響應(yīng)面法優(yōu)化氨氮降解菌凈化高原地區(qū)污水的研究

王 博,王 虹,歐陽(yáng)曉芳,李 格

（青海大學(xué)化工學(xué)院， 青海 西寧 810016）

0 引言

隨著我國(guó)現(xiàn)代化進(jìn)程的加快和人民生活水平的日益提高，城市生活污水排放量不斷增加，水體富營(yíng)養(yǎng)化現(xiàn)象日益加劇。水體中的氨氮能引起水質(zhì)惡化，造成多種危害[1]，并對(duì)污水的處理及回用造成嚴(yán)重影響，尋求經(jīng)濟(jì)高效的的氨氮去除方法對(duì)人類生產(chǎn)生活具有重要意義。氨氮去除方法主要包括物理法、化學(xué)法、生物法等，其中生物脫氮技術(shù)備受關(guān)注。生物脫氮利用從自然界中獲得的有益微生物降低氨氮，具有處理成本低、容易操作、無二次污染、處理效果較好等優(yōu)點(diǎn)[2]。

青海省地處青藏高原東北部，高原大陸性氣候，冬季嚴(yán)寒而漫長(zhǎng)，晝夜溫差大，全省各地年平均氣溫在-4.1 ～ 10.3℃之間[3]，由于其高寒缺氧的地域特征，城市污水處理系統(tǒng)冬季運(yùn)行較為困難。本試驗(yàn)從大通河南岸污染水源中篩選出氨氮降解菌，研究在污水體系中的最佳降解條件。本研究針對(duì)高原地區(qū)特殊的氣候條件，發(fā)揮優(yōu)勢(shì)菌的處理效果，適應(yīng)復(fù)雜的自然水體，對(duì)城市生活污水凈化的起到優(yōu)異的效果，其結(jié)果不僅為高原地區(qū)污水凈化的進(jìn)一步研究提供理論依據(jù)，還可結(jié)合馴化、誘變等生物技術(shù)，提高特殊環(huán)境中目標(biāo)菌株的降解效率。

1 材料與方法

1.1 材料

菌種篩選分離樣品來源于西寧市大通河南岸污染水源，廢水體系引用樣品來源于西寧市第三污水處理廠；菌種活化培養(yǎng)基[4]，LB液體培養(yǎng)基、LB固體培養(yǎng)基[5]。

1.2 方法

1.2.1 氨氮降解菌的生長(zhǎng)特性

接3-4環(huán)氨氮降解菌于50 mL LB液體培養(yǎng)基中，于25℃，160 r/min搖床下培養(yǎng)，每間隔12 h用紫外可見分光光度計(jì)測(cè)定菌液在600 nm下的OD值，記錄OD值隨時(shí)間的變化；同時(shí)采用血球計(jì)數(shù)板法記錄菌數(shù)隨時(shí)間的變化；在不同階段，取一定量的菌液降解水樣中氨氮，得到各階段菌液對(duì)水中氨氮降解的能力。最后在同一圖中繪制這3個(gè)量隨時(shí)間的變化曲線，確定在該條件下氨氮降解菌降解能力最高所對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)時(shí)間。

1.2.2 降解條件的單因素試驗(yàn)

取水樣50 mL于試管中，分別取接種量為1%，5%，10%，15%，20%，25%，30%的菌液， 降解時(shí)間為12，24，36，48，60，72，84 h 和調(diào)節(jié) pH 值為 7，8，9，10，11，12，13，在25℃，160 r/min條件下進(jìn)行單因素試驗(yàn)，采用納氏試劑法[6]測(cè)出各錐形瓶以及加入等量菌液的空白試驗(yàn)的氨氮濃度，確定氨氮降解菌在水樣中氨氮降解的最佳條件。

1.2.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

在確定單因素降解條件的基礎(chǔ)上，選擇接種量、降解時(shí)間、pH值3個(gè)因素，利用Box-Behnken設(shè)計(jì)3因素3水平的響應(yīng)面試驗(yàn)，見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)的因素水平及編碼

1.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

在響應(yīng)面試驗(yàn)確定的最佳降解條件基礎(chǔ)上做3個(gè)平行試驗(yàn)，結(jié)果取平均值，并與響應(yīng)面預(yù)測(cè)值進(jìn)行比較以驗(yàn)證模型可靠性，從而得出最終優(yōu)化結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 氨氮降解菌的生長(zhǎng)特性分析

