基于熒光蛋白FRET特性DasR與效應(yīng)小分子的相互作用

魏文平，葉邦策*

（1華東理工大學生物反應(yīng)器工程國家重點實驗室，上海，200237；2石河子大學化學和化學工程學院，新疆 石河子，832003）

基于熒光蛋白FRET特性DasR與效應(yīng)小分子的相互作用

魏文平，葉邦策1,2*

（1華東理工大學生物反應(yīng)器工程國家重點實驗室，上海，200237；2石河子大學化學和化學工程學院，新疆 石河子，832003）

本研究利用黃色熒光蛋白（YFP）和青色熒光蛋白（CFP）構(gòu)建含有DasR蛋白的雙熒光蛋白融合蛋白，以效應(yīng)小分子與DasR作用前后導致的雙熒光蛋白FRET效應(yīng)變化為指標考察DasR與效應(yīng)小分子的相互作用。研究結(jié)果表明：效應(yīng)小分子與DasR的相互作用可以通過熒光蛋白FRET特性有效的呈現(xiàn)；該熒光蛋白系統(tǒng)能夠反映出單獨的DasR小分子結(jié)合結(jié)構(gòu)域與效應(yīng)物質(zhì)的相互作用。本研究方法為研究調(diào)控蛋白與效應(yīng)小分子相互作用、調(diào)控蛋白效應(yīng)分子的高通量篩選等方面提供了理論借鑒與方法學參考。

熒光蛋白；FRET；DasR；相互作用

微生物轉(zhuǎn)錄調(diào)控在胞內(nèi)基因表達及微生物響應(yīng)環(huán)境因素變化方面發(fā)揮著重要的作用。以經(jīng)典的乳糖操作子為例，其控制的靶標基因表達由環(huán)境中效應(yīng)物相對濃度決定：當環(huán)境中不存在乳糖或者β-半乳糖苷時，阻遏蛋白結(jié)合在操縱子區(qū)，阻止RNA聚合酶在啟動子區(qū)結(jié)合；當環(huán)境中存在乳糖或者β-半乳糖苷時，產(chǎn)生的異構(gòu)乳糖與阻遏蛋白的結(jié)合，使得原本被阻遏蛋白占據(jù)的啟動子區(qū)釋放出來，從而使得RNA聚合酶行使功能，乳糖利用相關(guān)酶系表達[1-2]。這種轉(zhuǎn)錄水平的操縱子模型在微生物中廣泛存在。其中在放線菌中廣泛存在一類幾丁質(zhì)、N-乙酰葡萄糖胺（GlcNAc）利用調(diào)控相關(guān)的操縱子，其調(diào)控蛋白在不同菌中名稱為DasR（Streptomyces coelicolor）[3]；NagR（B.subtilis）[4]；YvoA（Bacillus subtilis）。以YvoA為例，幾丁質(zhì)、GlcNAc代謝產(chǎn)生的6-磷酸葡萄糖胺（GlcN6P）會結(jié)合到Y(jié)voA的GlcN6P結(jié)合結(jié)構(gòu)域，通過改變蛋白構(gòu)象進而影響到Y(jié)voA控制基因的轉(zhuǎn)錄水平[4]。

GlcN6P在GlcNAc代謝或者相關(guān)活性物質(zhì)合成過程中具有重要作用：無論是GlcNAc轉(zhuǎn)化成Fru6P進而進入TCA循環(huán)，還是糖代謝中間產(chǎn)物通過UDP-GlcNAc-1-P等產(chǎn)物合成肽聚糖，都會生成GlcN6P這一中間產(chǎn)物。DasR通過感知GlcN6P濃度的變化進而對相關(guān)基因的表達產(chǎn)生有效的調(diào)控作用。這種小分子物質(zhì)與調(diào)控蛋白的相互作用是關(guān)鍵小分子通過變構(gòu)調(diào)節(jié)等方式影響調(diào)控蛋白的行為，從而使細胞感知外界環(huán)境變化的基礎(chǔ)。

