2，4—二叔丁基苯酚為內(nèi)標(biāo)高效液相色譜法測定丙泊酚血藥濃度

萬海方+黃焱明+汪國香+羅宏+張相彩+陶凡+趙萃+王振

[摘要] 目的 建立以2，4-二叔丁基苯酚為內(nèi)標(biāo)的高效液相色譜法測定丙泊酚血藥濃度方法。 方法 血清樣品用乙腈-甲醇（75：25）混合液蛋白沉淀后取上清液進樣分析，以2，4-二叔丁基苯酚為內(nèi)標(biāo)，采用UltimateRXB-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），以水（H3PO4調(diào)pH=1.8）-乙腈（70∶30）為流動相，流速1.5 mL/min，檢測激發(fā)波長270 nm。結(jié)果 該法專屬性高，回收率高，日內(nèi)日間RSD低。丙泊酚血藥濃度在0.2～10.0 mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r2=0.9998），最低檢測濃度0.2970 mg/L。 結(jié)論 本方法測定丙泊酚濃度方便、快捷、準(zhǔn)確度好、精密度高，為開展血藥濃度檢測、藥動學(xué)研究提供方法學(xué)依據(jù)。

[關(guān)鍵詞] 丙泊酚；高效液相色譜法；血藥濃度；2，4-二叔丁基苯酚

[中圖分類號] R614 [文獻標(biāo)識碼] B [文章編號] 1673-9701（2017）20-0105-04

[Abstract] Objective To establish a detecting method of propofol plasma concentration by HPLC with 2， 4-ditert-butyl phenol as internal standard. Methods The supernatant of serum samples were analyzed after protein precipitation by acetonitrile-methyl alcohol（75∶25） mixed liquor. With 2， 4-ditert-butyl phenol as internal standard， UltimateR XB-C18 chromatographic column（4.6 mm×250 mm， 5 μm） was used. Water（H3PO4， pH=1.8）-acetonitrile（70∶30） was used as mobile phase， flow velocity=1.5 mL/min， and detecting excitation wave length=270 nm. Results This method had high specificity and recovery， with low intra-day and inter-day RSD. When the plasma concentration of propofol was between 0.2～10.0 mg/L， it showed a good linear relation（r2=0.9998）， and the lower limit of detection was 0.2970 mg/L. Conclusion This method is convenient and speedy， with high accuracy and precision， providing a methodological basis for plasma concentration detection and pharmacokinetic research.

[Key words] Propofol； HPLC； Plasma concentration； 2， 4-ditert-butyl phenol

丙泊酚（propofol），2，6-二異丙基苯酚，又名異丙酚，是速效短效靜脈麻醉藥。近年來，國內(nèi)外有關(guān)丙泊酚藥物代謝動力學(xué)的研究較多[1-4]，但未見丙泊酚應(yīng)用于結(jié)核性膿胸患者的藥動學(xué)研究。為開展該研究，為臨床麻醉合理使用丙泊酚提供依據(jù)，本文建立了以2，4-二叔丁基苯酚為內(nèi)標(biāo)的高效液相色譜法測定丙泊酚血藥濃度?，F(xiàn)報道如下。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

Agilent 1200高效液相色譜儀（美國，Agilent），配有G1311A四元泵、G1315D紫外檢測器、G1329A型進樣器（配有20 μL 進樣環(huán)）、G1316A柱溫箱和Agilent化學(xué)工作站；XS205 Dual Range分析天平（瑞士，Mettler Toledo）；Mettler Toledo Delta 320 pH計（瑞士，Mettler Toledo）；高速離心機（美國，Thermo Fisher）；Barnstead TII超純水系統(tǒng)（美國，Thermo Fisher）；-80℃冰箱（日本，SANYO）。

1.2 藥品與試劑

丙泊酚注射液（規(guī)格：200 mg/支，批號：AJ059）、丙泊酚對照品（日本東京化成工業(yè)株式會社生產(chǎn)，規(guī)格：25 g，批號：ZR28L-FK，純度>98.0%）；內(nèi)標(biāo)：2，4-二叔丁基苯酚（北京百靈威科技有限公司生產(chǎn)，規(guī)格：100 g，批號：LI200111，純度≥99.5%）；色譜級乙腈和甲醇從美國天地公司購得，本文中其他所有分析級化學(xué)品均由天津永大化學(xué)試劑有限公司購得；實驗用超純水均由美國賽默飛世爾Barnstead TII 超純水系統(tǒng)純化制得。

