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    新生期缺氧缺血大鼠腦白質(zhì)損傷及腦內(nèi)Fyn、p-ERK和MBP下調(diào)

    2017-09-05 10:54:27林凌張更邱榮暉羅道樞林清
    關(guān)鍵詞:胼胝髓鞘白質(zhì)

    林凌,張更,邱榮暉,羅道樞,林清

    (福建醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學院人體解剖學與組織學胚胎學系,神經(jīng)生物學研究中心,福州 350122)

    新生期缺氧缺血大鼠腦白質(zhì)損傷及腦內(nèi)Fyn、p-ERK和MBP下調(diào)

    林凌,張更,邱榮暉,羅道樞,林清*

    (福建醫(yī)科大學基礎(chǔ)醫(yī)學院人體解剖學與組織學胚胎學系,神經(jīng)生物學研究中心,福州 350122)

    目的 檢測新生大鼠缺氧缺血后腦內(nèi)酪氨酸蛋白激酶Fyn、p-ERK及髓鞘堿性蛋白(myelin basic protein, MBP)表達的變化,探討Fyn-ERK通路在缺氧缺血腦白質(zhì)損傷中的作用。方法 新生3日齡SD大鼠24只,隨機分為對照組和缺氧缺血(HⅠ)組。缺氧缺血后4周,應(yīng)用HE染色法觀察腦組織病理學改變;應(yīng)用免疫熒光染色法和Western blot法觀察Fyn、p-ERK及MBP在大鼠腦內(nèi)的定位定量表達變化。結(jié)果 HE染色顯示缺氧缺血大鼠出現(xiàn)缺氧缺血腦白質(zhì)損傷病理改變;免疫熒光染色和Western blot檢測顯示腦內(nèi)Fyn、p-ERK和MBP水平均明顯下調(diào)。結(jié)論 新生期缺氧缺血損傷4周后,可能通過Fyn與p-ERK水平的下調(diào)而使MBP減少,進而使少突膠質(zhì)細胞成熟障礙,引起腦白質(zhì)損傷。

    新生期缺氧缺血;Fyn蛋白;髓鞘堿性蛋白;腦白質(zhì)

    缺氧缺血腦白質(zhì)損傷(hypoxic-ischemic white matter injury,WMⅠ)是早產(chǎn)兒腦損傷的重要類型,可致患兒出現(xiàn)腦癱、智力低下、視聽障礙等多種后遺癥,給社會和家庭帶來沉重的負擔[1]。缺氧缺血WMⅠ的主要病理改變是髓鞘生成障礙,腦白質(zhì)變稀疏甚至軟化。WMⅠ中髓鞘生成障礙的具體機制仍未明確,目前依舊是國內(nèi)外研究的熱點。

    Src蛋白酪氨酸激酶(protein tyrosine kinases, PTKs)家族成員共有10 種,具有高度同源性,分別由不同基因編碼,通過調(diào)節(jié)蛋白酪氨酸磷酸化,參與調(diào)節(jié)細胞增殖、分化、遷移和細胞形態(tài)的維持[2]。Fyn 是該家族的一員,是細胞內(nèi)一種非受體型酪氨酸激酶[3]。大量研究表明,F(xiàn)yn信號通路可通過激活髓鞘堿性蛋白(myelin basic protein, MBP)基因而在髓鞘形成中發(fā)揮不可或缺的作用[4,5]。當新生大鼠腦白質(zhì)發(fā)生炎癥后Fyn表達量降低,髓鞘形成障礙[6]。那么,F(xiàn)yn信號通路在新生大鼠發(fā)生缺氧缺血損傷中是否發(fā)揮同樣的作用?目前未見文獻報道。對這一問題的研究將有助于進一步明確缺氧缺血WMⅠ的發(fā)病機制,具有重要意義。故本研究擬通過結(jié)扎新生3日齡SD大鼠雙側(cè)頸總動脈及缺氧法建立缺氧缺血(hypoxia-ischemia, HⅠ)損傷模型,應(yīng)用HE染色法觀察腦組織病理學改變,采用免疫熒光組織化學染色法和Western blot法檢測HⅠ后4周大鼠Fyn、p-ERK及MBP在腦內(nèi)的變化,探討Fyn-ERK 通路在缺氧缺血腦白質(zhì)損傷中的作用。

