植物非編碼RNA與抗蟲防御反應的研究及應用*

毛穎波 陳殿陽,2 陳曉亞**

1 中國科學院上海生命科學研究院 植物生理生態(tài)研究所植物分子遺傳國家重點實驗室上海 200032

2 中國科學院大學 北京 100049

植物非編碼RNA與抗蟲防御反應的研究及應用*

毛穎波1陳殿陽1,2陳曉亞1**

1 中國科學院上海生命科學研究院 植物生理生態(tài)研究所植物分子遺傳國家重點實驗室上海 200032

2 中國科學院大學 北京 100049

非編碼 RNA 參與了多種重要的生命進程，是當今研究的熱點領域。在植物中，非編碼 RNA 除了參與維持基因組的穩(wěn)定，還在生長、發(fā)育、逆境脅迫反應等過程中發(fā)揮重要作用。RNA 干擾（RNA interference，RNAi）是指由 RNA 觸發(fā)的相應基因的表達抑制，是非編碼 RNA 調控基因表達的一種重要的作用方式，自發(fā)現以來已逐漸發(fā)展為遺傳分析、疾病治療以及植物保護等方面的有效的新技術。文章重點介紹了微 RNA（microRNA，miRNA）在植物抗蟲防御中的生物學功能，siRNA 對植物防御記憶的影響以及 RNAi 對植物防御信號途徑的調節(jié)作用，同時闡述了 RNAi 在提高農作物抗蟲性上的應用并展望了未來植物非編碼 RNA 的研究方向。

非編碼 RNA，微 RNA（miRNA），RNA干擾（RNAi），抗蟲

DOI10.16418/j.issn.1000-3045.2017.08.002

非編碼 RNA 是生物體內存在的一類不編碼蛋白質的 RNA。人們曾經認為，信使 RNA（mRNA）必須翻譯成蛋白才能行使功能，而其他不編碼蛋白的 RNA 主要是輔助 mRNA 的翻譯（tRNA 和 rRNA）和成熟（snRNA）。隨著生命科學研究的深入和基因測序技術的快速發(fā)展，人們發(fā)現細胞中還存在大量的具有不同功能或功能未知的非編碼 RNA。20 世紀 90 年代，研究發(fā)現線蟲的 lin-4 基因編碼一個 22 nt 的 RNA，與 lin-14 的 3’ 非翻譯區(qū)（untranslated region，UTR）通過堿基配對的方式結合，抑制后者的蛋白翻譯，由此調控 lin-14 的表達[1]。差不多同時，植物學家發(fā)現了基因共抑制現象（co-suppression）[2]。在矮牽牛中用 35S 啟動子過量表達查爾酮合酶（chalcone synthase, CHS）基因，不僅沒有增加 CHS 轉錄本，反而導致其轉錄水平大幅降低并積累大量降解的 mRNA 片段[2]。共抑制的一個顯著特點為內源和外源轉入的基因轉錄本都顯著減少，因此又被稱為轉錄后基因沉默（post-transcriptional gene silencing，PTGS）。1998 年，Waterhouse 等[3]發(fā)現受病毒感染的植物能產生與病毒基因組同源的正義和反義 RNAs，介導病毒 RNA 迅速降解從而有效地抵御病毒侵染，因此雙鏈 RNA 分子（dsRNA）能夠觸發(fā)植物 PTGS。同年，人們在對線蟲的研究中發(fā)現了 RNA 干擾（RNA interference，RNAi），即外源添加的 dsRNA 能夠引發(fā)線蟲相應基因的沉默[4]。這兩項獨立的發(fā)現揭示了非編碼 RNA 通過 RNAi 調控基因表達是真核生物中普遍存在的現象。此后 RNAi 被迅速發(fā)展成為遺傳分析、疾病治療以及植物保護等方面的有效新技術。在農業(yè)上，Bt 轉基因技術對鱗翅目害蟲的控制效果顯著。然而這一技術也有它的局限，很多刺吸式昆蟲包括蚜蟲、飛虱等對 Bt 毒素不敏感，并且隨著 Bt 作物的廣泛種植，田間已出現對 Bt 產生抗性的昆蟲。基于 RNAi 的抗蟲技術廣泛適用于包括刺吸式在內的多種昆蟲，彌補了 Bt 轉基因技術的不足之處，有望成為新一代控制蟲害的主要手段之一。