2 方法

2.1 色譜條件

色譜柱：UltimateRXB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm，月旭材料科技有限公司），流動相：水（H3PO4調(diào)pH=1.8）-乙腈（70∶30）；檢測波長：270 nm；柱溫：30℃；流速：1.5 mL/min；進樣量：10 μL。

2.2 試驗溶液的制備

2.2.1 稀釋液 乙腈-甲醇（75：25）。

2.2.2 丙泊酚對照品溶液 精密稱取40.00 mg丙泊酚對照品至10 mL容量瓶中，用稀釋液溶解，定容至刻度；精密移取上述溶液1.0 mL至100 mL容量瓶中，用稀釋液定容至刻度，搖勻，待用。

2.2.3 2，4-二叔丁基苯酚儲備液 精密稱取10.00 mg 2，4-二叔丁基苯酚對照品至10 mL容量瓶中，用稀釋液溶解，定容至刻度。

2.2.4 2，4-二叔丁基苯酚對照品溶液 精密移取2，4-二叔丁基苯酚儲備液1.0 mL至100 mL容量瓶中，用稀釋液定容至刻度，搖勻，待用。

2.3 血樣處理

取出存放在-80 ℃冰箱中血樣，室溫解凍后取血樣400 μL，加入10 μL 內(nèi)標(biāo)2，4-二叔丁基苯酚儲備液，590 μL 稀釋液，渦旋5 min，2000 g離心15 min，取上層清液進樣。

2.4 方法專屬性實驗

取空白血樣400 μL，加入600 μL 稀釋液，渦旋5 min，2000 g離心15 min，取上層清液進樣，得空白血清色譜圖1A，將一定濃度的丙泊酚標(biāo)準(zhǔn)品及內(nèi)標(biāo)加入空白血清，按2.3項操作得色譜圖1B，受試者注射丙泊酚后，同法操作，得色譜圖1C，可見丙泊酚與內(nèi)標(biāo)2，4-二叔丁基苯酚的保留時間分別為6.65 min和10.67 min，兩者峰形良好，分離完全，理論塔板數(shù)按丙泊酚計算不低于14 837。

3 結(jié)果

3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

取丙泊酚對照品，配制成濃度分別為0.2、0.5、0.8、1.0、2.0、5.0、10.0 mg/L。以丙泊酚的濃度（X）為橫坐標(biāo)，丙泊酚的峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為：Y=3.2733X-0.1223（r2=0.9998）。定量下限為0.2 mg/L。見圖2。

3.2 回收率試驗

取空白血清加入丙泊酚對照品，制備成濃度分別為0.5、1.0、10.0 mg/L 的質(zhì)量控制血清樣品，各5份，按照2.3項下方法操作，進樣測定，計算回收率，結(jié)果見表1。

3.3 精密度試驗

取空白血清，加入丙泊酚對照品，制備成濃度分別為0.5、1.0、10.0 mg/L 的質(zhì)量控制血清樣品，各5份，按照2.3項下方法操作，1 d內(nèi)重復(fù)測定5次，以測定日內(nèi)RSD。另取上述不同濃度的血清樣品，同樣處理，每日測定1次，重復(fù)測定5 d，以測定日間RSD，結(jié)果見表1。

3.4 臨床樣品準(zhǔn)備

胸外科結(jié)核性膿胸住院手術(shù)患者10例，年齡27～63歲，體重47～63.5 kg，1%丙泊酚按2 mg/kg的劑量單次靜脈給予，20 s注射完畢，分別于給藥結(jié)束后2、4、6、8、10、15、20、30、60、90 min通過橈動脈測壓管采動脈血1.5 mL，分離血清，存放在-80℃冰箱中，測定丙泊酚血藥濃度。結(jié)果見圖3。