    材料和方法

    1 實驗動物及試劑

    新生3日齡SD大鼠24只,體質(zhì)量8.00~11.00g,雌雄不拘,由福建醫(yī)科大學實驗動物中心提供[SCXK(閩)2012-0001],應(yīng)用隨機數(shù)字表法隨機分為對照組和缺氧缺血HⅠ組。小鼠抗大鼠MBP抗體(美國abcam公司);兔抗大鼠Fyn抗體(美國Santa Cruz公司);兔抗大鼠ERK、p-ERK抗體(美國cst公司);Alexa Fluor488標記的山羊抗小鼠ⅠgG;Alexa Fluor555標記的山羊抗兔ⅠgG(美國invitrogen公司);小鼠抗大鼠GAPDH抗體,辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔ⅠgG、山羊抗大鼠ⅠgG及免疫印跡相關(guān)試劑(碧云天生物技術(shù)研究所) 。

    2 缺氧缺血損傷模型制作

    參照本實驗室原有方法[7]稍加改進。無水乙醚麻醉大鼠,無菌條件下作長約0.5cm頸腹側(cè)正中切口,分離雙側(cè)頸總動脈,以8-0顯微外科手術(shù)縫線完全結(jié)扎雙側(cè)頸總動脈后縫合皮膚;術(shù)后在37℃水浴箱內(nèi)放置10min,至體溫和活動恢復正常,返籠飼養(yǎng)。返籠恢復2h后,將大鼠置于低壓氧倉全自動控制儀(南京柏曼信息科技服務(wù)中心,XF-XC06-Ⅰ)以8%的氧氣缺氧30min。對照組大鼠僅分離雙側(cè)頸總動脈,不予結(jié)扎及缺氧。

    3 組織切片標本制備

    缺氧缺血后4周分別取對照組和HⅠ組大鼠各6只,10﹪水合氯醛(3ml/kg)麻醉后,通過左心室插管灌注生理鹽水;待流出清亮液體后續(xù)以4﹪多聚甲醛灌注固定。每組取3只大鼠行石蠟包埋HE染色,另3只行冰凍切片用于免疫熒光染色。

    4 免疫熒光染色

    對腦組織進行冰凍切片,片厚25μm,行漂片染色。以免疫熒光顯色封閉液室溫封閉2h;傾去封閉液,分別滴加小鼠抗大鼠MBP抗體(1:200)、兔抗大鼠Fyn抗體(1:200)和兔抗大鼠p-ERK抗體(1:200),4℃孵育過夜;用0.01mol/L PBS清洗后,分別滴加Alexa Fluor488標記的山羊抗小鼠ⅠgG和AlexaFluor555標記的山羊抗兔ⅠgG(1:200),37℃孵育2h;DAPⅠ(1mg/L)染核5min,抗熒光淬滅封片劑封片。激光掃描共聚焦顯微鏡(德國,Leica SP8)下觀察,綠色激發(fā)波長為488nm,發(fā)射波長為500~530nm;紅色激發(fā)波長為543nm,發(fā)射波長為560~600nm;藍色激發(fā)波長為405nm,發(fā)射波長為420~450nm。陰性對照組以PBS代替一抗進行染色。

    5 Western blot檢測

    缺氧缺血后4周分別取對照組和HⅠ組大鼠各6只,以RⅠPA裂解液提取大鼠腦組織總蛋白,BCA法測定蛋白濃度。每孔上樣量為50μg蛋白,SDS-PAGE凝膠電泳,濕轉(zhuǎn)于PVDF膜。脫脂奶粉封閉,加入兔抗大鼠Fyn、ERK、p-ERK抗體(1:1000)4℃孵育過夜和辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔ⅠgG、抗小鼠ⅠgG(1:1000)室溫孵育1h或加入小鼠抗大鼠MBP(1:1000)4℃孵育過夜,辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠ⅠgG(1:1000)室溫孵育1h,清洗后進行化學發(fā)光、顯影和定影,生物分子成像儀(日本,LAS 4000 mini)成像。以GAPDH作為內(nèi)參蛋白。

