姜黃素胡椒堿復(fù)配對(duì)拘束應(yīng)激肝損傷的緩解作用

柏利霞，張焜，招敏聰，文哲，趙俊峰，杜志云

（廣東工業(yè)大學(xué)天然藥物與綠色化學(xué)研究所，廣東廣州510006）

姜黃素胡椒堿復(fù)配對(duì)拘束應(yīng)激肝損傷的緩解作用

柏利霞，張焜，招敏聰，文哲，趙俊峰，杜志云*

（廣東工業(yè)大學(xué)天然藥物與綠色化學(xué)研究所，廣東廣州510006）

以聚乙烯吡咯烷酮（Polyvinylpyrrolidone，PVP）為載體，制備姜黃素胡椒堿復(fù)配物（質(zhì)量比為5：1）固體制劑，以姜黃素PVP固體分散體和姜黃素作為參比制劑，研究姜黃素胡椒堿復(fù)配固體制劑對(duì)拘束應(yīng)激導(dǎo)致的小鼠肝損傷的緩解作用。研究結(jié)果表明，姜黃素+胡椒堿PVP包合物組、姜黃素PVP包合物組、及姜黃素組均可以降低由拘束應(yīng)激導(dǎo)致的血漿ALT、AST活性和肝臟MDA含量的增加，增強(qiáng)肝臟組織中GSH-PX、SOD、CAT的活性，其中姜黃素+胡椒堿PVP包合物組最為顯著。由此可以得出黃素胡椒堿復(fù)配固體制劑能顯著改善拘束應(yīng)激導(dǎo)致的小鼠肝臟損傷，姜黃素的藥用功效增強(qiáng)的原因可能是由于胡椒堿能夠增加姜黃素的生物利用度和PVP固體制劑的制備能夠增加姜黃素胡椒堿復(fù)配物的水溶性。

姜黃素；胡椒堿；固體制劑；肝損傷

隨著現(xiàn)代人們生活工作方式的改變，人們承受著環(huán)境變化、生活習(xí)慣改變及物理化學(xué)等各種應(yīng)激源帶給心理的壓力。既往研究表明，壓力會(huì)引發(fā)許多心理和生理健康問題和疾病[1]。當(dāng)機(jī)體經(jīng)受長期或者高強(qiáng)度的精神壓力時(shí)，體內(nèi)代謝便會(huì)失衡，產(chǎn)生各種各樣的壓力型疾病[2]。肝臟是人體主要的排毒器官，清理病原體、有毒化學(xué)物質(zhì)和體內(nèi)的代謝廢物，它通過調(diào)節(jié)生理系統(tǒng)來維持體內(nèi)平衡[3]。肝臟是氧化應(yīng)激攻擊的主要器官，所以開發(fā)潛在的健康產(chǎn)品緩解壓力疾病保持健康提高生活質(zhì)量是非常有必要的。

姜黃素（Curcumin）是中藥姜黃（Curcuma longa L.）的主要活性成分，為植物界中稀少的具有二酮結(jié)構(gòu)的天然酚類色素，其結(jié)構(gòu)如圖1所示。

姜黃素具有抗氧化、抗炎、保肝護(hù)肝、抗心血管疾病、抗腫瘤、抗菌等藥理活性[4]。但是姜黃素存在著水溶性差、穩(wěn)定性差、體內(nèi)不易被吸收、生物利用度低等缺點(diǎn)[5]，這致使姜黃素的應(yīng)用研究受到限制。胡椒堿屬于桂皮酞胺類生物堿，是一種天然的生物利用度增強(qiáng)劑，廣泛存在于植物中，且其具有穩(wěn)定性強(qiáng)、藥用安全等優(yōu)點(diǎn)[6]。Singh S等[7]研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素和胡椒堿按質(zhì)量比10∶1復(fù)配，可以提高姜黃素對(duì)3-NP所誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性的保護(hù)作用，這是由于姜黃素聯(lián)合胡椒堿增加了生物利用度，導(dǎo)致其保護(hù)作用增強(qiáng)。固體分散體技術(shù)主要用于增加難溶性藥物的溶解度和溶出速率，從而提高生物利用度。其常用的載體有羧丙基纖維素（Hydroxypropyl cellulose,HPC）、甘露醇、聚乙二醇（Polyethylene glycol,PEG）4000或6000、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）等。本試驗(yàn)以PVP為載體，將姜黃素胡椒堿復(fù)配物制成固體分散體，以姜黃素固體分散體和姜黃素為參比制劑，研究姜黃素胡椒堿復(fù)配固體制劑對(duì)拘束應(yīng)激導(dǎo)致的肝損傷的緩解作用。

