櫻桃汁飲料中花青素的快速測定方法

安春志，王有志

（廣東南華工商職業(yè)學(xué)院，廣東廣州510507）

櫻桃汁飲料中花青素的快速測定方法

安春志，王有志

（廣東南華工商職業(yè)學(xué)院，廣東廣州510507）

建立一種快速、有效的高效液相色譜法，測定櫻桃汁飲料中芍藥素-3-葡萄糖苷、錦葵定-3-葡萄糖苷的方法。樣品經(jīng)0.5%鹽酸乙醇提取后，采用C18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）分離，以乙腈-5%磷酸梯度洗脫的條件下，用PDA檢測器檢測，外標(biāo)法峰面積定量。結(jié)果表明，芍藥素-3-葡萄糖苷、錦葵定-3-葡萄糖苷標(biāo)液在20.0 μg/mL～200.0 μg/mL濃度范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)r2為0.999，芍藥素-3-葡萄糖苷檢出限為40 mg/kg，定量限為120 mg/kg，錦葵定-3-葡萄糖苷檢出限為50 mg/kg，定量限為150 mg/kg，兩個目標(biāo)物的加標(biāo)回收率為88.4%～92.6%。該方法具有前處理簡單、檢測速度快的優(yōu)點，適用于櫻桃汁飲料中芍藥素-3-葡萄糖苷、錦葵定-3-葡萄糖苷的定量檢測。

櫻桃汁；花青素；高效液相色譜

花青素（anthocyanins）又稱花色素，是一類廣泛存在于植物中的水溶性天然色素，屬黃酮類化合物[1]，多以糖苷的形式存在，植物中常見花青素的化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖1。

圖1 植物中常見花青素的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structure of common anthocyanidins in plants

如圖1所示，花青素作為一種天然食用色素，安全、無毒、資源豐富，而且具有一定的營養(yǎng)作用，在食品、化妝、醫(yī)藥等方面有著巨大的應(yīng)用潛力[2-6]?；ㄇ嗨厥瞧駷橹顾l(fā)現(xiàn)的最強效的自由基清除劑，具有抗氧化、抗癌、促進視紅素再合成等多種生理活性。櫻桃中所含有的花青素十分豐富，由櫻桃制成的櫻桃汁飲料中也含有花青素。櫻桃中一般含有的花青素是芍藥素-3-葡萄糖苷、錦葵定-3-葡萄糖苷這兩種[7-9]，但是針對櫻桃汁飲料中這兩種花青素的研究較少，所以本試驗針對這兩種花青素來研究相應(yīng)的檢測方法。

目前，關(guān)于花青素的分析方法目前用得較多的是紫外分光光度法和HPLC法等[10-12]。紫外分光光度法一般測定是樣品中花青素總的含量，缺點是不能確定單一組分的含量，易受到有色物質(zhì)的干擾等。高效液相色譜法為現(xiàn)在常用的檢出方法，但是在前處理的步驟上繁瑣，費時，試驗的成本較大。本試驗在原有的高效液相色譜法的基礎(chǔ)上，對前處理步驟進行改進，并對檢測條件進行優(yōu)化，能對櫻桃汁飲料中芍藥素-3-葡萄糖苷、錦葵定-3-葡萄糖苷的各個組分的含量能夠做到快速、準(zhǔn)確的檢測。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

2695型高效液相色譜系統(tǒng)、2998型PDA檢測器：美國Waters；芍藥素-3-葡萄糖苷、錦葵定-3-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)品：國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心。

1.2 色譜條件

色譜柱：C18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流速：1.0 mL/min；進樣量：10 μL；柱溫：25 ℃。