    6 統(tǒng)計學分析

    用ⅠmageJ 2.1圖像分析系統(tǒng)對Western blot結(jié)果進行光密度分析,以各組目的蛋白條帶光密度值對內(nèi)參蛋白光密度值計算相對比值(均數(shù)±標準差),采用SPSSl9.0統(tǒng)計軟件對結(jié)果進行分析。以P<0.05時差異有統(tǒng)計學意義。

    結(jié) 果

    1 缺氧缺血使腦白質(zhì)纖維排列紊亂

    于缺氧缺血后4周取腦組織行HE染色,結(jié)果顯示:對照組腦白質(zhì)(胼胝體)纖維排列致密、整齊(圖1A),缺氧缺血組腦白質(zhì)纖維排列稀疏、紊亂(圖1B)。

    2 缺氧缺血降低腦組織內(nèi)Fyn、p-ERK和MBP水平

    免疫熒光染色顯示,缺血缺氧組Fyn免疫反應(yīng)陽性物較相應(yīng)對照組少(圖2),且在胼胝體部位,F(xiàn)yn表達于細胞胞體和突起(圖2A2,圖2B2),而在海馬則表達于神經(jīng)元胞核(圖2A3,圖2B3)。缺氧缺血組p-ERK表達量亦較相應(yīng)對照組下降(圖3),并且p-ERK表達于胼胝體細胞突起(圖3A2,圖3B2)和海馬神經(jīng)元胞體(圖3A3,圖3B3)。缺氧缺血組MBP免疫反應(yīng)陽性物較相應(yīng)對照組減少(圖4);局部放大后可見對照組腦白質(zhì)MBP免疫反應(yīng)陽產(chǎn)性物排列整齊、致密、突起較長(圖4A2),而缺氧缺血組MBP免疫反應(yīng)陽性物排列較紊亂、稀疏、突起變短(圖4B2)。

    圖1 缺氧缺血腦白質(zhì)病理學變化的HE染色檢測。cc,胼胝體;A2和B2分別為A1和B1中方框內(nèi)cc的高倍像;比例尺:A1和B1,100μm;;A2和B2,10μmFig. 1 The pathological changes in hypoxic-ischemic rat brain. The corpus callosum (cc) region was examined using HE staining. A1: Control rat; B1: Hypoxia-ischemic rat; A2and B2 Boxed regions at higher magnification from A1 and B1 respectively. Scale bar: 100μm in A1 and B1; 10μm in A2 and B2

    提取各組大鼠腦組織總蛋白,以Western blot檢測Fyn、ERK、p-ERK及MBP水平。結(jié)果顯示,與對照組相比,缺氧缺血組Fyn和MBP水平顯著下降、p-ERK與總ERK的比例明顯降低(圖5)。

    討 論

    本研究通過永久性結(jié)扎雙側(cè)頸總動脈聯(lián)合缺氧法致使新生大鼠發(fā)生缺氧缺血損傷,應(yīng)用HE染色法觀察腦組織病理學改變,應(yīng)用免疫熒光組織化學染色法和Western blot 法觀察Fyn、p-ERK和MBP在腦內(nèi)水平變化。我們發(fā)現(xiàn),在缺氧缺血后4周,腦白質(zhì)纖維變稀疏,F(xiàn)yn、p-ERK及MBP的表達量均較對照組明顯減少,并且Fyn在胼胝體與海馬的表達部位不同。

    Fyn在海馬表達于細胞核,參與神經(jīng)元的活動,缺氧缺血后其水平顯著下降,這與廖家萬[8]等的研究結(jié)果相一致。他們認為低氧可使大鼠海馬神經(jīng)元Fyn表達降低。而在胼胝體Fyn主要表達于細胞質(zhì)和突起,由于胼胝體主要成分是少突膠質(zhì)細胞和神經(jīng)元突起,故筆者推測,胼胝體中Fyn可能主要作用于少突膠質(zhì)細胞,但Fyn在海馬與胼胝體表達部位不同的具體原因及機制尚不清楚,有待進一步研究證實。