圖1 姜黃素結(jié)構(gòu)Fig.1 The chemical structure of curcumin

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

姜黃素、胡椒堿（分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、羧甲基纖維素鈉（CMC）：亞什蘭輔料公司；谷丙轉(zhuǎn)氨酶（Polyethylene glycol,ALT）試劑盒、谷草轉(zhuǎn)氨酶（Polyethylene glycol,AST）試劑盒、丙二醛（Methane Dicarboxylic Aldehyde,MDA）試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-PX）試劑盒、超氧化物岐化酶（superoxide dismutase，SOD）試劑盒、過氧化氫酶（catalase，CAT）試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒：南京建成生物工程研究所；Lambda 25紫外-可見分光光度計(jì)：美國PERKINELMER公司；D2F-6090真空干燥箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；R-1001N旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：鄭州長城科工貿(mào)有限公司；SpectraMax Paradigm酶標(biāo)儀：澳大利亞Molecular Devices公司；JB-409六聯(lián)雙排數(shù)顯恒溫磁力攪拌器：常州普天儀器制造有限公司。

1.2 樣品的制備

1.2.1 姜黃素+胡椒堿PVP固體制劑的制備

將分析純姜黃素與胡椒堿按質(zhì)量比5∶1的比例復(fù)配，再將姜黃素胡椒堿復(fù)配物與PVP按質(zhì)量比1∶9加入無水乙醇中，超聲至全部溶解，置于六聯(lián)雙排磁力攪拌器避光攪拌3 h，45℃條件下用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓蒸發(fā)除去乙醇，再放50℃真空干燥箱中干燥24 h，粉碎，過 5 號(hào)篩[80 目，（180±7.6）μm]后保存在干燥器中備用。

1.2.2 姜黃素PVP固體制劑的制備

將分析純姜黃素與PVP按質(zhì)量比1∶9的比例加入到無水乙醇中，超聲至全部溶解，置于六聯(lián)雙排磁力攪拌器避光攪拌3 h，45℃條件下用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓蒸發(fā)除去乙醇，再放50℃真空干燥箱中干燥24 h，粉碎，過 5 號(hào)篩[80 目，（180±7.6）μm]后保存在干燥器中備用。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及模型

雄性昆明鼠，共50只，6周～8周齡，購自廣東中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物中心。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均在清潔級(jí)層流架中飼養(yǎng)，維持飼養(yǎng)溫度在（23±2）℃，照明時(shí)間設(shè)置為每天 12 h（07：00～19：00），所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后再進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。隨機(jī)分成空白對(duì)照組、拘束應(yīng)激模型組、姜黃素+胡椒堿PVP包合物組（姜黃素胡椒堿復(fù)配物含量100 mg/kg）、姜黃素PVP包合物組（姜黃素含量100 mg/kg）及姜黃素組（100 mg/kg），每組10只動(dòng)物。對(duì)于實(shí)驗(yàn)組小鼠，每天下午3：00～4：00對(duì)小鼠按預(yù)定劑量進(jìn)行灌胃給藥1次，連續(xù)給藥7 d。姜黃素胡椒堿包合物、姜黃素包合物及姜黃素都溶于0.5%的CMC中。同時(shí)，正常對(duì)照組與拘束應(yīng)激模型組小鼠給予等量的0.5%CMC。在最后一次給藥當(dāng)天，除正常對(duì)照組外，其余各組小鼠置于透氣的拘束裝置中進(jìn)行拘束應(yīng)激 18 h（15：00～09：00），拘束裝置參考文獻(xiàn)[8]改制。實(shí)驗(yàn)期間，所有動(dòng)物禁食禁水。拘束后對(duì)小鼠進(jìn)行體重統(tǒng)計(jì)，乙醚麻醉小鼠，提取肝臟組織和心臟取血，稱重后置冰上有待測定相關(guān)實(shí)驗(yàn)指標(biāo)。