隨著Streptomyces coelicolorDasR蛋白晶體結(jié)構(gòu)的解析[6]，探索建立高效的DasR與效應(yīng)小分子GlcN6P的相互作用的研究方法，將有利于為放線菌中其他調(diào)控蛋白和效應(yīng)小分子的相互作用提供方法論的借鑒。供體熒光蛋白和受體熒光蛋白之間的熒光能量共振轉(zhuǎn)移（Fluorescence Resonance Energy Tansfer，F(xiàn)RET） 效 應(yīng)在研究蛋白-蛋白相互作用[7]、小分子動態(tài)檢測[8]等方面得到廣泛的應(yīng)用。本研究在本課題組前期利用熒光蛋白FRET特性構(gòu)建生物傳感器[9-10]的技術(shù)平臺基礎(chǔ)上，通過構(gòu)建含有DasR的雙熒光蛋白的融合蛋白體系，并通過FRET特性考察DasR與效應(yīng)小分子GlcN6P的相互作用。

1 材料與方法

1.1 材料

雙熒光蛋白表達質(zhì)粒PET28a-YC由本實驗室保藏；菌種 DH5α 和 BL21（DE3）、Streptomyces coelicolor等均由本實驗室保藏。

1.2 材料試劑和儀器

引物序列見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司完成；實驗中所用限制性內(nèi)切酶均購買于寶生物工程有限公司（Takara,大連，中國）；蛋白純化Ni柱購買于常州天地人和生物科技有限公司；熒光測定采用BioTek酶標儀測定（佛蒙特州，美國）；pH 7.4 PBS緩沖液購自上海百賽生物科技有限公司。菌種培養(yǎng)LB培養(yǎng)基購自上海捷瑞生物科技有限公司；GlcN6P和 GlcNAc6P 購 自 Sigma 公 司 ；Glc6PNa2、GlcN、Fru6PNa2購自索萊寶公司。

1.3 含有DasR的雙熒光蛋白體系建立

利用表1中引物（采用軟件Primer 5.0設(shè)計），取Streptomyces coelicolor基因組作為模板，按照高保真酶說明書（南京諾唯贊生物科技有限公司）指導進行PCR擴增，得到5'端含有EcoRI酶切位點及3'含有SacI酶切位點的DasR(SCO5231)片段；DasR純化后利用EcoRI和SacI酶切，然后將純化回收后的DasR片段與經(jīng)過同樣的雙酶切并經(jīng)純化的PET28a-YC在 16 ℃條件下連接 1.0 h（Takara,DNA Ligation Kit Ver.2.1）。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α，挑取陽性克隆，使用T7引物測序正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)備用。

1.4 蛋白純化

蛋白誘導表達及其純化方法來自參考文獻[9-10]。其中IPTG濃度選擇0.4 mmol/L。

1.5 蛋白與小分子相互作用測定方法

小分子溶解在pH 7.4 PBS溶液中，調(diào)整pH到7.4；蛋白經(jīng)過如方法1.4的純化步驟后，保存在pH 7.4 PBS溶液中；添加90 μL的蛋白溶液至不透明的黑色96孔板，添加小分子效應(yīng)物濃度至5 mmol/L，使用pH 7.4 PBS補加至終體積為100 μL。通過酶標儀測試激發(fā)光為430 nm，發(fā)射光在450-600 nm波長處的熒光值，每隔2 nm讀取一個數(shù)值。

1.6 數(shù)據(jù)處理

酶標儀測定的熒光數(shù)據(jù)導出后，計算在476 nm和 528 nm處的熒光值的比值R（F476/F528）；通過origin 9.0軟件繪制熒光值變化曲線圖。通過比較小分子添加前后R的變化考察小分子與DasR的相互作用。

2 實驗結(jié)果與分析

2.1 熒光蛋白FRET特性能反映小分子與DasR的相互作用

（1）存在于雙熒光蛋白之間的FRET特性受制于供體熒光蛋白和受體熒光蛋白之間相對距離的變化。假如兩熒光蛋白之間的距離在10 nm范圍內(nèi)發(fā)生足夠的變化，F(xiàn)RET特性會以比值R（F476/F528）變化的形式直觀的表現(xiàn)出來。圖1顯示：

（1）與單一YC-DasR相比，GlcN6P使得YC-DasR在476 nm處的熒光值增加，在528 nm處的熒光值減小。由于此熒光值是在CFP的激發(fā)光范圍內(nèi)得到的，所以YFP在528 nm處的熒光是通過稱為FRET效應(yīng)的以非輻射能量傳遞的方式獲得的。因此，圖1A結(jié)果說明GlcN6P加入造成的R值改變（是由于GlcN6P與YC-DasR中DasR相互作用改變了CFP與YFP相對空間距離）可以有效地研究GlcN6P與DasR的相互作用。