    圖2 免疫熒光檢測缺氧缺血對腦組織Fyn水平的影響。cc,胼胝體;HP,海馬;A2和B2,分別為A1和B1中方框內(nèi)CC的高倍像;A3和B3,分別為A1和B1中方框內(nèi)HP的高倍像;比例尺:A1和B1,100μm;A2、A3和B2、B3,25μm。Fig. 2 The effects of hypoxia-ischemia on brain Fyn level. cc, corpus callosum; HP, hippocampus; A2 and B2, the images of cc at higher magnification from A1 and B1, respectively; A3 and B3, the images of HP at higher magnification from A1 and B1, respectively; scale bar: 100μm in A1 and B1; 25μm in A2, A3, B2 and B3

    圖3 免疫熒光檢測缺氧缺血對腦組織p-ERK水平的影響。cc,胼胝體;HP,海馬;A2和B2,分別為A1和B1中方框內(nèi)CC的高倍像;A3和B3,分別為A1和B1中方框內(nèi)HP的高倍像;比例尺:A1和B1,100μm;A2、A3和B2、B3,25μm。Fig. 3 The effects of hypoxia-ischemia on the brain p-ERK level. cc, corpus callosum; HP, hippocampus; A2 and B2, the high magnification images of cc in A1 and B1; A3 and B3, the high magnification images of HP in A1 and B1; scale bar: 100μm in A1 and B1; 25μm in A2, A3, B2 and B3

    圖4 免疫熒光檢測缺氧缺血對腦白質(zhì)MBP水平的影響。A2和B2,分別為A1和B1中方框內(nèi)白質(zhì)的高倍像;比例尺:A1和B1,100μm;A2和B2,25μm。Fig.4 The effect of hypoxia-ischemia on MBP level in the white matter of brain; A2 and B2, the high magnification images of the white matter in the frames from A1 and B1; scale bar: 100μm in A1 and B1; 25μm in A2 and B2

    圖5 缺血缺氧下調(diào)腦白質(zhì)Fyn、p-ERK、MBP水平。A,F(xiàn)yn、p-ERK、MBP水平代表性Western blot檢測;B,F(xiàn)yn水平的統(tǒng)計學分析;C,p-ERK水平的統(tǒng)計學分析;D,MBP水平的統(tǒng)計學分析; *,與對照組相比,0.01<P<0.05Fig.5 The effect of hypoxia-ischemia on the Fyn, p-ERK, MBP level of brain white matter. A, levels of Fyn, p-ERK, MBP were determined by western blot; B, statistic analysis for Fyn level; C, statistic analysis for p-ERK level; D, statistic analysis for MBP level; *, 0.01<P< 0.05, compared with the control