1.4 病理學(xué)切片

將新鮮的肝臟組織置于4%的對(duì)聚甲醛中固定24 h，然后嵌入石蠟中進(jìn)行包埋。被石蠟包埋的組織切片，后進(jìn)行HE染色。制作好的病理學(xué)切片在200倍光鏡的光學(xué)顯微鏡（Olympus IX71，Tokyo，Japan）下進(jìn)行觀察，評(píng)估其病變程度[9]。

1.5 血漿AST、ALT活性

將所取的全血置于用肝素鈉處理過的離心管，用離心機(jī)以7 000 r/min離心5 min分離血漿，測定血漿AST、ALT活性，血漿ALT和AST的活性是由賴氏（Reitman and Frankel）商業(yè)試劑盒測定，以SpectraMax Paradigm型酶標(biāo)儀（Molecular Devices,Austrial）在510 nm下測定其吸光度，計(jì)算出AST與ALT的活性。

1.6 肝臟組織MDA水平測定

將新鮮取出的肝臟組織按照質(zhì)量容積比1∶9加入生理鹽水，在冰浴下用組織勻漿器，制成10%肝臟勻漿。勻漿后，在4℃下用冷凍離心機(jī)以9 000 r/min離心10 min，取上清液，用BCA蛋白定量試劑盒測定上清液蛋白含量。使用MDA商業(yè)試劑盒來進(jìn)行測定，其原理為MDA在酸性和高溫度條件下，可以與硫代巴比妥酸（TBA）反應(yīng)生成紅棕色的反應(yīng)物（3，5，5-trimethyloxazolidine-2，4-dione），使用紫外-可見分光光度計(jì)在510 nm波長下測定MDA水平。

1.7 肝臟組織GSH-PX、SOD、CAT活性測定

將新鮮取出的肝臟組織按照質(zhì)量容積比1∶9加入生理鹽水，在冰浴下用組織勻漿器，制成10%肝臟勻漿。勻漿后，在4℃下用冷凍離心機(jī)以9 000 r/min離心10 min，取上清液，用BCA蛋白定量試劑盒測定上清液蛋白含量。

使用GSH-PX測定試劑盒檢測GSH-PX活性，通過檢測GSH-PX在酶促反應(yīng)中消耗的GSH-PX的速度即可得出GSH-PX活性。使用SpectraMax Paradigm型酶標(biāo)儀在412 nm處測定吸光度計(jì)算GXH-PX活性。

使用SOD測定試劑盒檢測SOD活性，其原理為超氧陰離子能與氧化羥胺形成亞硝酸鹽，后者能與顯色劑反應(yīng)生成紫紅色反應(yīng)物，可用SpectraMax Paradigm型酶標(biāo)儀在550 nm處測定吸光度并進(jìn)行活性測定。

使用CAT測定試劑盒檢測CAT活性，其原理為過氧化氫能與鉬酸銨作用并產(chǎn)生一種淡黃色的絡(luò)合物，通過SpectraMax Paradigm型酶標(biāo)儀在405 nm處測定吸光度能計(jì)算出CAT活性。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有試驗(yàn)結(jié)果均為3次以上試驗(yàn)的平均結(jié)果，試驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS13.0軟件，利用Dunnett’s檢驗(yàn)和ANOVA檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，p＜0.05即具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著意義。

