16S rDNA克隆文庫方法分析太歲樣品中細菌的多樣性

王朝江

(河北省農(nóng)林科學院 遺傳生理研究所，河北 石家莊 050051)

16S rDNA克隆文庫方法分析太歲樣品中細菌的多樣性

王朝江

(河北省農(nóng)林科學院 遺傳生理研究所，河北 石家莊 050051)

通過構(gòu)建16S rDNA克隆文庫的方法，分析太歲樣品中細菌的群落結(jié)構(gòu)及多樣性。太歲樣品中的細菌歸屬于4個門9個目，優(yōu)勢類群依次是芽胞桿菌目(Bacillales，33.01%)、柄桿菌目(Caulobacterales，32.04%)和伯克霍爾德氏菌目(Burkholderiales，12.62%)；優(yōu)勢屬為短波單胞菌屬(Brevundimonas，30.10%)、葡萄球菌屬(Staphylococcus，29.13%)和食酸菌屬(Acidovorax，7.77%)。并且其中的5個目中含有未培養(yǎng)的細菌，紅桿菌目(Rhodobacterales)、伯克霍爾德氏菌目和紅環(huán)菌目(Rhodocyclales)的11個克隆子的細菌16S rDNA序列同源性低于97%。研究表明太歲樣品中細菌多樣性較豐富，且蘊藏著許多未知的微生物資源。

16S rDNA；克隆文庫；太歲；細菌多樣性

“太歲”又稱“肉靈芝”，《本草綱目》中描述為“肉芝狀如肉，乃生物也，白者如截肪，黃者如紫金，皆光明洞徹如堅冰也”。太歲生活于土壤中，生命力極強，有研究稱太歲在抑菌、調(diào)節(jié)免疫、惡性腫瘤等疑難雜癥的治療方面具有明顯效果，因此受到社會各界的廣泛關(guān)注。太歲特有的彈性、韌性和粘性，極易使人直覺上判定是一種生物體，但到目前為止生物學界卻一直難以給出歸屬，比較流行的觀點認為是“大型黏菌復合體”，但仍有人持太歲為非生命體的觀點。戴璐[1]研究了渭河太歲衍生體中黏菌和真菌多樣性，分離出2種黏菌和18種真菌；王欣[2]研究了上述同一樣本中細菌多樣性，獲得35株細菌和1株黏細菌，優(yōu)勢菌群為β-變形菌綱伯克氏菌目(Burkholderiales)的細菌；林澗等[3]也開展了類似的工作；鄭科研等[4]通過研究渭河太歲化學組成，推測其是以聚乙烯醇為主，含少量多糖和各種雜菌的不明物體；朱春玉等研究了太歲的營養(yǎng)組成，指出其含有核酸、蛋白質(zhì)等基本生物體構(gòu)成要素，傾向于支持太歲是生命體的觀點[5]，但過低的核酸含量則不能確認其來源于太歲本身還是太歲中的雜菌。本文作者[6]在分析了中國現(xiàn)代太歲228次發(fā)現(xiàn)報道后，明確了太歲存在的客觀性和研究的必要性。因此，進一步分析各種太歲中微生物的多樣性及其與太歲本體的關(guān)系，為認識太歲屬性、揭示生命特征提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試樣品 太歲由北京電視臺科教節(jié)目記者轉(zhuǎn)贈，外觀白色肌纖維狀，手觸有彈性，并略有粘性，發(fā)現(xiàn)地為吉林長春，筆者保藏編號004。

1.2 方法

1.2.1 總DNA提取 為減少外界雜菌的影響，測試取樣切自有膠質(zhì)層包裹的邊緣緊密組織。切塊用無菌水震蕩洗滌200次，無菌濾紙吸干表面水分，切去暴露的表層，剩余部分用于DNA的提取。太歲切塊組織勻漿機搗碎后，用Ezup柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒提取總DNA。

1.2.2 PCR擴增 以提取的DNA為模板，采用16S rDNA擴增通用引物7F(CAGAGTTTGATCCTGGCT)和1540R(AGGAGGTGATCCAGCCGCA)進行PCR[7]。PCR反應體系：5×Buffer(with Mg2+)2.5 μL，dNTP(各2.5 mmol/L)2 μL，7F(10 μmol/L)0.5 μL，1540R(10 μmol/L)0.5 μL，TaqDNA聚合酶0.2 μL，DNA模板0.5 μL，加ddH2O至25 μL。PCR反應條件：98 ℃預變性3 min；98 ℃變性25 s，55 ℃復性25 s，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

1.2.4 16S rDNA克隆文庫分析 測序結(jié)果用Mothur 軟件剔除嵌合序列，劃分操作單元(Operational Taxonomic Unit, OTU)。通過Shannon-Wiener多樣性指數(shù)(H)[8]及均勻度指數(shù)(E)分析細菌的多樣性。

