非小細(xì)胞肺癌血清中l(wèi)ncRNA HOTAIR的表達(dá)及臨床意義

譚楠 李莉紅 白璐 趙昆

肺癌是起源于支氣管粘膜或腺體的惡性腫瘤，是發(fā)病率和死亡率增長最快、對人群健康和生命威脅最大的惡性腫瘤之一，根據(jù)統(tǒng)計(jì)肺癌的年發(fā)病人數(shù)及年死亡人數(shù)均居全球腫瘤首位[1]。肺癌的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，可能與吸煙、職業(yè)、環(huán)境接觸、電離輻射、既往肺部慢性感染、遺傳及大氣污染等因素有關(guān)，肺癌的早期癥狀不明顯，甚至可無任何不適，因此研究肺癌的發(fā)病機(jī)制及早期診斷對肺癌的治療及預(yù)后至關(guān)重要。長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA,lncRNA）是一類轉(zhuǎn)錄本長度超過200 nt的RNA分子，它們并不編碼蛋白，而是在表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄以及轉(zhuǎn)錄后等多種層面上調(diào)控基因的表達(dá)水平[2,3]，研究證實(shí)lncRNA廣泛參與了細(xì)胞增殖、分化及凋亡等過程，在多種疾病病理過程中發(fā)揮重要作用[4]，與腫瘤的發(fā)病、轉(zhuǎn)移、預(yù)后及治療密切相關(guān)[5,6]。HOX轉(zhuǎn)錄反義RNA（HOX transcript antisense RNA, HOTAIR）是一種新近發(fā)現(xiàn)具有反式轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用的lncRNA[7]，國內(nèi)外研究[8-12]發(fā)現(xiàn)HOTAIR在肺癌組織中高表達(dá)，且與肺癌的臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及預(yù)后有關(guān)。為了進(jìn)一步研究HOTAIR在肺癌診斷及預(yù)后中的作用，本實(shí)驗(yàn)采用實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction,PCR）檢測非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）患者血清中HOTAIR水平，并分析其與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 病例資料 選取西安市第一醫(yī)院2016年1月-2016年11月期間經(jīng)過組織病理確診的NSCLC患者64例，其中男性38例，女性26例，年齡32歲-75歲，平均（56.4±10.7）歲，組織病理類型為鱗癌23例、腺癌39例、大細(xì)胞癌2例，分期采用2009年國際抗癌聯(lián)盟（Union for International Cancer Control, UICC）（第7版）肺癌腫瘤-淋巴結(jié)-轉(zhuǎn)移（tumor-node-metastasis, TNM）分期標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行：I期15例，II期20例，III期26例，IV期3例。64例健康體檢者作為正常對照組，其中男性40例，女性24例，年齡26歲-71歲，平均（53.4±9.6）歲，本研究經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)并征得所有研究對象的知情同意。

1.2 樣本采集 所有患者均在進(jìn)行手術(shù)、化療或放療前進(jìn)行采樣，空腹無菌采取靜脈血5.0 mL，放置30 min后1,200 g離心10 min，吸取上清至離心管中，4oC 12,000 g再離心10 min后分離上清至新的離心管中，取250 μL血清加入750 μL TRIzol? LS試劑后-80oC保存待用。

1.3 總RNA提取及cDNA第一鏈合成 參照文獻(xiàn)[13]嚴(yán)格按照TRIzol? LS試劑（美國Invitrogen公司）說明書進(jìn)行血清總RNA提取，提取的RNA溶于DEPC處理的水中。采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國Thermo Scientific公司）進(jìn)行cDNA第一鏈合成，具體如下：3 μg總RNA、5 μg/μL Oligo(dT)1 μL溫和混合后70oC孵育5 min，冰上冷卻，短暫離心收集上清；依次加入5×反應(yīng)緩沖液4 μL、20 U/μL RNase抑制劑1 μL及10 mmol/L dNTP 2 μL 37oC溫和混合后孵育5 min；加入200 U/μL M-MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶1 μL，42oC 60 min、70oC 10 min，冰上冷卻終止反應(yīng)；合成的cDNA第一鏈在-20oC保存待用。