2 結(jié)果

2.1 肝臟組織病理學(xué)分析

病理學(xué)分析結(jié)果如圖2所示。

空白組組織形態(tài)完整，細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)比例較小，肝臟細(xì)胞排列均勻，無大面積細(xì)胞壞死與炎癥浸潤；模型組小鼠肝臟細(xì)胞排列紊亂，出現(xiàn)點(diǎn)狀壞死區(qū)域與炎細(xì)胞浸潤，這表明18 h的拘束應(yīng)激能導(dǎo)致小鼠肝臟損傷。姜黃素組、姜黃素PVP包合物組、姜黃素+胡椒堿PVP包合物組小鼠肝臟細(xì)胞損傷及炎癥浸潤都有不同程度的減輕，其中姜黃素+胡椒堿PVP包合物組對(duì)肝損傷的緩解作用最為顯著。

圖2 病理學(xué)分析結(jié)果（，n=10）Fig.2 Pathology analysis results（，n=10）

2.2 對(duì)拘束應(yīng)激小鼠血漿ALT、AST活性的影響

姜黃素胡椒堿對(duì)拘束應(yīng)激小鼠血漿ALT、AST活性見表1。

表1 姜黃素胡椒堿對(duì)拘束應(yīng)激小鼠血漿ALT、AST活性（，n=10）Table 1 Effect of curcumin and piperine on the activities of ALT and AST in plasma in liver of restraint-stressed mice（，n=10）

表1 姜黃素胡椒堿對(duì)拘束應(yīng)激小鼠血漿ALT、AST活性（，n=10）Table 1 Effect of curcumin and piperine on the activities of ALT and AST in plasma in liver of restraint-stressed mice（，n=10）

注：與空白組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（#p＜0.01，##p＜0.001），與模型組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001）。

分組ALT/（U/mgprot）AST/（U/mgprot）空白組 7.67±1.32 30.29±5.58模型組 34.28±3.90## 56.10±3.79#姜黃素組 29.99±5.92* 53.39±2.47姜黃素 PVP 包合物組 23.40±3.73* 50.53±5.64*姜黃素+胡椒堿PVP包合物組 10.69±0.92*** 40.80±12.73**

由表1顯示，與正常組相比，模型組小鼠血漿中ALT、AST 的活性均顯著提高（p＜0.05），這表明 18 h的拘束應(yīng)激能導(dǎo)致小鼠肝臟損傷。與模型組相比較，姜黃素組、姜黃素PVP組、姜黃素+胡椒堿PVP包合物組均能降低小鼠血漿ALT、AST活性水平，緩解拘束應(yīng)激導(dǎo)致的肝臟損傷，而姜黃素+胡椒堿PVP包合物組作用更為突出（p＜0.05）。

2.3 對(duì)拘束應(yīng)激小鼠肝臟MDA水平的影響

姜黃素胡椒堿對(duì)拘束應(yīng)激小鼠肝臟MDA含量的影響見表2。

表2 姜黃素胡椒堿對(duì)拘束應(yīng)激小鼠肝臟MDA含量的影響（s，n=10）Table 2 Effects of curcumin and piperine on the content of MDA in liver of restraint-stressed mice.（，n=10）

表2 姜黃素胡椒堿對(duì)拘束應(yīng)激小鼠肝臟MDA含量的影響（s，n=10）Table 2 Effects of curcumin and piperine on the content of MDA in liver of restraint-stressed mice.（，n=10）

注：與空白組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（#p＜0.01），與模型組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（*p＜0.05，**p＜0.01）。

分組肝臟MDA/（nmol/mgprot）空白組 1.45±0.25模型組 3.27±0.26#姜黃素組 3.10±0.29*姜黃素PVP包合物組 2.93±0.05*姜黃素+胡椒堿PVP包合物組 2.05±0.17**