E= H / ln S

其中N為陽性克隆子總數(shù)；n1為僅含單個克隆子的OTU數(shù)量[9]。

1.2.5 構(gòu)建細菌16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹 測序結(jié)果利用BLAST軟件(http://www. ncbi. nlm. nih. gov/blast/Blast. Cgi)與GenBank數(shù)據(jù)庫中的序列進行比對分析，選取同源性最高且合格發(fā)表的菌株序列，利用MEGA5軟件，采用鄰接法(neighbor-joining method)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，代表克隆文庫序列提交GenBank。

2 結(jié)果與分析

2.1 總DNA提取和PCR擴增

對太歲樣品提取的總DNA進行電泳檢測，條帶大小為2 000 bp左右，DNA片段完整，并用細菌16S rDNA的通用引物7F和1540R擴增16S rDNA片段，結(jié)果如圖1所示。由圖1可知，16S rDNA片段約1 500 bp。

2.2 太歲樣品16S rDNA文庫的多樣性

隨機挑取太歲樣品16S rDNA克隆文庫中103個陽性克隆子，并進行測序(序列長約為800 bp),結(jié)果如表2所示。代表克隆文庫序列提交GenBank，序列登錄號為：KX579862～KX579878和KX686139～KX686143。103個陽性克隆共分為22個OTU，其中9個OTU只含有一個克隆子，計算覆蓋率C值為91%，說明本研究檢出的微生物在一定程度上可以反映樣品的細菌群落結(jié)構(gòu)。計算Shannon-Wiener多樣性指數(shù)H為2.22，均勻度指數(shù)E為0.72，由此可看出太歲樣品中細菌多樣性較豐富且比較均一。

圖1 太歲樣品細菌16S rDNA的PCR擴增產(chǎn)物Fig.1 PCR amplification of the bacteria 16S rDNA from "Taisui"加粗的500、1 000、3 000分別表示Marker中相應條帶大小為500 bp、1 000 bp、3 000 bp the size of stripes corresponded to bold Markers are 500 bp, 1 000 bp, 3 000 bp

由序列比對結(jié)果可知，太歲樣品中細菌種類豐富，22個OTU共歸屬于4個門的9個目。其中變形菌門的67個克隆子所占比例最大(65.05%)，包含6個目：柄桿菌目(Caulobacterales)有33個克隆子，所占比例為32.04%；伯克霍爾德氏菌目(Burkholderiales)有13個克隆子，所占比例為12.62%；紅環(huán)菌目(Rhodocyclales)有7個克隆子，所占比例為6.80%；根瘤菌目(Rhizobiales)有5個克隆子，所占比例為4.85%；紅桿菌目(Rhodobac-terales)有5個克隆子，所占比例為4.85%；鞘氨醇單胞菌目(Sphingomonadales)有4

個克隆子，所占比例為3.88%。厚壁菌門的34個克隆子都歸屬于芽胞桿菌目(Bacillales)，所占比例為33.01%。疣微菌門的疣微菌目(Verrucomicrobiales)和浮霉菌門的浮霉菌目(Planctomycetales)都只有1個克隆子且為未培養(yǎng)細菌。由此可知，本研究太歲樣品中最優(yōu)勢類群為芽胞桿菌目(33.01%)，次優(yōu)勢類群為柄桿菌目(32.04%)，然后是伯克霍爾德氏菌目(12.62%)。另外，本研究太歲樣品16SrDNA克隆文庫22個OTU中OTU5的31個克隆子為短波單胞菌屬(Brevundimonas，30.10%)，是最優(yōu)勢屬；OTU21的30個克隆子為葡萄球菌屬(Staphylococcus，29.13%)，是次優(yōu)勢屬；然后OTU1的8個克隆子為食酸菌屬(Acidovorax，7.77%)；其他OTU所占比例均小于4%。

由表2可知，構(gòu)建的16S rDNA文庫中的克隆子與GenBank數(shù)據(jù)庫中已知細菌的16S rDNA序列相似性最高為100%，最低為90%。其中92個克隆子(89.32%)與已知序列相似性高于97%，11個克隆子(10.68%)與已知序列相似性低于97%。本研究中16S rDNA克隆文庫的5個目(紅桿菌目、伯克霍爾德氏菌目、紅環(huán)菌目、疣微菌目、浮霉菌目)中22個克隆子為未培養(yǎng)的細菌；3個目(紅桿菌目、伯克霍爾德氏菌目、紅環(huán)菌目)中11個克隆子與已知細菌的16S rDNA序列差異性較大，同源性最低的僅為90%，這說明太歲樣品中不僅含有豐富的已知細菌，還蘊藏著許多未知及未培養(yǎng)的細菌，有進一步深入研究和開發(fā)的價值。