1.4 實(shí)時(shí)定量PCR檢測 根據(jù)Genebank中HOTAIR及內(nèi)參GAPDH的序列，利用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，具體序列如下：HOTAIR上游引物5'-GGCAGCACAGAGCAACTCTA-3'，下游引物5'-GCAGGGTCCCACTGCATAAT-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物大小125 bp；GAPDH上游引物5'-ACTAGGCGCTCACTGTTCTCT-3'，下游引物5'-GヰGACTCCGACCヰCACCT-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物大小83 bp，由上海生工生物技術(shù)科技有限公司合成引物。利用SYBR? Premix Ex TaqTMII（大連寶生物工程有限公司）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，20 μL反應(yīng)體系包括10 μL SYBR? Premix Ex TaqTM II（2×）、模板3.0 μL、上下游引物（10 μM）各1.0 μL、ddH2O 5.0 μL，PCR反應(yīng)條件：95oC預(yù)變性30 s，95oC 10 s、60oC 30 s共35個(gè)循環(huán)。擴(kuò)增結(jié)束后得到Ct值，采用2-△△Ct法計(jì)算血清中HOTAIR的表達(dá)水平。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 16.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HOTAIR在NSCLC患者血清中的水平 實(shí)時(shí)定量PCR檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)NSCLC患者血清中HOTAIR水平為（2.85±1.16），明顯高于正常對照組（1.74±0.69），兩組之間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=6.566, P＜0.01）。

2.2 NSCLC患者血清中HOTAIR水平與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系 為了進(jìn)一步研究HOTAIR在NSCLC發(fā)生、發(fā)展中的作用，本研究統(tǒng)計(jì)分析了肺癌血清中HOTAIR水平與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)血清中HOTAIR水平與患者性別、年齡、吸煙、分化程度及病理類型均無明顯相關(guān)（P＞0.05）。而腫瘤大?。? cm的肺癌患者血清中HOTAIR水平明顯高于腫瘤大小≤3 cm患者，III期+IV期肺癌患者血清中HOTAIR水平明顯高于I期+II期患者，有淋巴轉(zhuǎn)移的肺癌患者血清中HOTAIR水平明顯高于無淋巴轉(zhuǎn)移的患者，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），結(jié)果見表1。