1.3 試驗方法

1.3.1 色譜條件的優(yōu)化

固定流動相流速1.0 mL/min，配制不同體系的流動相體系，流動相Ⅰ：甲醇-5%磷酸溶液（體積比為25∶75）；流動相Ⅱ：甲醇-5%乙酸溶液（體積比為 25∶75）；流動相Ⅲ：乙腈-5%磷酸溶液（體積比為 25∶75）；流動相Ⅳ：乙腈-5%乙酸溶液（體積比為25∶75），考察4種流動相對芍藥素-3-葡萄糖苷、錦葵定-3-葡萄糖苷色譜行為的影響；并優(yōu)化合適的洗脫模式，使得目標(biāo)峰的出峰時間合適，分離度較好，峰形尖銳、對稱。

1.3.2 檢測波長的選擇

本試驗采用PDA檢測器進行全波長掃描（掃描范圍200 nm～600 nm），根據(jù)芍藥素-3-葡萄糖苷、錦葵定-3-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)品的響應(yīng)值，選擇比較合適的檢測波長。

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

稱取相應(yīng)質(zhì)量的芍藥素-3-葡萄糖苷、錦葵定-3-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)品，配制成濃度為 20.0、40.0、80.0、100.0、200.0 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液，進行儀器分析，以峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.4 樣品提取溶劑的選擇

根據(jù)芍藥素-3-葡萄糖苷、錦葵定-3-葡萄糖苷的理化特點，試驗比較蒸餾水、0.5%檸檬酸、0.5%鹽酸、0.5%鹽酸乙醇、0.5%鹽酸丙三醇等5種提取溶劑的提取效果。

1.3.5 加標(biāo)回收試驗

以已知花青素含量的櫻桃汁飲料為基質(zhì)，加入芍藥素-3-葡萄糖苷、錦葵定-3-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)溶液，選擇優(yōu)化后的前處理條件操作，上機檢測，計算回收率。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

參考相關(guān)文獻 [13-15]，發(fā)現(xiàn)不同文獻檢測芍藥素-3-葡萄糖苷、錦葵定-3-葡萄糖苷的流動相體系不同，主要分為四大類流動相體系：甲醇/磷酸溶液體系、甲醇/乙酸溶液體系、乙腈/磷酸溶液體系和乙腈/乙酸溶液體系。所以為了了解這些流動相對這芍藥素-3-葡萄糖苷和錦葵定-3-葡萄糖苷色譜行為的影響，本研究固定流動相洗脫速度，配制不同體系的流動相Ⅰ：甲醇-5%磷酸溶液（體積比為25∶75）；流動相Ⅱ：甲醇-5%乙酸溶液（體積比為25∶75）；流動相Ⅲ：乙腈-5%磷酸溶液（體積比為25∶75），流動相Ⅳ：乙腈-5%乙酸溶液（體積比為25∶75）；并考慮洗脫模式對兩個目標(biāo)物的分離度的影響，來確定流動相及洗脫模式對芍藥素-3-葡萄糖苷和錦葵定-3-葡萄糖苷色譜行為的影響。色譜條件對目標(biāo)物的影響見圖2。

圖2 芍藥素-3-葡萄糖苷（峰1）、錦葵定-3-葡萄糖苷（峰2）色譜圖Fig.2 Chromatogram of peonidin-3-glucoside and malvidin-3-glucoside

結(jié)果表明：甲醇、乙腈在分離和保留芍藥素-3-葡萄糖苷、錦葵定-3-葡萄糖苷上并沒有明顯差別，但是考慮到乙腈洗脫能力更強，選用乙腈作為流動相體系之一。乙腈-5%磷酸溶液與乙腈-5%乙酸溶液相比，乙腈-5%磷酸溶液能更好的將樣品中的雜質(zhì)峰分開。

但是在乙腈-5%磷酸溶液體系下，等度洗脫的條件芍藥素-3-葡萄糖苷、錦葵定-3-葡萄糖苷兩者的分離度不好，所以本試驗進一步摸索了乙腈-5%磷酸溶液流動相梯度洗脫的條件。最終流動相洗脫條件A(乙腈)-B（5% 磷酸溶液）為 0～5.0 min、B25%；5.0 min～12.0 min、B25%～40%；12.0 min～20.0 min、B40%～25%，芍藥素-3-葡萄糖苷在6.978 min出峰，錦葵定-3-葡萄糖苷在9.294 min出峰，兩者能得到良好的基線分離，分離度較好，其峰型良好，出峰時間合適。

