìn)行分析，可以知道每個(gè)多酚類化合物丟失的離子碎片基團(tuán)，從而可以推斷化合物結(jié)構(gòu)。

表3 沒食子中被鑒定化合物的結(jié)構(gòu)解析Tab.3 Tentative identification of all compounds in the gall ofQ.infectoria

2.3不同產(chǎn)地沒食子多組分LC-MS指紋圖譜的建立

將8個(gè)不同產(chǎn)地的沒食子藥材的供試品溶液按“2.5”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣，通過Waters液相工作站處理，得到不同產(chǎn)地沒食子藥材的LC-MS指紋圖譜疊加圖 (圖 3)。

從圖3可知，8個(gè)不同產(chǎn)地的沒食子原藥材的主要特征峰相同，共鑒定了8個(gè)共有峰，說明不同產(chǎn)地的沒食子藥材的主要化學(xué)成分特征相似，只是在峰高、峰面積等方面有略微的差異。

處理不同產(chǎn)地沒食子藥材供試液的檢測數(shù)據(jù)，以特征峰2為參考峰，計(jì)算得到不同產(chǎn)地沒食子的相對保留時(shí)間 (RRT)和相對峰面積 (RPA)（表4），以及不同產(chǎn)地沒食子LC-MS指紋圖譜中8個(gè)共有峰的百分含量（表5）。

表4、表5結(jié)果表明：8個(gè)不同產(chǎn)地的沒食子藥材的共有峰保留時(shí)間基本相同，各相對峰的峰保留時(shí)間以及峰面積的RSD均小于3.0%，說明不同產(chǎn)地的沒食子中特征峰的含量差異不明顯。

圖3 不同產(chǎn)地沒食子水提液的LC-MS指紋圖譜Fig.3 LC-MS fingerprints of eight samples of the gall ofQ.infectoria

表4 共有特征峰的相對保留時(shí)間 (RRT)和相對峰面積(RPA)Tab.4 RRT and RPA of common peaks on LC-MS fingerprints of the gall ofQ.infectoriafrom different regions

表5 不同產(chǎn)地沒食子中8個(gè)共有特征峰峰面積百分含量Tab.5 Percent contents of 8 common peaks in the gall ofQ.infectoriafrom different regions

2.4 樣品測定方法學(xué)考察

2.4.1 精密度考察

精密稱定沒食子酸對照品，按“1.4”項(xiàng)方法制備對照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄LC-MS圖譜，以相對應(yīng)的色譜峰相對保留時(shí)間和相對峰面積為指標(biāo)計(jì)算RSD為2.1%，RSD＜ 3%，表明該方法精密度良好。

2.4.2 重復(fù)性考察

精密稱取同一藥材粉末5份，按“1.3”項(xiàng)方法制備供試品溶液，記錄LC-MS圖譜，以色譜峰相對保留時(shí)間和相對峰面積為指標(biāo)計(jì)算RSD值。其RSD值分別為1.2%，2.4%，結(jié)果RSD＜3%，表明該方法重現(xiàn)性良好。

2.4.3 穩(wěn)定性考察

精密稱定沒食子藥材粉末 10 g，按“1.3”項(xiàng)方法制備供試品溶液，分別于 0、2、4、8、12 h進(jìn)行分析檢測，以色譜峰相對保留時(shí)間為指標(biāo)計(jì)算RSD，其值為1.6%，RSD＜3%，表明供試品溶液12 h內(nèi)，穩(wěn)定性良好。樣品測定方法學(xué)考察結(jié)果表明，LC-MS指紋圖譜方法是一種可靠、穩(wěn)定的方法。

2.5 QAMS法測定4個(gè)多酚類化合物

2.5.1 線性關(guān)系考察

精密量取沒食子酸對照品溶液 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL分別置 25 mL棕色量瓶中，用 0.45 μm濾膜濾過，進(jìn)行LC-MS分析，記錄色譜峰。以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程為Y=28558X-5124，r=0.9996，沒食子酸在0.1 mg～0.5 mg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5.2 樣品測定與含量計(jì)算

將各樣品中相應(yīng)待測組分峰面積 (Ai)及RCF（經(jīng)計(jì)算，沒食子酸與待測物沒食子酸乙酯、雙-沒食子酸、沒食子酸甲酯的RCF分別為0.7087、0.8026、0.9529和0.6518），代入待測組分質(zhì)量計(jì)算公式可計(jì)算相應(yīng)質(zhì)量（表6）。

表6 沒食子中4個(gè)多酚類成分含量測定結(jié)果 mg/gTab.6 Determination results of 4 polyphenols in the gall ofQ.infectoria

2.6 相似度評價(jià)

8個(gè)不同產(chǎn)地沒食子的相似度評價(jià)結(jié)果（表7）。通過相似度評價(jià)分析，發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地沒食子的圖譜基本沒有差異，大多數(shù)沒食子藥材的相似度均為大于0.900，唯有土耳其的沒食子藥材的相似度為0.883。

表7 不同產(chǎn)地沒食子藥材指紋圖譜相似度分析Tab.7 Similarity evaluation of the gall ofQ.infectoriaof different regions