由表2得出，與正常組相比較，模型組小鼠肝臟中MDA水平顯著升高（p＜0.01），這表明18 h拘束應(yīng)激導(dǎo)致小鼠肝臟出現(xiàn)脂質(zhì)過氧化。與模型組相比較，姜黃素組、姜黃素PVP組、姜黃素+胡椒堿PVP包合物組均能降低小鼠肝臟MDA水平，抑制肝臟組織的脂質(zhì)過氧化，且姜黃素+胡椒堿PVP包合物組對(duì)MDA水平的降低作用更為顯著（p＜0.01）。

2.4 對(duì)拘束應(yīng)激小鼠肝臟抗氧化酶GSH-PX、SOD、CAT活性的影響

姜黃素胡椒堿對(duì)拘束應(yīng)激小鼠肝臟中抗氧化酶GSH-PX、SOD、CAT活性的影響見圖3。

圖3 姜黃素胡椒堿對(duì)拘束應(yīng)激小鼠肝臟中抗氧化酶GSH-PX、SOD、CAT 活性的影響（，n=10）Fig.3 Effects of curcumin and piperine on GSH-PX，SOD，CAT activities in liver of restraint-stressed mice.（，n=10）

圖3顯示，與正常組相比較，模型組小鼠肝臟中抗氧化酶 GSH-PX、SOD、CAT 活性顯著降低（P＜0.01），這表明18 h拘束應(yīng)激會(huì)降低小鼠肝臟中抗氧化酶活性，致使小鼠肝臟受到氧化損傷。與模型組相比較，姜黃素組、姜黃素PVP組、姜黃素+胡椒堿PVP包合物組均能對(duì)拘束應(yīng)激導(dǎo)致的過氧化酶活性的降低有一定的改善作用（p＜0.05），降低肝臟遭受氧化損傷。且姜黃素+胡椒堿PVP包合物組對(duì)過氧化酶活性降低的改善作用更為顯著（p＜0.05）。

3 討論

肝臟疾病是威脅人們身體健康的重大疾病之一，肝臟疾病形成的原因有很多。近年來隨著社會(huì)的發(fā)展，人們遭受越來越多的來自生活和工作的壓力，這些壓力會(huì)擾亂人們生理穩(wěn)態(tài)，誘發(fā)了大量的心理和生理障礙[10]。之前的研究表明，拘束應(yīng)激增加外源性物質(zhì)的入侵，抑制脂質(zhì)和糖代謝，從而引發(fā)肝臟損傷[11-12]。拘束應(yīng)激所誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激是一種被廣泛使用的氧化應(yīng)激模型[13]。拘束應(yīng)激導(dǎo)致肝臟疾病的主要機(jī)理是過量的活性氧（reactive oxygen species，ROS）致使肝臟中穩(wěn)定的氧化還原過程被破壞，ROS的生成和消除失去平衡，肝臟中堆積大量的ROS，從而引發(fā)脂質(zhì)過氧化，破壞肝臟細(xì)胞的結(jié)構(gòu)與完整性，導(dǎo)致肝臟損傷[14]。以往研究表明，姜黃素具有很好的體外抗氧化活性，但其具有不溶于水、在體內(nèi)不易被吸收利用、生物利用度低等缺點(diǎn)。研究表明胡椒堿可以從吸收、代謝等多種途徑來提高一些吸收差、生物利用度低的藥物的藥效。A Sehgal等[15]發(fā)現(xiàn)，姜黃素胡椒堿復(fù)配可以改善苯并芘誘導(dǎo)的DNA損傷，這是由于胡椒堿可以很好的抑制肝臟和腸道的芳基碳?xì)浠衔锪u基化和葡萄苷酸化，提高治療姜黃素的生物利用度以及藥理活性。Suresh等[16]發(fā)現(xiàn)，每天給予大鼠姜黃素胡椒堿復(fù)配物（質(zhì)量比25∶1）500mg/kg，可以將姜黃素吸收率由60%～66%上升至78%。韓剛等[17]發(fā)現(xiàn)，以PVP為載體，制備姜黃素固體分散體可以有效的提高姜黃素在大鼠體內(nèi)的生物利用度。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)小鼠進(jìn)行18 h的拘束負(fù)荷，導(dǎo)致小鼠血漿ALT、AST活性水平和MDA含量的顯著增加，肝臟組織發(fā)生病理損傷。同時(shí)肝臟內(nèi)存在由GSH-PX、SOD、CAT 3種抗氧化酶組成的抗氧化防御系統(tǒng)，可以及時(shí)清理不斷生成的自由基，阻斷自由基的鏈?zhǔn)椒糯蠓磻?yīng)，保護(hù)肝臟免受氧化損傷[18]。拘束應(yīng)激導(dǎo)致GSH-PX、SOD、CAT的活性降低，降低了肝臟細(xì)胞防御體系的抗氧化能力，致使肝臟遭受氧化損傷。在給予口服姜黃素胡椒堿復(fù)配PVP包合物、姜黃素PVP包合物、姜黃素后，其血漿ALT、AST活性和肝臟MDA含量均有不同程度的降低，肝臟中的GSH-PX、SOD、CAT 3種抗氧化酶活性也得到了不同程度的緩解，其中姜黃素胡椒堿復(fù)配PVP包合物組對(duì)肝臟氧化損傷的保護(hù)作用最強(qiáng)，姜黃素PVP包合物組效果其次，姜黃素組的效果最差。PVP分子中既含有極性較大的內(nèi)酰胺基，又含有非極性的亞甲基，這使得PVP對(duì)難溶于水的姜黃素增溶作用較強(qiáng)。以PVP為載體，制成固體分散體，提高了姜黃素在小鼠體內(nèi)的生物利用度。研究顯示，胡椒堿也具有一定的抗氧化活性，同時(shí)也能通過抑制藥物代謝酶活性來提高姜黃素的生物利用度。所以姜黃素胡椒堿復(fù)配PVP包合物對(duì)拘束應(yīng)激小鼠肝損傷緩解作用最強(qiáng)。