2.2 檢測波長的選擇

本試驗采用PDA檢測器對芍藥素-3-葡萄糖苷、錦葵定-3-葡萄糖苷進行全波長掃描（范圍200 nm～600 nm）。全波長掃描圖見圖3。

圖3 全波長掃描圖Fig.3 Full wavelength scanning chart

如圖3所示，兩個目標(biāo)物在215、515 nm附近各存在一個吸收峰。但是215 nm波長條件下干擾物質(zhì)較多，所以選擇515 nm作為芍藥素-3-葡萄糖苷、錦葵定-3-葡萄糖苷的檢測波長。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

為了驗證芍藥素-3-葡萄糖苷、錦葵定-3-葡萄糖苷在流動相體系中的線性關(guān)系，配制了濃度為20.0、40.0、80.0、100.0、200.0 μg/mL 的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。試驗結(jié)果表明，芍藥素-3-葡萄糖苷、錦葵定-3-葡萄糖苷在 20.0 μg/mL～200.0 μg/mL 內(nèi)均具有良好的線性關(guān)系（r2＞0.999）；采用在空白基質(zhì)中添加目標(biāo)組分的方法，依據(jù)色譜峰的信噪比（S/N）大于3倍確定檢出限（LOD），S/N大于10倍確定定量限（LOQ），得到芍藥素-3-葡萄糖苷、錦葵定-3-葡萄糖苷組分的LOD為40 mg/kg和 50 mg/kg，LOQ 為 120 mg/kg和 150 mg/kg，結(jié)果見表1。

表1 保留時間、標(biāo)準(zhǔn)曲線、相關(guān)系數(shù)、檢出限與定量限Table 1 Retention time,standard curve，correlation coefficient，detection limit and quantitative limit

2.4 樣品提取溶劑的選擇

根據(jù)花青素的理化特性，易溶于水、乙醇、丙三醇、檸檬酸及鹽酸等極性較強的溶劑，而難溶于苯、氯仿、乙醚、四氯化碳、乙酸乙酯等非極性的溶劑。同時花青素分子中含有多個酚羥基及吡喃環(huán)上有四價氧離子，具有酸及堿的性質(zhì)，能溶于稀酸及稀堿，且對酸和堿很敏感，且在酸性溶劑中較穩(wěn)定，所以通常采用酸化提取液作為提取劑來提取花青素。

所以本試驗分別比較了蒸餾水、0.5%檸檬酸、0.5%鹽酸、0.5%鹽酸乙醇、0.5%鹽酸丙三醇等5種提取溶劑的提取效果，溶劑：樣品按4∶1的比例（體積比）混合，結(jié)果以兩種目標(biāo)物的平均回收率為比較依據(jù)。溶劑對提取率的影響見圖4。

結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與樣品以一定比例混合的蒸餾水、0.5%檸檬酸、0.5%鹽酸以及0.5%鹽酸丙三醇提取的提取液，雜質(zhì)較多，無法與芍藥素-3-葡萄糖苷、錦葵定-3-葡萄糖苷分離，色譜圖中目標(biāo)峰峰形拖尾，影響目標(biāo)物的分析；而0.5%鹽酸乙醇與樣品以4∶1（體積比）提取的樣液，目標(biāo)峰可與雜質(zhì)完全分離，且峰形對稱，可以作為櫻桃子飲料中0.5%鹽酸乙醇的提取溶液。