3 討論

非編碼RNA（non-coding RNA）是指不編碼蛋白質(zhì)的RNA，其中包括rRNA、tRNA、snRNA、snoRNA、microRNA、lncRNA及circRNA。由于lncRNA不編碼蛋白質(zhì)，最初被認(rèn)為是基因組轉(zhuǎn)錄的“噪音”，不具有生物學(xué)功能。但隨著RNA測序、芯片等分子生物學(xué)技術(shù)和生物信息學(xué)的不斷發(fā)展，越來越多的研究[4-6]證實(shí)lncRNA具有復(fù)雜的生物學(xué)功能，在多個(gè)層面上參與細(xì)胞分化和個(gè)體發(fā)育調(diào)控，并與多種疾病尤其是惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。國內(nèi)外學(xué)者研究[14-16]發(fā)現(xiàn)MALAT1、ANRIL、H19、MEG3、GAS5及CCAT2等多種lncRNAs在肺癌中異常表達(dá)，與肺癌的發(fā)病、診斷、治療及預(yù)后密切相關(guān)。HOTAIR是Rinn等[7]發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)具有反式轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用的lncRNA，人HOTAIR基因定位于12q13區(qū)域，基因（RefSeq NR_003716）全長2,364 bp，由1個(gè)長外顯子和5個(gè)短外顯子組成，HOTAIR主要是通過5'結(jié)構(gòu)域和3'結(jié)構(gòu)域募集復(fù)雜蛋白復(fù)合體來調(diào)控靶基因的表達(dá)。多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)HOTAIR不僅在乳腺癌、食管癌、胃癌、肝癌、結(jié)腸癌、腎癌、宮頸癌、卵巢癌、胰腺癌、肺癌等實(shí)體瘤中高表達(dá)[17,18]，而且在淋巴瘤、急性白血病等血液系統(tǒng)惡性腫瘤中也高表達(dá)[19,20]。國內(nèi)外學(xué)者[8-12,21]研究發(fā)現(xiàn)NSCLC患者腫瘤組織中的HOTAIR的表達(dá)水平明顯高于正常肺組織，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)過表達(dá)HOTAIR可以顯著促進(jìn)A549細(xì)胞的遷移和侵襲，且與順鉑化療耐藥有關(guān)。由于lncRNA具有疾病特異性和組織特異性、穩(wěn)定性高等特點(diǎn)，在心血管疾病、腫瘤患者外周循環(huán)中可以檢測到lncRNA，有可能成為疾病診斷、預(yù)后的標(biāo)志物[22,23]。本研究采用實(shí)時(shí)定量PCR檢測NSCLC患者血清中HOTAIR的水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)NSCLC患者血清中HOTAIR水平明顯高于正常對照組（P＜0.01），這與國內(nèi)外學(xué)者在肺癌組織中的研究結(jié)果一致[8-12]，提示HOTAIR在NSCLC病理過程中發(fā)揮了重要作用。

表 1 NSCLC患者血清中HOTAIR水平與臨床病理參數(shù)的關(guān)系Tab 1 The relationships between the serum levels of HOTAIR and clinical pathological parameters in the patients with NSCLC

本研究進(jìn)一步分析了NSCLC患者血清中HOTAIR水平與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)腫瘤大小＞3 cm的肺癌患者血清中HOTAIR水平明顯高于腫瘤大小≤3 cm患者，III期+IV期肺癌患者血清中HOTAIR水平明顯高于I期+II期患者，提示HOTAIR與TNM分期及腫瘤負(fù)荷有關(guān)，與國內(nèi)外學(xué)者研究結(jié)果[8-12]一致，本研究還發(fā)現(xiàn)I期+II期患者血清中HOTAIR水平仍然明顯高于正常對照組（P＜0.01），隨著研究的不斷深入HOTAIR有可能成為肺癌的早期診斷指標(biāo)之一。同時(shí)研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)有淋巴轉(zhuǎn)移的肺癌患者血清中HOTAIR水平明顯高于無淋巴轉(zhuǎn)移的患者，有研究表明過表達(dá)HOTAIR可以顯著促進(jìn)肺癌細(xì)胞A549的遷移和侵襲[11,24]，提示HOTAIR參與了肺癌的侵襲及轉(zhuǎn)移過程。本研究結(jié)果顯示肺癌患者血清中HOTAIR水平與患者性別、年齡、吸煙、分化程度及病理類型均無明顯相關(guān)，但張澤雨[10]等發(fā)現(xiàn)NSCLC患者腫瘤組織中HOTAIR的水平與腫瘤的分化程度明顯相關(guān)，這可能與病例的選擇有關(guān)，有待于擴(kuò)大樣本量進(jìn)行進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)NSCLC患者血清中HOTAIR水平升高，且與腫瘤大小、TNM分期及淋巴轉(zhuǎn)移有關(guān)，提示HOTAIR與肺癌的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移有關(guān)，但其具體作用機(jī)制尚不明確。由于肺癌的臨床表現(xiàn)比較復(fù)雜，早期癥狀不明顯，甚至可無任何不適，因此肺癌的早期診斷尤為重要，隨著對HOTAIR研究的不斷深入，可能為肺癌的早期診斷及治療提供新的靶點(diǎn)。