表2 太歲樣品中細菌的16S rDNA克隆文庫結(jié)果

續(xù)表2

2.3 太歲樣品中16S rDNA系統(tǒng)發(fā)育分析

測序結(jié)果利用BLAST軟件與GenBank數(shù)據(jù)庫中的序列進行比對分析，選取同源性最高且合格發(fā)表的菌株序列，利用MEGA5軟件，采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果如圖2。由圖2可知，太歲樣品克隆文庫有22個OTU，其中21個OTU分別與變形菌門、厚壁菌門和疣微菌門的細菌聚集在一起，另有OTU22與浮霉菌門的未培養(yǎng)細菌聚集在一起，形成單獨的一支，該結(jié)果與序列比對結(jié)果相一致。

圖2 太歲樣品中細菌16S rDNA克隆文庫系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of bacterial 16S rDNA clones in "Taisui"

3 討 論

本研究太歲樣品16S rDNA克隆文庫的103個陽性克隆子共得到22個OTU歸屬于4個門的9個目，其中優(yōu)勢類群依次是芽胞桿菌目(33.01%)、柄桿菌目(32.04%)和伯克霍爾德氏菌目(12.62%)。其中5個目的22個克隆子為未培養(yǎng)的細菌，3個目的11個克隆子細菌16S rDNA序列同源性低于97%，這說明太歲樣品中的細菌不僅有較豐富的多樣性，而且蘊藏著許多未知的微生物資源，有待進一步深入研究。

本研究太歲樣品中細菌的優(yōu)勢屬為短波單胞菌屬(30.10%)、葡萄球菌屬(29.13%)和食酸菌屬(7.77%)。短波單胞菌屬的瓊脂糖酶產(chǎn)生菌能將瓊脂降解為瓊脂寡糖，瓊脂寡糖具有抗癌、抗氧化、抗病毒等生理活性，被廣泛應用于醫(yī)藥領(lǐng)域[10]。這可能與太歲對一些疑難雜癥有特殊的療效密切相關(guān)。另外短波單胞菌屬細菌還能降解木質(zhì)纖維素[11]、有機磷農(nóng)藥[12]和原油[13]等物質(zhì)。這個屬的細菌多見于水體中，有研究表明東居延海[14]和北極海水[15]中都是短波單胞菌屬為優(yōu)勢種群。食酸菌屬含有多種降解菌，能降解苯酚及苯衍生物[16]、腐植酸[17]、喹啉[18]、聚羥基丁酸戊酸共聚酯(PHBV)[19]和β-環(huán)檸檬醛[20]等難降解物質(zhì)。以上結(jié)果表明太歲樣品中細菌優(yōu)勢種群具有降解多種環(huán)境物質(zhì)的作用，這可能與太歲在土壤環(huán)境中的生長有關(guān)，但仍需進一步研究。而葡萄球菌屬細菌在太歲中的作用尚不清楚。

王欣[2]對渭河太歲衍生體中細菌多樣性分析表明其體內(nèi)的優(yōu)勢細菌種群為伯克氏菌目，而本研究太歲樣品的伯克霍爾德氏菌目不是最優(yōu)勢細菌類群，所占比例為12.62%，芽胞桿菌目為本太歲樣品的最優(yōu)勢類群。兩個研究中優(yōu)勢菌群的不同可能與太歲樣品不同、樣品采集地及保藏處理方式不同有關(guān)。另外，林澗等[3]發(fā)現(xiàn)其太歲1號樣品包含葡萄球菌屬、白色側(cè)齒霉菌、假絲酵母屬，本研究太歲樣品中的細菌也包含了葡萄球菌屬。綜合分析發(fā)現(xiàn)生長在不同環(huán)境中的太歲，其體內(nèi)的微生物類群及優(yōu)勢種群存在差異，而不同太歲的細菌組成是否存在一定規(guī)律及差異形成的機理等還有待大量的研究證明。

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Analysis of Bacterial Diversity by 16S rDNA Clone Library fromTaisuiSample

WANG Chao-jiang

(Inst.ofGenetics&Physiol.,HebeiAcad.ofAgric. &ForestrySci.,Shijiazhuang050051)

The bacterial community structure and diversity ofTaisuisample were analyzed through the construction of 16S rDNA clone libraries. Bacteria inTaisuisample belonged to 4 phyla and 9 orders. The dominant orders of bacteria were Bacillales (33.01%), Caulobacterales (32.04%) and Burkholderiales (12.62%). The most dominant genus wasBrevundimonas(30.10%), the secondary dominant genus wasStaphylococcus(29.13%), followed byAcidovorax(7.77%). There were uncultured bacteria of 5 orders among them, and 11 clones from Rhodobacterales, Burkholderiales and Rhodocyclales of bacterial 16S rDNA sequence homology were less than 97%. The results indicated that high bacterial diversity was found inTaisui, also there were many unknown microbial resources.

16S rDNA; clone library;Taisui; bacterial diversity

王朝江 男，研究員。主要從事食用菌育種與栽培技術(shù)研究。Tel：0311-87652124，E-mail：lhswchj@163.com

2016-08-01；

2016-09-01

Q938

A

1005-7021(2017)03-0095-05

10.3969/j.issn.1005-7021.2017.03.015