    由于WMⅠ患兒認知和行為學障礙通常在幼兒期才明顯固定化,而1月齡大鼠在神經(jīng)發(fā)育上相當于人類2~5歲幼兒[9]。且研究表明,新生大鼠缺氧缺血后4周可見早期少突膠質(zhì)前體細胞大量增殖,但新生的早期少突膠質(zhì)前體細胞雖可向晚期少突膠質(zhì)前體細胞發(fā)育,卻無法進一步分化為成熟少突膠質(zhì)細胞及產(chǎn)生髓鞘蛋白[10,11]。因此,為明確少突膠質(zhì)細胞無法分化成熟是否與Fyn相關(guān),本實驗選擇缺氧缺血后4周作為觀測點。結(jié)果發(fā)現(xiàn),新生大鼠缺氧缺血后4周,腦組織中的Fyn和MBP水平下降,并且組織學顯示腦白質(zhì)纖維排列疏松,說明Fyn水平下降可能引起髓鞘生成障礙,這與其它報道大致吻合。已有的研究證實,F(xiàn)yn可誘導少突膠質(zhì)細胞發(fā)生遷移[12],促進少突膠質(zhì)細胞和施萬細胞的成熟和發(fā)育[13,14],在中樞神經(jīng)系統(tǒng)髓鞘形成過程中具有不可或缺的作用。Goto等的研究則顯示,F(xiàn)yn基因敲除小鼠與野生型小鼠相比,少突膠質(zhì)細胞的數(shù)量減少且形態(tài)發(fā)生改變,胼胝體稀疏[15]。Xie等發(fā)現(xiàn),新生大鼠腦白質(zhì)發(fā)生炎癥后Fyn含量降低,髓鞘形成障礙[6]。這些研究共同提示Fyn在髓鞘生成中發(fā)揮重要作用,這有賴于Fyn的特性。Fyn為細胞內(nèi)非受體型酪氨酸激酶,為Src家族蛋白酪氨酸激酶中的一員,可通過促使酪氨酸磷酸化發(fā)揮作用,酪氨酸激酶磷酸化級聯(lián)反應(yīng)參與髓鞘形成過程中信號的傳導,其中包括 MAPK/ERK 等信號傳導通路[16]。因此,本研究進一步觀察了ERK的磷酸化水平,結(jié)果顯示缺氧缺血后4周p-ERK的表達降低,由此我們推測,ERK磷酸化水平下降可能與Fyn水平下調(diào)有關(guān)。

    缺氧缺血腦白質(zhì)損傷為早產(chǎn)兒腦損傷的常見類型,主要病理表現(xiàn)為髓鞘合成障礙,腦白質(zhì)變疏松甚至軟化。WMⅠ可致存活患兒出現(xiàn)腦癱、認知障礙、視覺異常等嚴重的神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥,其發(fā)病機制尚未完全明確,至今仍缺乏有效的防治措施。本研究發(fā)現(xiàn)新生大鼠缺氧缺血后,F(xiàn)yn水平下調(diào)、ERK磷酸化水平降低,同時MBP水平也明顯下調(diào)。由此提示,新生期腦缺氧缺血后可能通過Fyn-ERK通路蛋白的下調(diào)而使MBP水平降低,進而使髓鞘生成障礙,少突膠質(zhì)細胞成熟障礙,最終導致腦白質(zhì)損傷。但缺氧缺血如何誘導Fyn表達下降有待進一步的研究加以證實。

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    Hypoxic-ischemic white matter injury and down-regulation of Fyn, p-ERK and MBP in neonatal rat brain

    Lin Ling, Zhang Geng, Qiu Ronghui, Luo Daoshu, Lin Qing*
    (Department of Human Anatomy, Histology and Embryology, School of Basic Medical Science, Research Center for Neurobiology, Fujian Medical University, Fuzhou 350122, China)

    Objective To understand the role that Fyn-ERK pathway plays in hypoxic-ischemic white matter injury in neonatal rats. Methods 3-day-old new born SD rats were randomly divided into control and hypoxic-ischemic groups. The histology of rat brain tissues 4 weeks after operation was examined using HE staining. The distribution and expression level of Fyn, p-ERK and MBP protein were detected by immunocytochemistry and western blotting. Results The white matter injury was observed in hypoxic-ischemic rats. The levels of Fyn, p-ERK and MBP protein significantly decreased in the brains of hypoxic-ischemic rats, compared to the control group. Conclusion The results suggest that hypoxia-ischemia may decrease MBP level in neonatal rats through downregulating Fyn and p-ERK protein levels, which may lead to oligodendrocyte maturation disorder and white matter injury.

    Neonatal hypoxia-ischemia; Fyn protein; myelin basic protein; white matter

    R722.6

    A DOⅠ:10.16705/ j. cnki. 1004-1850.04.004

    2017-04-25

    2017-08-02

    國家自然科學基金青年科學基金項目(81501305);福建省教育廳重點項目(JA13135)

    林凌,女(1982 年),漢族,碩士,實驗師

    *通訊作者(To whom correspondence should be addressed):linqing522@126.com

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