不同果齡羅漢果中甜苷含量分布研究

劉 雯，王志宏，楊裴慶，崔麗杰，李珊珊，李桂銀，周治德

(桂林電子科技大學(xué) 生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院， 廣西 桂林 541004)

不同果齡羅漢果中甜苷含量分布研究

劉 雯，王志宏，楊裴慶，崔麗杰，李珊珊，李桂銀，周治德*

(桂林電子科技大學(xué) 生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院， 廣西 桂林 541004)

目的： 研究不同果齡羅漢果中甜苷IV、甜苷V的檢測方法及含量分布。方法： 以不同果齡羅漢果鮮果為原材料，采用超聲波輔助提取，D101大孔樹脂吸附純化，得到羅漢果中甜苷提取液；采用HPLC法對羅漢果甜苷提取液進(jìn)行含量測定，得到不同果齡羅漢果的甜苷IV、甜苷V含量數(shù)值。結(jié)果： 采用HPLC法檢測羅漢果甜苷提取液，甜苷IV、甜苷V吸收峰能明顯分開，并且具有可讀性；羅漢果甜苷IV的含量從30天到50天呈遞增趨勢，在50天之后含量驟減，70天以后苷IV的含量極低。羅漢果甜苷 V 含量在30 天到70天不斷增加，而在70天之后，苷V的含量趨于穩(wěn)定。結(jié)論：HPLC法能同時檢測出羅漢果苷IV、苷V含量，得到了不同果齡羅漢果中甜苷IV、甜苷V含量分布規(guī)律。

果齡；羅漢果苷 IV；羅漢果苷V；含量

羅漢果(Siraitia grosvenorii)的果味甘性涼，有止咳化啖、清熱潤肺、潤腸通便的功效，生活中常用于降肺火止咳，緩解咽喉失音，緩解腸燥便秘等癥，是清涼飲料的佳品。以廣西桂林產(chǎn)的羅漢果最出名，享譽著“東方神果”、“神仙果”的稱號。李俊等人[1]的研究發(fā)現(xiàn)，羅漢果有2個多糖，經(jīng)檢測分析分為SGPS1和SGPS2。羅漢果中黃酮具有抑菌作用、抗氧化和平滑血管等功效有來源于黃酮類物質(zhì)[2]。陳全斌等人[3]利用RP-HPLC法，證實羅漢果有黃酮苷元山奈酚成分，發(fā)現(xiàn)含有黃酮苷元槲皮素[4]。葫蘆烷三萜類化合物具有該類骨架的化合物大多具有廣泛的生物活性,諸如抗腫瘤、消炎抗菌等[5]。研究表明這類化合物是羅漢果的主要有效成分，它們在羅漢果干果中的總含量為3.75%-3.85%。其中mogroside V是主要甜味成分。日本人竹本常松等從干燥果實中分離得到如賽門苷Ⅰ( sianenosideⅠ)、羅漢果苷ⅡE(mogrosideⅡE) 、羅漢果苷Ⅲ (mogrosideⅢ) 、羅漢果苷 ⅢE(mogrosideⅢE)、羅漢果苷Ⅳ(mogrosideⅣ)、羅漢果苷Ⅴ(mogrosideⅤ) 等葫蘆烷三萜苷類化合物[6]。羅漢果具有糖尿病防治作用、防齲齒作用、抗炎癥的作用[7-10]，其有效成分被用來做成消炎止痛藥并投入市場。有祛痰作用、增加免疫細(xì)胞的數(shù)量、保肝降酶作用[11-12]；近期有報道稱羅漢果苷Ⅳ有預(yù)防治療丙肝作用。

本研究以不同果齡的羅漢果為原料，采用超聲波輔助水提，D101大孔樹脂吸附，以羅漢果的苷IV、苷V含量為指標(biāo)，采用HPLC法為檢測方法，探索不同果齡羅漢果中甜苷含量分布規(guī)律，為羅漢果種植技術(shù)服務(wù)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器

Water HPLC 515高效液相色譜儀 美國沃特斯公司；40*500mm層析柱 上海禾汽玻璃儀器有限公司；D101大孔樹脂 滄州寶恩斯吸附材料科技有限公司；SB-5200D超聲波清洗機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；DLS-1高速組織搗碎機(jī) 上海標(biāo)本模型廠。