2.7 聚類分析

將8個(gè)不同產(chǎn)地沒食子進(jìn)行聚類分析（圖4）。圖4結(jié)果表明：8個(gè)不同產(chǎn)地的沒食子樣品被分為2個(gè)集群，土耳其（S2）被分為一個(gè)集群，其余7個(gè)產(chǎn)地的沒食子藥材是一個(gè)集群。

圖4 不同產(chǎn)地沒食子的聚類分析樹狀圖Fig.4 The HCA of the gall ofQ.infectoriaof different regions

3 討論

本研究考察了加熱回流法、超聲提取法和煎煮法，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：煎煮法的可控性很差，但煎煮法可適用于大量提取。超聲提取沒有加熱回流提取的收率高；同時(shí)對提取溶劑甲醇、乙醇和水也進(jìn)行了考察，其浸膏得率基本沒有差異，RSD%＜2.0。考慮到經(jīng)濟(jì)，安全的因素，最終選擇以水為提取溶劑，加熱回流提取的方法。

本研究嘗試多種流動(dòng)相體系，甲醇-水，甲醇-0.2%甲酸水，乙腈-水，乙腈-0.2%甲酸水體系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，酸水體系比純水體系具有更好的峰形和分離度。酸的濃度過高，會影響峰的形狀以及分離的效果。因此，最終確定甲醇-0.2%甲酸水作為流動(dòng)相洗脫體系。

不同產(chǎn)地沒食子藥材指紋圖譜中的相似度結(jié)果表明：7個(gè)不同產(chǎn)地沒食子藥材的指紋圖譜相似度均大于0.900，只有土耳其的沒食子藥材的相似度為0.883。這種在共性特征基礎(chǔ)上存在的個(gè)體差異是因?yàn)樗幉某墒爝^程中受到土壤、氣候、環(huán)境等因素及采收加工過程中諸多因素的影響[14]。除此之外，聚類分析也被用來評估不同產(chǎn)地的沒食子的差異。聚類分析通過分層聚類和迭代聚類來發(fā)現(xiàn)集群類的觀測數(shù)據(jù)[15]。聚類分析通過將集群分離，合并的過程，直到所有的觀測數(shù)據(jù)被分為一類[16]。土耳其的沒食子被分為一個(gè)集群，可能是因?yàn)樵跊]食子生長過程中，受到一些外界因素的影響。其他7個(gè)產(chǎn)地的沒食子是一個(gè)集群，是因?yàn)樗鼈冎g有很高的相似度，通過HCA分析，8個(gè)不同產(chǎn)地的樣本之間的關(guān)系被呈現(xiàn)的較為清楚。

綜上所述，本研究建立的LC-MS指紋圖譜可以快速的分析并鑒定不同產(chǎn)地、不同批次的沒食子藥材，可以作為沒食子藥材質(zhì)量控制的參考標(biāo)準(zhǔn)。有利于控制藥材質(zhì)量，促進(jìn)藥材和制劑水平的提高，為沒食子藥材的研究開發(fā)奠定基礎(chǔ)，為富含鞣質(zhì)藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)控制提供了可借鑒的方法。

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Study on quality evaluation of the gall ofQuercus infectoriaOliv.by LC-MS fingerprint combined with quantitative analysis of multi-components by single marker

Long Fei1,2,Ma Shangzhi2,Yu Wei2,Chen Haijun2,Zhang Ke2,Chen Wen2,Han Bo2*
(1 School of Chemistry and Chemical Engineering,Shihezi University,Shihezi,Xinjiang 832002,China;2 School of Pharmacy,Shihezi University,Shihezi,Xinjiang 832002,China)

To determine the content of main components by establishing LC-MS fingerprint of the water extraction of the gall ofQuercus infectoria(Q.infectoria)from different regions.LC-MS analysis technology was used to analyze and identify the components of the gall ofQ.infectoria.A QAMS method was used to determine the content of other components,gallic acid was used as a reference.The LC-MS fingerprint obtained 14 peaks,8 main peaks were identified.There was no significant difference in the contents of 4 polyphenols of the gall ofQ.infectoriafrom 8 different regions.The similarity values of 8 batches of the gall ofQ.infectoriafrom different regions were between 0.883 and 0.944.The conclusion is that the combination of LC-MS fingerprint and QAMS can simply and rapidly evaluate the gall ofQ.infectoriaand has a high sensitivity and good repeatability.This work could provide a reference method for quality standard of tannin-rich medicinal materials.

gall of qinfectoria Oliv;fingerprints;quantitative analysis of multi-components by single marker;similarity evaluation;hierarchical cluster analysis

R384

A

10.13880/j.cnki.65-1174/n.2017.04.015

1007-7383(2017)04-0479-07

2017-03-02

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目 (81560699)，新疆兵團(tuán)科技攻關(guān)與成果轉(zhuǎn)化計(jì)劃項(xiàng)目 (2015AD002)

龍飛 (1991-)，男，碩士研究生，專業(yè)方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物提取分離。

*通信作者：韓博 (1982-)，男，副教授，從事民族藥的開發(fā)及利用研究，e-mail：524683221@qq.com。