1 非編碼 RNA 在植物抗蟲防御反應中的作用

植物固著生長，不能自由移動，因此需要對周圍的各種脅迫環(huán)境如干旱、土壤鹽分、極端氣溫以及病蟲害等具有更高的耐受力與適應性。研究發(fā)現內源非編碼 RNA 在植物對病毒防御機制中發(fā)揮重要的作用[5]，在逆境和抗病反應中擔當重要角色[6,7]。以擬南芥為例，miRNA398 對植物多種逆境反應具有直接的調控作用，包括氧化應激反應、水分虧缺、鹽脅迫以及脫落酸（ABA）響應等[8]。miR393 通過對生長素信號途徑促進植物對病原菌的抗性[9]；有趣的是，miR393 的互補鏈（miR393b*）在體內也存在靶基因（MEMB12）；在擬南芥受到丁香假單胞菌（Pseudomonas syringae）侵染時，AGO2 作為 RNA 沉默系統(tǒng)的重要組分被顯著誘導，通過結合 miR393b* 抑制 MEMB12 的表達，從而抵御病原菌的侵染[10]。此外，非編碼 RNA 在植物對昆蟲的防御過程中也扮演著舉足輕重的角色。

1.1 RNAi 對植物防御信號途徑的調節(jié)作用

茉莉素（JA）、乙烯（ET）、脫落酸（ABA）和水楊酸（SA）是植物中重要的防御激素，它們幫助植物適應生物和非生物脅迫等不良環(huán)境。JA 誘導植物對植食性昆蟲的防御反應，植物在受到昆蟲取食后，JA 信號途徑被迅速激活，激活防御基因表達，導致具有抗蟲活性的植保素的合成與積累[11]。除 JA 外，ET 也參與植物抗蟲途徑的調控。ET 途徑受阻使得漸狹葉煙草（Nicotiana attenuata）對煙草天蛾（Manduca sexta）以及玉米（Zea mays）對草地夜蛾（Spodoptera frugiperda）的取食變得更為敏感[12,13]。

在漸狹葉煙草中，利用 dsRNA 抑制依賴于 RNA 的RNA 聚合酶 1（RDR1）的表達，植物的抗蟲性降低[14]。RDR1 與內源 siRNA 的合成有關，是 siRNA 介導基因沉默的關鍵因子。由此推測，煙草對植食性昆蟲的抗性與 RNAi 密切相關。進一步研究發(fā)現，抑制 RDR1 表達可以削弱由昆蟲口器分泌物激發(fā)的 JA 和 ET 信號通路。對煙草小 RNA 表達譜的分析發(fā)現，RDR1 表達抑制對植食性昆蟲取食引起的小 RNA 類群變化有顯著影響，在這些發(fā)生變化的小 RNA 中，有很大一部分與防御激素（JA、ET）信號途徑的調控基因同源[15]。

更為精細的遺傳與生化分析表明，RNAi 在 ET 信號途徑中的確具有重要的調節(jié)作用，ET 途徑的多個關鍵調控因子受到細胞質 RNA5?—3? 和 3?—5? 降解途徑的調控[16,17]。負責細胞質 RNA 降解的突變體 ein5 對 ET 信號敏感性降低[17]。如果細胞質 RNA5?—3? 和 3?—5? 降解途徑同時受阻，植物就會表現出嚴重的發(fā)育缺陷，并且有一定比例的胚胎致死。有趣的是，在 RNAi 途徑相關突變體 rdr6 中，RNA 降解途徑受阻引起的發(fā)育缺陷表型基本得到回復。高通量測序分析發(fā)現，細胞質 RNA 降解途徑受阻后，多個（441 個）蛋白編碼基因產生了大量長度為 21—22 nt 的次級小干擾 RNA（ct-siRNA），它們由 RDR6-DCL4/2 途徑產生，對相應同源基因的表達有明顯抑制作用[16]。這些結果揭示了 RNAi 途徑對乙烯途徑相關的胞質 RNA 降解途徑具有調節(jié)作用，在胞質 RNA 降解途徑受阻的情況下，能夠以 RNAi 的方式降解多余的 RNA；細胞質 RNA 降解途徑具有抑制細胞內正常轉錄本 PTGS 的作用。