1.2 材料與試劑

羅漢果鮮果，桂林永福縣基地，青毛果；羅漢果甜苷Ⅳ標(biāo)準(zhǔn)品≥98%，羅漢果甜苷Ⅴ標(biāo)準(zhǔn)品≥98%，成都百盈生物科技有限公司；乙腈色譜純美國TEDIA進(jìn)口試劑；鹽酸、氫氧化鈉、氫氧化鈣、甲醇都為AR 西隴化工股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 羅漢果甜苷提取步驟

羅漢果鮮果→搗碎→粗提取→過濾除渣→大孔吸附樹脂分離→減壓濃縮→干燥制粉

1.3.2 提取要點

取新鮮羅漢果2個，搗碎，以固液比1:2加入60%乙醇后置于超聲波儀器中，超聲30min后取出，冷卻過濾，取濾液；相同法提取3次，合并3次濾液。往濾液中加入15%鮮果重量濃度為10%的 Ca(OH)2懸濁液，絮凝；用離心機(jī)以2500r/min的離心15min，抽濾得到羅漢果提取液。將提取液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至浸膏，烘干。取一定的粉末，用甲醇定容至10mL，用HPLC測定羅漢果甜苷的含量，計算羅漢果甜苷的提取率。

1.3.3 D101大孔樹脂吸附

上柱，將羅漢果提取液調(diào)pH值在9以下，上樣速度為2BV/h，柱體積為200mL；用蒸餾水進(jìn)行清洗直到流出液為澄清透明狀；用65%乙醇進(jìn)行洗脫，收集洗脫液500mL，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮。

1.3.4 羅漢果甜苷的含量測定，采用高效液相色譜法

1.3.4.1 標(biāo)準(zhǔn)品液制備

精密稱取羅漢果苷Ⅳ對照品3.0mg和苷Ⅴ對照品8.2mg，用甲醇定容到10mL，超聲波處理 20min，用微孔濾膜對溶液進(jìn)行過濾。取上清液用高效液相色譜測定。為防止羅漢果不同甜苷之間的干擾，取適量對照品配好的標(biāo)準(zhǔn)液混合進(jìn)樣，觀察其圖譜。

1.3.4.2 樣品液制備

分別取不同果齡的羅漢果即30、35、 50、55、60、65、70、75、85、90 天羅漢果鮮果各2個，搗碎置于燒杯中，提取制得甜苷品。稱重，用高效液相色譜儀測定其苷Ⅳ和苷Ⅴ的含量。

1.3.4.3 色譜柱條件[13]

C18反相(4.6 mm×150 mm)、乙腈-水溶液 21:79、檢測波長設(shè)為203nm、流速1mL/min 、柱溫 25℃、進(jìn)樣量10ul、跑柱30min

2 結(jié)果與分析

2.1 確定羅漢果甜苷的最佳檢測波長,為203nm

先對羅漢果甜苷IV和甜苷V的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行HPLC檢測，確定相應(yīng)的出峰時間，從而推算樣品的甜苷含量。確定流動相比例為乙腈:水=21:79，此時羅漢果的苷IV峰與苷V峰能明顯拉開，并且與其他雜質(zhì)峰不至于混在一起。由羅漢果苷V標(biāo)準(zhǔn)品圖譜可以看出峰保留時間大概是7.8min，峰面積為2465292。由羅漢果苷IV標(biāo)準(zhǔn)品圖譜可以看出峰保留時間大概是17min, 峰面積為1031910。 苷V的S標(biāo)=2465292，M標(biāo)=8.2mg，W標(biāo)=98.56%； 苷IV的S標(biāo)=1031910，M標(biāo)=3.0mg，W標(biāo)=98.79%。圖1為羅漢果甙IV+甙V的3D圖譜，圖2為羅漢果苷Ⅳ和苷 V 標(biāo)準(zhǔn)品混合進(jìn)樣 HPLC 圖譜。根據(jù)3D圖譜可以看出，甜苷的峰在檢測波長為203nm出現(xiàn)最高，因此確定甜苷的最佳檢測波長為203nm。

圖1 羅漢果甙IV+甙V的3D圖譜

圖2 羅漢果苷Ⅳ和苷 V 標(biāo)準(zhǔn)品混合進(jìn)樣 HPLC 圖譜

2.2 羅漢果的提取實驗結(jié)果

(1)以50天果齡的羅漢果為原料進(jìn)行提取，D101大孔樹脂吸附，結(jié)果如下：超聲波平均提取率為2.20%，甜苷V平均提取率為0.22%，甜苷IV平均提取率為0.0307。將羅漢果提取液過D101大孔樹脂吸附，檢測前后羅漢果苷V以及苷IV的含量，結(jié)果見表1。