以時(shí)間為橫坐標(biāo)，600 nm下的OD值、生物量、氨氮降解率為縱坐標(biāo)繪制的氨氮降解菌的生長(zhǎng)特性曲線見圖1。

圖1 氨氮降解菌生長(zhǎng)特性

由圖1可見，在LB液體培養(yǎng)基中，OD值到84 h仍未出現(xiàn)明顯下降，接種60～72 h，生物量趨于平穩(wěn)。比較生長(zhǎng)曲線與氨氮降解率曲線法線，菌株降解氨氮最快的時(shí)間在穩(wěn)定期的60～72 h，培養(yǎng)至72 h之后降解率有所降低。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 接種量對(duì)氨氮降解菌降解效率的影響

在pH值為7的50 mL生活污水中，分別取體積比 1%，5%，10%，15%，20%，25%，30%的菌液，設(shè)3組平行，25℃，160 r/min搖床降解60 h，測(cè)定氨氮降解率。結(jié)果表明，接種量在低于10%時(shí)，隨菌量增加，氨氮降解率隨之升高；在接種量為10%時(shí)，水樣中氨氮降解率達(dá)到高，為73.38%，見圖2。

2.2.2 降解時(shí)間對(duì)氨氮降解菌降解效率的影響

在pH值為7的50 mL生活污水中，接入10%的菌液，設(shè)置3組平行試驗(yàn)，25℃，160 r/min搖床分別降解 12，24，36，48，60，72，84 h。在時(shí)間到達(dá)后，測(cè)定氨氮降解率。結(jié)果表明，菌株對(duì)氨氮的降解率隨著時(shí)間的延長(zhǎng)明顯提高，在60 h達(dá)到最佳的氨氮降解率，為 79.46%，見圖2。

2.2.3 pH值對(duì)氨氮降解菌降解效率的影響

在50 mL生活污水中，接入10%的菌液，分別調(diào)節(jié) pH 值為 5，6，7，8，9，10，11，設(shè)置 3 組平行試驗(yàn)（水樣初始pH值接近7），25℃，160 r/min搖床降解60 h，測(cè)定氨氮降解率。結(jié)果表明，菌株在pH值為8時(shí)對(duì)氨氮的降解率達(dá)到最高，為82.24%，見圖2。

圖2 接種量，pH值，降解時(shí)間對(duì)菌株氨氮去除的影響

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 結(jié)果的統(tǒng)計(jì)分析和回歸數(shù)學(xué)模型的建立

利用 Box-Behnken Design（BBD）設(shè)計(jì) 3因素 3水平共17個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的試驗(yàn)方案，運(yùn)用Design Expert 8.0對(duì)BBD響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析[7]，見表2。

表2 Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)回歸分析

運(yùn)用Design-Expert軟件，按表2中的試驗(yàn)數(shù)據(jù)擬合得到三元二次回歸方程：

響應(yīng)值降解率 =-3.57899+0.032107A+0.068459B+0.561 13C+1.666 67 × 10-6AB+1.500 00 × 10-5AC-5.81250 × 10-4BC-1.42620 × 10-3A2-5.0875 × 10-4B2-0.034 180C2

單因素效應(yīng)分析：令回歸方程中的3個(gè)未知數(shù)中的2個(gè)固定于0水平，對(duì)數(shù)學(xué)模型進(jìn)行分析得到以其中1個(gè)因素為決策變量的偏回歸模型[8]：

響應(yīng)值降解率A=-3.578 99+0.032 107A-1.426 20 × 10-3A2

響應(yīng)值降解率B=-3.578 99+0.068 459B-5.087 15 × 10-4B2

響應(yīng)值降解率C=-3.578 99+0.561 13C-0.034 180C2

上述3個(gè)方程的二次項(xiàng)系數(shù)均為負(fù)值，說明其表征的拋物線都開口向下，因此，3個(gè)因素取值均存在最佳值，過大或過小均會(huì)使響應(yīng)值降低。