1.2 微 RNA（miRNA）在植物抗蟲途徑中的作用

miR156 是植物中一類相當保守的 miRNA，其靶基因編碼 SPL 家族轉錄因子，miR156-SPL 模塊在植物從營養(yǎng)生長期向生殖生長期的轉換過程中起關鍵調控作用。除了影響植物的生長發(fā)育，miR156-SPLs 也參與控制多種植物次生代謝化合物的合成以及表皮毛的形成。表皮毛分布在植物地上器官的表面，對前來取食的昆蟲形成物理屏障，是植物抗蟲的一種重要手段。對擬南芥表皮毛分布調控機制的研究發(fā)現，SPL9 能夠直接結合負調因子基因 TCL1 的啟動子。隨著植物生長，miR156 水平不斷降低而 SPL9 逐漸增高，TCL1 基因表達水平隨之增高，從而抑制表皮毛在花序軸和花器官上的形成。如果用 35S 啟動子過表達 miR56，擬南芥在抽苔后產生大量異位表皮毛[18]。與 miR156 相反，miR171 則抑制表皮毛形成。進一步研究發(fā)現受 miR171 調節(jié)的 LOM 蛋白通過與 miR156 靶向的 SPLs 相互作用來協(xié)調擬南芥表皮毛的分布和植物營養(yǎng)生長到生殖生長的時相轉化[19,20]。

植物次生代謝產物往往與生物互作密切相關，其中很大一部分是抵御昆蟲和病原微生物侵襲的植保素?；ㄇ嗨厥侵参镏谐Ｒ姷拇紊x產物，研究發(fā)現 miR156-SPLs 參與植物對花青素合成的調控。高水平的 miR156 能夠促進花青素的積累，而降低 miR156 的水平導致花青素含量隨之降低并伴隨黃酮醇的積累。miR156 的靶基因 SPL9 與花青素合成調控 MYB 類轉錄因子 PAP1 存在互作，干擾花青素途徑 MYB-bHLH-WD40 轉錄激活復合體的活性[21]。萜類化合物是植物次生代謝產物中最為豐富的一類[22,23]。植物在受到昆蟲取食后，許多揮發(fā)性萜類被誘導合成并大量釋放。植物揮發(fā)性成分具有驅避昆蟲取食，吸引傳粉者或害蟲天敵等功能[24,25]。在擬南芥中倍半萜成分 β- 石竹烯的合成受到 miR156-SPLs 的調控，SPL 能夠直接結合 β- 石竹烯合酶基因 TPS21 的啟動子，激活其轉錄。在唇形科香料植物廣藿香（Pogostemon cablin）中，廣藿香醇的合成也同樣受到 miR156-SPLs 的調控[26]。

在擬南芥中防御激素 JA 的合成受到 miR319 的負調控[27]。miR319 的靶基因編碼一組 TCP 家族轉錄因子，包括 TCP2，TCP3，TCP4，TCP10 和 TCP24。人們發(fā)現 JA 合成途徑關鍵酶 LOX 基因的啟動子區(qū)域存在這類 TCP 轉錄因子的識別元件，TCP 能夠直接激活 LOX 的轉錄，參與 JA 合成途徑的調控。有趣的是，miR319 靶向的 TCP4 與 miR156 靶向的 SPL9 在體內具有結合互作的活性，這種結合在一定程度上削弱了 TCP4 對下游基因的轉錄激活[28]。推測在擬南芥中，JA 合成途徑可能受到多個 miRNA 的調控。