表1 羅漢果甜甙經(jīng)過D101樹脂的含量

由表1數(shù)據(jù)可知，通過優(yōu)化后的工藝，樹脂 D101 對羅漢果甜苷有較好的分離效果，通過提取能得到甜苷 V 含量為 20%左右的羅漢果甜苷粉，苷IV的含量很低，但是也起到了一定的提純作用。

(2) 將30、35、 50、55、60、65、70、75、85、90 天羅漢果鮮果提取物用HPLC進(jìn)行檢測，部分圖譜如下。

圖3 30 天果齡羅漢果甜苷粉 HPLC 圖譜

圖4 50 天果齡羅漢果甜苷粉 HPLC 圖譜

圖5 70天果齡羅漢果甜苷粉 HPLC 圖譜

圖6 90天果齡羅漢果甜苷粉 HPLC 圖譜

整理圖譜對應(yīng)的數(shù)據(jù)得到表2。

表2 不同果齡羅漢果皂苷含量表

表2結(jié)果表明，羅漢果甜苷 V含量從30 天到70天不斷增加，而在70天之后，苷V的含量趨于穩(wěn)定；甜苷IV的含量從30天到50天呈遞增趨勢，在50天之后苷IV含量驟減，70天以后苷IV的含量很低。

4 結(jié)論

(1)通過HPLC的檢測方法,采用C18反相(4. 6 mm×150 mm)、乙腈-水溶液 21:79、波長為203nm，流速1mL/min 、柱溫 25℃、進(jìn)樣量10?L、跑柱30min，將羅漢果提取液中甜苷IV、甜苷V吸收峰能明顯分開，實現(xiàn)同步檢測羅漢果甜苷IV、甜苷V。

(2)羅漢果甜苷,V 隨著羅漢果果齡的增加而出現(xiàn)增加的趨勢，并且在70天后含量趨于穩(wěn)定；羅漢果甜苷IV的含量在30天到50天的坐果中出現(xiàn)顯著提升，在50天之后含量驟減；說明羅漢果苷IV的形成是在50天果齡之前，在50天之后可能轉(zhuǎn)變成其他甜苷。

[1] 梁 靜,劉曉宇,雷小丹.廣西特色資源-羅漢果研究現(xiàn)狀與展望[J].農(nóng)產(chǎn)品加工(學(xué)刊), 2010, 6(7): 70-72.

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(本文文獻(xiàn)格式：劉 雯，王志宏，楊裴慶，等.不同果齡羅漢果中甜苷含量分布研究[J].山東化工，2017，46(12)：12-15，17.)

The Research to Different Fruit Age ofMogrosides in Distribution and Separation

LiuWen,WangZhihong,YangPeiqing,CuiLijie,LiShanshan，LiGuiyin，ZhouZhide*

(School of Life and Environmental Sciences of Guilin University of Electronic Technology , Guilin 541004,China)

Objective Study of the test method and content distribution of Mogroside IV and Mogroside V from different fruit age of Momordica grosvenori. Methohd By means of ultrasonic assisted extraction and the D101 macroporous adsorption resin extract mogroside from different fruit age of Momordica grosvenori. Mogrosides is determined by HPLC method including the content of Mogroside IV and Mogroside V. Results Mogrosides is tested by HPLC method. It's easy to apart from the figure between Mogroside IV and Mogroside V. The content of Mogroside IV is increasing from the age of 30 days to 50 days ,decreasing after 50 days ,and hitting the minimum after 70 days. The content of Mogroside V is increasing from the age of 30 days to 70 days and maintaining after the age of 70 days. Conclusion The method of HPLC can test the content of Mogroside IV and Mogroside V at the same time and figure out regularities of distribution between Mogroside IV and Mogroside V from different fruit age of Momordica grosvenori.

fruit age; mogroside IV ; mogroside V; content

2017-04-22

廣西科技廳項目(桂科重1598005-3，2016GXNSFAA380011)，大學(xué)生創(chuàng)新項目(C66JWA24SM16)

劉 雯(1995-)，女，研究方向：植物提取；通信作者：周治德(1971—)，高工，研究方向：植物提取與知識產(chǎn)權(quán)。

O657.7

A

1008-021X(2017)12-0012-04