總之，本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)姜黃素胡椒堿復(fù)配固體制劑能明顯提高姜黃素對(duì)拘束應(yīng)激肝損傷的緩解作用，可能是因?yàn)榕c胡椒堿復(fù)配可以提高腸道對(duì)姜黃素的吸收，與PVP的包合可以增加姜黃素的水溶性，增加機(jī)體對(duì)姜黃素的吸收。由此，通過與胡椒堿的復(fù)配和PVP的包合可以增加姜黃素的藥理效果，這為開發(fā)新型高效的保肝護(hù)肝藥物、保健品提供了新思路。

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Curcumin Combined Piperine Attenuates Restraint Stress Provoked Liver Injury

BAI Li-xia，ZHANG Kun，ZHAO Min-cong，WEN Zhe，ZHAO Jun-feng，DU Zhi-yun*
（Institute of Medicine and Green Chemistry，Guangdong University of Technology，Guangzhou 510006，Guangdong，China）

Within polyvinylpyrnolidone （PVP）as the carrier，using curcumin combined piperine distribution（5 ∶1）solid preparation of PVP，in curcumin solid dispersion and curcumin as the reference preparation，to research curcumin combined piperine with solid preparation attenuates restraint stress provoked liver injury in mice.The research results showed that curcumin+piperine PVP inclusion compound group，PVP inclusion compound curcumin and curcumin group could reduce plasma ALT，AST activities and the content of liver MDA，caused by restraint stress.and increase of the activities of GSH-PX，SOD and CAT in liver.The group of curcumin and piperine PVP inclusion compound was most significant.Thus，curcumin combined piperine with solid preparation could significantly inhibited restraint stress provoked liver injury in mice，this was because the piperine could increase the bioavailability of curcumin，the preparation of PVP solid preparation could increase the ratio of curcumin piperine after the solubility in water.

curcumin；piperine；solid preparation；liver injury

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.17.043

2016-12-16

柏利霞（1992—），女（漢），碩士研究生在讀，從事天然產(chǎn)物與綠色化學(xué)研究。

*通信作者