1.3 非編碼 RNA 與植物防御記憶

研究發(fā)現，野蘿卜（Raphanus raphanistrum）受到菜粉蝶（Pieris rapae）侵襲后，下一代對菜粉蝶的抗性有明顯提高[29]。對猴面花（Mimulus guttatus）進行機械損傷處理，模擬昆蟲取食；連續(xù)處理七代后，從處理組得到的植物后代相比于沒有處理的植物具有更多、更密集的表皮毛[30]。這些結果說明植物對昆蟲取食產生防御反應的能力具有一定的記憶作用和繼代效應。越來越多的研究證明，多種植物的隔代記憶現象與表觀遺傳密切相關[31]。表觀遺傳是指染色體的表觀修飾（DNA 的甲基化和組蛋白修飾等）可以遺傳至下一代。已有證據表明，非編碼 RNA 尤其是 siRNA 在表觀修飾的調控中起重要作用[32,33]。對擬南芥抗蟲記憶的研究初步表明，植物對昆蟲的侵襲具有隔代記憶，并且這種隔代記憶依賴于 JA 響應途徑；在 JA 響應突變體 coi1 中，抗蟲防御的隔代記憶現象消失了。有意思的是，在 siRNA 合成途徑的突變體中（dcl2，dcl3，dcl4 和 nrpd2a，nrpd2b），也未發(fā)現對昆蟲防御記憶的遺傳效應[34]。上述結果暗示 siRNA 和 JA 信號這兩個途徑都參與了植物抗蟲反應的記憶效應。

2 植物介導的昆蟲 RNAi

2.1 植物介導的昆蟲 RNAi 現象的發(fā)現

早在 1998 年，人們發(fā)現線蟲在取食表達與 GFP 基因匹配的 dsRNA 細菌時，可以將 dsRNA 吸收到體內，導致線蟲中的 GFP 基因表達受到抑制[4]。這說明 RNA 沉默信號可以通過取食進入生物體內并行使功能。2007 年 Mao等[35]發(fā)表了植物介導昆蟲 RNA 干擾的研究結果。棉屬植物含有棉酚及相關倍半萜醛類，這些成分對昆蟲具有普遍毒性。棉鈴蟲（Helicoverpa armigera）P450 單加氧酶基因 CYP6AE14 在其中腸高表達并且可被棉酚誘導，與幼蟲對棉酚的耐受性緊密相關。為抑制 CYP6AE14 表達，Mao等[35]根據 CYP6AE14 序列設計了 dsRNA，轉入植物表達。棉鈴蟲取食轉基因植物后中腸中 CYP6AE14 的表達水平降低，對棉酚的耐受性下降。同年，孟山都研究小組在玉米中表達玉米根蟲（Diabrotica virgifera）V-type ATPase 的 dsRNA，得到的轉基因植物抗蟲性明顯提高[36]。這兩個獨立的發(fā)現，為發(fā)展基于 RNAi 的新一代抗蟲植物奠定了基礎。

隨著研究的深入，人們發(fā)現植物介導的昆蟲 RNAi 現象普遍存在于包括咀嚼式和刺吸式在內的多種昆蟲中[37,38]。這說明 dsRNA 或其基因沉默信號分子可跨物種、跨界傳播，這為生物間互作和植物抗病研究提供了新思路。RNAi 技術具有較高的選擇性與特異性，有望成為有害生物控制的重要新技術。在植物中表達小麥葉銹菌（Puccinia triticina）致病基因的 dsRNA 削弱了病原菌對植物的侵染[39]。RNAi 信號在宿主植物和寄生植物之間的傳播，可用來控制寄生植物的蔓延[40]。我們最初的工作是利用模式植物擬南芥和煙草開展的，隨后證明表達轉基因棉花也能抑制棉鈴蟲相關 P450 基因的表達，對棉鈴蟲的抗性明顯提高[41]。

2.2 RNAi抗蟲技術的發(fā)展

靶基因的有效性和基因沉默的效率是 RNAi 抗蟲技術得以成功的關鍵。自 RNAi 抗蟲技術報道以來，人們一直在尋找適用于這一技術的有效靶基因，然而很多關于 dsRNA 抗蟲植物的報道顯示，雖然植物的抗蟲性有所提高，但與目前成熟的 Bt 作物比較相去甚遠。棉鈴蟲 HaNV2 基因編碼一個定位于線粒體的 NDPH 脫氫酶黃素蛋白 2（NDUFV2），對于細胞能量代謝具有重要作用。我們課題組最近的研究表明，通過植物介導的 RNAi抑制棉鈴蟲 HaNV2 的表達，可導致其幼蟲中腸近絨毛位置的線粒體數目明顯減少，且線粒體發(fā)育異常，呼吸鏈功能受到嚴重影響。表達棉鈴蟲 dsHaNV2 的轉基因棉花表現出較強的抗蟲能力，取食的棉鈴蟲幼蟲死亡率高達 80% 以上，與目前廣泛應用的 Bt 抗蟲棉效果相當[42]。