4討論

結(jié)核病嚴(yán)重影響人民健康，是我國重點防治疾病之一[5]。對結(jié)核性膿胸及時、準(zhǔn)確的診斷和有效的治療，不僅有利于患者健康，而且對消除傳染源、控制結(jié)核病流行起重要的作用。近年來結(jié)核性膿胸的發(fā)病有所增加，并且出現(xiàn)了耐藥菌，通過外科手術(shù)治療方法對患者的病灶給予清除，以達到縮短療程、治愈的目的[6-9]。丙泊酚是臨床上常用的麻醉藥[10，11]，其起效快，作用時間短，且麻醉后舒適感較好，是胸外科結(jié)核性膿胸患者靜脈麻醉首選藥物，還廣泛用于無痛腸鏡、無痛胃鏡檢查以及無痛人工流產(chǎn)術(shù)和重癥監(jiān)護室鎮(zhèn)靜等。近年來，丙泊酚濃度測定及藥物代謝動力學(xué)研究較多，測定丙泊酚血藥濃度對指導(dǎo)臨床合理用藥具有重要的意義。丙泊酚血藥濃度的測定方法主要有高效液相色譜法（HPLC）[12]、氣-質(zhì)聯(lián)用（GC/MS）[13]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）[14]。后兩種方法的靈敏度較高、特異性強、所需樣品量少，但儀器設(shè)備較昂貴，難以普及推廣。在高效液相色譜法中，電化學(xué)和二極管陣列檢測法國內(nèi)應(yīng)用較少。目前文獻報道的高效液相色譜法主要有高效液相-紫外檢測法（HPLC UV）、高效液相-熒光檢測法（HPLC Flu）。為適應(yīng)臨床藥代動力學(xué)研究的需要，本實驗室經(jīng)過色譜條件、內(nèi)標(biāo)確立和流動相的選擇、方法專屬性實驗等研究建立測定人血漿中丙泊酚濃度的方法，以2，4-二叔丁基苯酚為內(nèi)標(biāo)高效液相色譜法測定丙泊酚濃度。

本實驗以2，4-二叔丁基苯酚為內(nèi)標(biāo)高效液相色譜法測定丙泊酚血漿藥物濃度，該方法簡單、易行、可重復(fù)。雖然質(zhì)譜法檢測丙泊酚血藥濃度在很多研究中使用，但由于質(zhì)譜設(shè)備昂貴，很多實驗室還沒有該設(shè)備[15，16]。研究報告顯示高效液相色譜法甚至可以與質(zhì)譜法達到相近的定量下限[17]。

本實驗樣品預(yù)處理方法選擇乙腈-甲醇（75∶25）混合液蛋白沉淀法，較萃取法簡單，并且不需要大量的有機溶劑如環(huán)己烷、氯仿-乙酸乙酯混合液[18，19]，也不需要花費昂貴的試劑盒[14]。流動相選用水（H3PO4 調(diào)pH=1.8）-乙腈（70∶30）時，丙泊酚和2，4-二叔丁基苯酚內(nèi)標(biāo)出峰時間合理，色譜峰形理想，而當(dāng)采用三氟乙酸調(diào)節(jié)水pH值時，雖然出峰時間合理，但色譜圖中基線不穩(wěn)定。血中代謝物質(zhì)和其他內(nèi)源性物質(zhì)的峰均不干擾丙泊酚的測定，說明該方法具有較高的專屬性。

本方法測定丙泊酚濃度方便快捷，一天可以檢測完10例患者的100個血樣，臨床樣品測定結(jié)果表明，丙泊酚2 mg/kg 靜脈注射后2、4、6、8、10、15 min的平均血藥濃度與吳健等[20]報道的接近。該法檢測到最低濃度為0.2970 mg/L，靈敏度高，可滿足臨床藥動學(xué)研究需要，為開展血藥濃度檢測、藥代學(xué)研究提供方法學(xué)依據(jù)。

總之，以2，4-二叔丁基苯酚為內(nèi)標(biāo)高效液相色譜法測定丙泊酚在結(jié)核性膿胸患者血漿藥物濃度可行、方便，準(zhǔn)確，能夠為臨床合理使用該藥物提供依據(jù)。

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（收稿日期：2017-05-03）