（2）在以往的研究中，通過EMSA實驗已經(jīng)證明DasR蛋白同源蛋白家族功能的發(fā)揮受制于GlcN6P濃度[5]。通過GlcN6P加入前后R改變及其原因分析，采用圖1B所示的示意圖可以形象的表示隨GlcN6P濃度變化引起的FRET效應(yīng)強弱變化，以此反映小分子與蛋白的相互作用。

（3）通過數(shù)據(jù)庫中（http://www.kegg.jp/ssdbbin/ssdb_motif kid=sco:SCO5231）數(shù)據(jù)分析可知：DasR蛋白N端結(jié)構(gòu)包含Crp-like helix-turn-helix domain等DNA結(jié)合相關(guān)轉(zhuǎn)錄調(diào)控結(jié)構(gòu)域；主要的小分子結(jié)合結(jié)構(gòu)域集中在C端（如圖1C）。

（4）僅含小分子結(jié)合結(jié)構(gòu)域的YcDasR88-252雙熒光蛋白體系也能響應(yīng)GlcN6P的加入（圖1D），即熒光蛋白FRET特性直觀顯示DasR與小分子的相互作用是基于C端小分子結(jié)合結(jié)構(gòu)域發(fā)生的。

（5）構(gòu)建的含有DasR的雙熒光蛋白體系可以反映DasR與GlcN6P的相互作用。

圖1 熒光蛋白FRET特性響應(yīng)DasR和小分子GlcN6P的相互作用Fig.1 FRET of YFP-CFP pair response to the interaction between DasR and small molecule GlcN6P

2.2 熒光蛋白FRET特性檢測DasR同源蛋白與效應(yīng)小分子相互作用

紅霉菌與天藍色鏈霉菌同屬放線菌，二者在形態(tài)發(fā)育、次級代謝、轉(zhuǎn)綠調(diào)控等方面具有許多相似的特征。紅霉菌中DasR的同源蛋白在KEGG中的編號為SACE_0500[11]。此蛋白在紅霉菌中發(fā)揮的調(diào)控作用已在本課題組成員的前期研究中涉及[11]，但研究中尚未涉及FRET特性能否檢測DasR同源蛋白與效應(yīng)小分子相互作用。

圖2顯示：

（1）紅霉菌中DasR同源蛋白與GlcN6P相互作用，依然可以通過測定GlcN6P的加入前后YFP和CFP特征峰處的熒光強度變化來衡量。

（2）熒光蛋白FRET特性檢測DasR同源蛋白與效應(yīng)小分子相互作用具有可推廣性。

圖2 熒光蛋白FRET特性響應(yīng)糖多孢紅霉菌DasR同源蛋白和GlcN6P的相互作用Fig.2 FRET of YFP-CFP pair response to the interaction between DasR Homologous protein fromSaccharopolyspora erythraeaand GlcN6P

2.3 熒光蛋白FRET特性對DasR的效應(yīng)小分子具有選擇性

GlcN6P作為重要的中間代謝產(chǎn)物，在微生物體內(nèi)既可以通過幾丁質(zhì)、GlcNAc代謝產(chǎn)生；又可以通過果糖6磷酸（Fru6P）轉(zhuǎn)化而來。GlcN6P在結(jié)構(gòu)上與Glc6P、GlcN、Fru6P、GlcNAc6P 等具有很高的相似性。在體內(nèi)環(huán)境中，以上物質(zhì)往往與Glc6P共存，所以DasR與主要的效應(yīng)小分子GlcN6P相互作用可能不同程度受到以上物質(zhì)的影響，為此考察YC-DasR體系對于 GlcN6P、Glc6P、GlcN、Fru6P、GlcNAc6P 響應(yīng)差異，有助于更好理解DasR與效應(yīng)小分子相互作用。

圖3顯示：

（1）YC-DasR體系對于GlcN6P的響應(yīng)最顯著，對于GlcNAc6P的響應(yīng)次之（圖3A）。這種結(jié)果說明，DasR在諸多的GlcN6P結(jié)構(gòu)類似物中能夠有效的識別GlcN6P和GlcNAc6P的存在。DasR同源蛋白YvoA與GlcN6P結(jié)構(gòu)類似物的相互作用試驗中也存在以上規(guī)律[4]。區(qū)別在于研究者在研究GlcN6P結(jié)構(gòu)類似物對YvoA的DNA結(jié)合能力的影響（即與GlcN6P結(jié)構(gòu)類似物的相互作用）時采用的技術(shù)手段為EMSA[4]。本研究結(jié)果從GlcN6P結(jié)構(gòu)類似物影響DasR及同源蛋白結(jié)構(gòu)變化的視角更加直觀的解釋了特定小分子通過特異性的結(jié)合，改變蛋白結(jié)構(gòu)；這種改變應(yīng)該是導致DasR及同源蛋白響應(yīng)特定小分子而對轉(zhuǎn)錄水平產(chǎn)生差異性調(diào)節(jié)的基礎(chǔ)。