與內源性的 RNAi 不同，植物介導的昆蟲 RNAi 需要將植物中的 dsRNA 通過昆蟲的取食與消化系統(tǒng)傳遞到昆蟲細胞內，因此 dsRNA 在昆蟲中腸的吸收，在很大程度上決定著 RNAi 的效率。昆蟲中腸外側包裹著一層叫圍食膜的組織，由幾丁質以及大量的糖蛋白組成，是 dsRNA 進入昆蟲細胞時遇到的第一道屏障。人們發(fā)現植物半胱氨酸蛋白酶能夠破壞昆蟲圍食膜結構，增加中腸通透性；將 dsRNA 和半胱氨酸蛋白酶在植物中共表達，顯著提高了 RNAi 效率[43]。提高 dsRNA 的表達量是增加 RNAi 效率的另一個重要渠道。最近的兩項研究發(fā)現，利用質體表達體系可以顯著提高 dsRNA 在植物中的產生與積累，從而有效地提高植物對昆蟲的抗性[44,45]。

3 展望

隨著對非編碼 RNA 研究的深入，人們對 RNA 和基因表達調控有了新的認識。例如，有報道發(fā)現植物中有些 miRNA 轉錄前體（pre-miRNA）具有短的開放閱讀框，除了產生成熟的 miRNA，還能被翻譯成小肽行使功能[46]。最近的研究顯示，來自病原菌的 siRNA 可通過侵染向植物傳播，同時植物的 siRNA 也可以進入病原菌，并且這些 siRNA 在植物—病原菌互作中起重要作用[47,48]?？梢?，植物非編碼 RNA 可作為直接的信號分子跨界傳播，在植物與環(huán)境的互作中發(fā)揮重要作用。植物非編碼 RNA 尤其是長非編碼 RNA 的研究還存在許多尚未開墾的領域，需要更多的工作來發(fā)現新的非編碼 RNA 并闡明其生成途徑、作用機制以及生物學功能。目前的研究主要局限于少數模式植物，除了水稻，其他作物的非編碼 RNA 研究報道較少。在農業(yè)上，利用 RNAi 技術控制蟲害已經成為熱點。與傳統(tǒng)抗蟲蛋白轉基因相比，這一技術更具選擇性和安全性。然而，雖然植物介導的昆蟲 RNAi 說明 dsRNA 或其沉默信號可在不同物種間傳播，但是 RNA 沉默信號的傳播機制還不清楚，這在很大程度上限制了技術的發(fā)展和應用。無疑，非編碼 RNA 的功能研究及其應用具有誘人的發(fā)展前景，將引起廣大生物學、醫(yī)學和農學工作者更大的興趣。

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E-mail： ybmao@sibs.ac.cn

陳曉亞男，中科院院士，發(fā)展中國家科學院院士，中科院上海生科院植物生理生態(tài)所研究員、上海辰山植物科學中心主任。從事植物次生代謝、RNA干擾抗蟲新技術、棉纖維發(fā)育等方面取得了成績。對植物倍半萜，尤其是棉酚和青蒿素生物合成途徑及調控開展了系統(tǒng)深入的研究，解析了植物激素和 miRNA 調控倍半萜生物合成的分子機制，發(fā)展了植物介導的 RNA 干擾抗蟲技術，成為研發(fā)新一代植物抗蟲技術的重要突破。闡述了植物激素（赤霉素）調控棉纖維伸長的機制，發(fā)現 miRNA 靶基因調控表皮毛發(fā)育，對揭示棉纖維和植物表皮毛細胞發(fā)育的分子機制具有重要意義。至今已發(fā)表論文百余篇，包括 Nature Biotechnology，Nature Communications，Plant Cell 等重要刊物。現任中國植物生理和分子生物學學會理事長、Science Bulletin 主編、Plant Biotechnology Journal 副主編等職。2008 年獲得何梁何利科學技術進步獎，2010 年獲全國優(yōu)秀博士學位論文指導教師獎，2014 年獲第三屆國際棉花基因組組織（ICGI）杰出貢獻獎。E-mail： xychen@sibs.ac.cn