對(duì)方程模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3、表4。

表3 方差分析表

根據(jù)概率P值越小影響越顯著的原理 (P＜0.1為高度顯著，P＜ 0.05 為顯著，P＞ 0.05 為不顯著），由表3方差分析，可知模型極其顯著，可信度較高；在模型中，單因素 A，B，C 和二次項(xiàng)A2，B2，C2（P＜ 0.05）均對(duì)模型影響顯著。 模型失擬率為 0.410 0（＞ 0.05），表明失擬不顯著，故可以用此模型對(duì)不同條件下的氨氮降解率進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。

表4 回歸模型方差分析

由表4可以得出，模型的相關(guān)系數(shù)R2=0.989 7說明模型可以解釋98.97%的試驗(yàn)所得降解率。校正系數(shù)RAdj2=97.65%與相關(guān)系數(shù)接近，只有2.35%的降解率總變異不能用此模型解釋。變異系數(shù)CV=1.05%＜10%，說明模型能很好地反映真實(shí)的試驗(yàn)值，即試驗(yàn)的可靠性較高。

2.3.2 因素間交互作用的分析

為了進(jìn)一步研究相關(guān)變量之間的交互作用和確定最優(yōu)點(diǎn)，通過軟件做接種量、pH值、降解時(shí)間3個(gè)主要影響因素對(duì)氨氮降解水平交互影響的等高線及響應(yīng)面立體分析圖，見圖3。由等高線圖可以直觀地反映出2變量交互作用的顯著程度，圓形表示2因素交互作用不顯著，橢圓形表示2因素交互作用顯著[9]。由圖3可以看出AC，BC交叉項(xiàng)的交互作用對(duì)響應(yīng)值氨氮降解率的影響顯著。

圖3 接種量與pH值，接種量和降解時(shí)間，pH值和降解時(shí)間影響氨氮降解效率的等高線圖及響應(yīng)面

2.3.3 響應(yīng)面分析最佳應(yīng)用條件的確定

從響應(yīng)面分析得到降解條件最優(yōu)組合及氨氮降解率的預(yù)測(cè)最大值見表5。

表5 最優(yōu)組合與最大值

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

按照上面的試驗(yàn)結(jié)果，采用生活污水體系，以氨氮降解菌接種量為 11.33%、降解時(shí)間為 62.92 h，pH值為7.68的應(yīng)用條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果為：91.21% ，89.96% ，90.29% ，89.99% ， 其 平 均 值 為90.36%與最大響應(yīng)值的預(yù)測(cè)值基本一致，表明該模型能很好地預(yù)測(cè)實(shí)際降解情況。

3 結(jié)論與展望

本試驗(yàn)對(duì)大通河南岸污染水源篩選分離出氨氮去除率較高優(yōu)勢(shì)菌株進(jìn)行生長(zhǎng)特性曲線研究，確定菌液氨氮降解能力最高所對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)時(shí)間為60～72 h；通過單因素試驗(yàn)，確定菌株在接種量10%，降解時(shí)間為60 h，pH 值為8時(shí)降解率最高，為82.24%；利用Box-Behnken設(shè)計(jì)原理，設(shè)計(jì)3因素3水平的響應(yīng)面試驗(yàn)，分析接種量、pH值、降解時(shí)間3個(gè)因素對(duì)降解條件的影響，得到最佳凈化的應(yīng)用條件組合：接種量 11.33%、降解時(shí)間為 62.92 h，pH 值為 7.68，菌株對(duì)廢水中氨氮的降解率預(yù)測(cè)最大值為91.03%，由響應(yīng)面方差分析可知，降解模型顯著，接種量、降解時(shí)間、pH值對(duì)降解率影響顯著，且3因素交互作用對(duì)響應(yīng)值有一定影響。按照最佳應(yīng)用條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，得到驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果平均值為90.36%，與最大響應(yīng)值的預(yù)測(cè)值基本一致，且比單因素研究條件下提高了8.12%，試驗(yàn)表明響應(yīng)面法對(duì)氨氮降解菌在高原環(huán)境中降解污水條件的優(yōu)化合理可行，研究結(jié)果為高原環(huán)境微生物凈化生活污水應(yīng)用提供理論依據(jù)。在后續(xù)的研究中可運(yùn)用研究所得模型與實(shí)際污水處理系統(tǒng)相結(jié)合，最大程度去除污水中氨氮，實(shí)現(xiàn)污水的生態(tài)良性演化。