圖4 溶劑對提取率的影響Fig.4 Effect of solvent on extraction rate

2.5 加標(biāo)回收與相對偏差

在以上試驗的優(yōu)化條件下，利用以已知花青素含量的櫻桃汁飲料為基質(zhì)進行加標(biāo)回收率試驗，在分別添加0.2、0.4、0.6 g/kg等3個梯度濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個濃度平行測定5次，測定結(jié)果見表2。

表2 方法的回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=5）Table 2 Recoveries and relative standard deviations（RSD）of the method（n=5）

由表2可見，芍藥素-3-葡萄糖苷、錦葵定-3-葡萄糖苷的加標(biāo)回收率為88.4%～92.6%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.5%～2.2%，表明本試驗所建立的方法具有可靠的準(zhǔn)確度和精密度。

2.6 實際樣品的測定

應(yīng)用本文所建立的方法，對櫻桃汁飲料中的芍藥素-3-葡萄糖苷、錦葵定-3-葡萄糖苷進行測定，能從飲料中快速地檢測出芍藥素-3-葡萄糖苷、錦葵定-3-葡萄糖苷。此方法選擇性強、重現(xiàn)性高，能達到基線分離，櫻桃汁飲料的色譜圖見圖5。

圖5 櫻桃汁飲料的色譜圖Fig.5 The chromatograms of cherry juice drink

如圖5所示，是一款櫻桃汁飲料中測定花青素的色譜圖，芍藥素-3-葡萄糖苷（6.991 min）、錦葵定-3-葡萄糖苷（9.248 min）。

3 結(jié)論

建立一種高效液相色譜-PDA檢測器檢測櫻桃汁飲料中芍藥素-3-葡萄糖苷、錦葵定-3-葡萄糖苷的分析方法。結(jié)果表明，在流動相：乙腈-5%磷酸梯度洗脫的條件下，目標(biāo)物能得到良好的基線分離，其峰型良好，出峰時間合適。在515 nm的檢測波長下，樣品經(jīng)過0.5%鹽酸乙醇與樣品以4∶1（體積比）提取后，可實現(xiàn)對目標(biāo)物的有效提取。樣品中的芍藥素-3-葡萄糖苷、錦葵定-3-葡萄糖苷的加標(biāo)回收率能達到88.4%～92.6%，能滿足檢測目標(biāo)物質(zhì)的要求，可以準(zhǔn)確快速有效地檢測櫻桃汁飲料中芍藥素-3-葡萄糖苷、錦葵定-3-葡萄糖苷兩種花青素的含量。

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Rapid Determination of Anthocyanins in Cherry Juice Drink by HPLC

AN Chun-zhi，WANG You-zhi
（NanHua College of Industry and Commerce，Guangzhou 510507，Guangdong，China）

A rapid and effective method was established for the determination of peonidin-3-glucoside and malvidin-3-glucoside in cherry juice drink by HPLC.After the sample was extracted by 0.5%ethanol hydrochloride，the targeted compound was separated on C18column（4.6 mm×150 mm，5 μm）using acetonitrile-5%phosphoric acid as mobile phase by gradient elution，with PDA detector and external standard method peak area quantification.The linear range of peonidin-3-glucoside and malvidin-3-glucoside was in the range of 20.0 μg/mL-200.0 μg/mL with a correlation coefficient of 0.999.The peonidin-3-glucoside detection limit was 40 mg/kg and the quantitative limit was 120 mg/kg.The malvidin-3-glucoside detection limit was 50 mg/kg and the quantitative limit was 150 mg/kg.The two targets recovery rate was 88.4%-92.6%.The method had the advantages of simple pretreatment，good extract effect and fast detection rate，and was suitable for the separation and quantitative detection of peonidin-3-glucoside and malvidin-3-glucoside in cherry juice drink.

cherry juice；anthocyanins；high performance liquid chromatography（HPLC）

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.17.035

2017-01-10

安春志（1978—），男（漢），講師，碩士，研究方向：中藥、營養(yǎng)健康、藥品經(jīng)營管理。