（2）圖3B所示實驗僅以含有DasR效應(yīng)物結(jié)合結(jié)構(gòu)域的熒光蛋白體系研究相互作用。這種利用熒光蛋白FRET特性研究調(diào)控蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域與效應(yīng)物相互作用的實驗方法，是傳統(tǒng)的EMSA實驗所不能實現(xiàn)的：EMSA實驗不僅需要整個調(diào)控蛋白，而且需要操縱子區(qū)的DNA，以調(diào)控蛋白與DNA結(jié)合能力受到小分子干擾的程度來衡量小分子與蛋白的相互作用。

圖3 熒光蛋白FRET特性對不同效應(yīng)小分子的響應(yīng)Fig.3 FRET of YFP-CFP pair response to the different small molecule

2.4 FRET特性、DasR與小分子相互作用應(yīng)用前景的分析

GlcN6P除了在微生物中作為重要的中間代謝產(chǎn)物及調(diào)控效應(yīng)物質(zhì)外，在高等生物中也具有以下重要的作用：

（1）有研究考察 glucosamine(GlcN)對于胰島素抗性的影響時，添加GlcN會導致葡萄糖的吸收減少，同時伴隨著GlcN6P濃度的升高。由GlcN轉(zhuǎn)化而來的GlcN6P會變構(gòu)抑制（allosteric inhibition）己糖激酶導致糖轉(zhuǎn)運系統(tǒng)受阻[12]。

（2）在哺乳動物細胞中，谷氨酰胺：6-磷酸果糖酰胺轉(zhuǎn)移酶（Glutamine-fructose-6-phosphate aminotransferase，GFAT）作為己糖胺途徑的限速酶（其作用產(chǎn)物就是GlcN6P），直接影響己糖胺途徑的活力[13-14]。鑒于GlcN6P的重要作用，如果能在體內(nèi)實時高效的檢測GlcN6P，將有助于GFAT酶活性等方面的研究，而且研究DasR與GlcN6P的相互作用可能為建立基于FRET效應(yīng)的GlcN6P檢測生物傳感器積累經(jīng)驗。

3 結(jié)論

（1）本實驗基于熒光蛋白 FRET特性研究了DasR與效應(yīng)小分子的相互作用，發(fā)現(xiàn)熒光蛋白FRET特性可以較好地甄別調(diào)控蛋白DasR的特定效應(yīng)物，有望在其他調(diào)控蛋白與小分子相互作用研究方面得到應(yīng)用。

（2）本實驗構(gòu)建的相互作用考察體系，只需要酶標儀讀取熒光便可以篩選特定的效應(yīng)物，有望實現(xiàn)蛋白和效應(yīng)小分子匹配的高通量篩選。

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Studying the interaction between DasR and its effector based on the FRET of bimolecular fluorescence protein

Wei Wenping1,Ye Bangce1,2*
(State Key Laboratory of Bioreactor Engineering,East China University of Science&Technology,Shanghai 200237,China;School of Chemistry and Chemical Engineering,Shihezi University,Shihezi,Xinjiang 832003,China)

In this study,interaction between DasR and its effector was investigated by using FRET effect change of the fusion protein,which included YFP,CFP and DasR.Results have shown that FRET features of fluorescent protein can effectively response to the interaction of small molecules and DasR.At the same time,the fluorescent protein system can reflect the interaction of effector and individual small molecules combining structural domain of DasR.This research provides the theory and methodological reference for the studying of interaction between regulation protein and smaller molecular,and effector high-throughput screening of regulation protein

fluorescence protein;FRET;DasR;interaction

Q3

A

10.13880/j.cnki.65-1174/n.2017.04.001

1007-7383(2017)04-0397-05

2017-01-09

國家自然科學基金項目（21335003，21675052，21575089）

魏文平(1988-)，男，博士研究生，專業(yè)方向為生物化工。

*通信作者：葉邦策(1967-)，教授，長江學者，e-mail：bcye@ecust.edu.cn 。