Chen Xiao-YaMale, received B.Sc. from Nanjing University, China in 1982, and Ph.D. from Reading University, UK in 1985. Then he worked in Nanjing University (lecturer, associate professor); Institute of Botany, Tuebingen University, Germany (visiting scientist), and Department of Medicinal Chemistry and Pharmacognosy, Purdue University, USA (postdoctoral fellow). Since 1994, he has been a group leader in Shanghai Institute of Plant Physiology and Ecology, Chinese Academy of Sciences. He is interested in plant secondary metabolism, plantinsect interactions, new technology (RNAi) for pest control, trichome and cotton fiber development. He received HLHL Foundation Prize for Scientific and Technological Progress in 2008, and The Third ICGI Award for Outstanding Contribution to Cotton Genomics in 2014. Currently he also serves as President of Chinese Society for Plant Physiology and Molecular Biology, Director of Research Center of Shanghai Chenshan Botanical Garden, Editor-in-Chief of Science Bulletin, and Associate Editor of Plant Biotechnology Journal. He was elected a member (Academician) of Chinese Academy of Sciences in 2005 and a member of The World Academy of Sciences (TWAS) for the advancement of science in developing countries in 2008. E-mail： xychen@sibs.ac.cn

Advances in Research of Plant Non-coding RNAs and RNAi-based Technology Against Insects Herbivore

Mao Ying-Bo1Chen Dian-Yang1,2Chen Xiao-Ya1
（1 National Key Laboratory of Plant Molecular Genetics, CAS Center for Excellence in Molecular Plant Sciences, Institute of Plant Physiology and Ecology, Chinese Academy of Sciences, Shanghai 200032, China; 2 University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China）

Non-coding RNAs (ncRNAs), including long non-coding RNAs (lncRNAs) and small RNAs such as microRNAs (miRNAs) and short interference RNAs (siRNAs), exist widely in eukaryotes and affect gene expressions at different levels. In plant, ncRNAs are involved in growth, development, response to biotic and abiotic stresses, and are important players in epigenetics. RNA interference (RNAi) refers to homology gene silencing caused by double strand RNAs (dsRNAs) and is a major mechanism of gene expression regulation by ncRNAs. Since discovery, RNAi has been developed as a powerful technology for genetic analysis, gene therapy, and plant protection. In this review, we summarize the recent progresses in research of the function and mechanism of ncRNAs in plant defense pathways and discuss the application of RNAi technology in agricultural pest control.

non-coding RNA, microRNA, RNA interference, insect resistance

Bo

B.Sc. from School of Life Sciences, Xiamen University in 1997 and Ph.D. from the Shanghai Institute of Plant Physiology and Ecology, Chinese Academy of Sciences (CAS). Her Ph.D. dissertation was rated as excellent doctoral dissertation of CAS (2009) and national excellent doctorial dissertation (2010). She has worked in the Shanghai Institute of Plant Physiology and Ecology. Dr Mao’s main interest is in studying the defense pathways underlying insect-plant interactions, including the mechanism of gossypol tolerance in bollworm, plant mediated RNA interference in insects, and molecular mechanism of insect effectors interfere with plant defense.

毛穎波中科院上海生命科學院植物生理生態(tài)所研究員。研究方向為植物與昆蟲的防御互作，主要工作包括：棉鈴蟲對棉酚的耐受性機制，次生代謝物與植物—昆蟲互作/共進化，植物抗蟲反應中的非編碼RNA，植物介導的昆蟲RNAi新技術，昆蟲效應子作用機制等。獲2010年全國優(yōu)秀博士學位論文獎。主持和承擔國家基金委、重大專項、重點專項和中科院B類先導課題等多個項目的研究。E-mail： ybmao@sibs.ac.cn

*中科院戰(zhàn)略先導性專項（X DB11030000）

**通訊作者

修改稿收到日期：2017年5月3日