青藏高原幾種牧草附著耐低溫乳酸菌的篩選

許冬梅， 曹 蕾， 荊佩欣， 張永輝， 張紅梅， 張萬祥， 郭旭生*

(1.蘭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅省草原技術(shù)推廣總站，甘肅 蘭州 730046； 3.蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)學(xué)院草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730020)

青藏高原幾種牧草附著耐低溫乳酸菌的篩選

許冬梅1， 曹 蕾2， 荊佩欣1， 張永輝2， 張紅梅3， 張萬祥2， 郭旭生1*

(1.蘭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅省草原技術(shù)推廣總站，甘肅 蘭州 730046； 3.蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)學(xué)院草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730020)

為篩選出適宜青藏高原低溫發(fā)酵優(yōu)良菌株，針對從青藏高原垂穗披堿草(Elymusnutans)、燕麥(AvenasativalL.)和藏嵩草(Koeleriatibetica)中分離出的148株乳酸菌，經(jīng)10 ℃低溫條件下MRS液體培養(yǎng)基與不同培養(yǎng)時(shí)間(12、24、36和48 h)初篩后，進(jìn)一步將初篩的菌株通過不同溫度 (10、15和25 ℃) 條件下綠汁發(fā)酵液的復(fù)篩,并對其進(jìn)行生理生化特性研究。結(jié)果表明，植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum) 31、干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei) Q5、戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus) Q6和棒狀乳桿菌(Lactobacilluscoryniformis) Q7 這4株菌在MRS液體培養(yǎng)基和綠汁發(fā)酵液較低溫環(huán)境中生長活性和快速產(chǎn)酸能力較強(qiáng),而且生理生化特性指標(biāo)表明，Q5比對應(yīng)模式菌具有更廣泛的糖源利用能力，Q7較對應(yīng)模式菌具有更強(qiáng)的耐酸和耐低溫特性。因此，上述4株乳酸菌可作為適宜青藏高原低溫發(fā)酵青貯飼料備選菌株。

青藏高原；乳酸菌；綠汁發(fā)酵液；低溫

由于青藏高原緯度低，海拔高，氣候嚴(yán)寒，空氣密度小，紫外線強(qiáng)，降雨量少，牧草生長期短，飼草產(chǎn)量低，造成青藏高原牧區(qū)飼草短缺限制畜牧業(yè)發(fā)展。近年來，隨著牧草保存和加工技術(shù)的提高，青藏高原地區(qū)的飼草加工水平相對有所提高，飼草青貯技術(shù)在該地區(qū)開始推廣。普通牧草青貯過程是各類微生物綜合發(fā)酵的過程，主要有乳酸菌、酵母菌和霉菌等；理想牧草青貯應(yīng)使乳酸菌發(fā)揮主要作用，甚至應(yīng)由乳酸菌控制發(fā)酵全程。青貯可以利用乳酸菌分解有機(jī)質(zhì)產(chǎn)生的乳酸降低青貯飼料pH值，維持健康的發(fā)酵環(huán)境，同時(shí)促進(jìn)可溶性碳水化合物和粗纖維的轉(zhuǎn)化，提高青貯飼料的青貯品質(zhì)和適口性。乳酸菌是一種益生菌，可促進(jìn)動(dòng)物消化和營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，利于有機(jī)無公害畜產(chǎn)品的生產(chǎn)。因此，乳酸菌作為一種青貯飼料添加劑非常有利于高品質(zhì)牧草的保存和有機(jī)畜牧業(yè)的發(fā)展。目前，國內(nèi)對乳酸菌種質(zhì)資源的開發(fā)越來越多，對乳酸菌添加至青貯飼料中的研究開始被廣泛關(guān)注。韓吉雨[1]從玉米(Zeamays)和苜蓿(Medicagosativa)青貯飼料中分離鑒定出植物乳桿菌、短乳桿菌(Lactobacillusbrevis)、魏斯氏菌(Weissellacibaria)等，而從不同地區(qū)的玉米和苜蓿青貯原料中發(fā)現(xiàn)了較多與青貯發(fā)酵無關(guān)的菌種，其中乳酸菌種類有植物乳桿菌、魏斯氏乳酸菌及布什乳桿菌(Lactobacillusbuchneri)，但數(shù)量相對較少 。高靜[2]、楊楊[3]和秦麗萍[4]也從來自青藏高原的不同種類牧草中發(fā)現(xiàn)了植物乳桿菌、戊糖片球菌、清酒乳桿菌(Lactobacillussakei)、魏斯氏乳酸菌、腸膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)、短乳桿菌等。一般市售乳酸菌添加劑的最適生長溫度約為 30 ℃，而青藏高原牧草收獲季節(jié)的平均溫度為10～20 ℃[5]，溫度成為限制青藏高原牧草青貯乳酸菌添加劑利用的關(guān)鍵因素。而有關(guān)我國高寒地區(qū)牧草附著乳酸菌及耐低溫乳酸菌的研究鮮見報(bào)道。本研究通過青藏高原耐低溫乳酸菌的篩選，探索出適宜青藏高原低溫環(huán)境的青藏高原本土乳酸菌，為青藏高原飼草青貯提供優(yōu)良乳酸菌添加劑。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料 2013年8月于西藏當(dāng)雄地區(qū)采集藏嵩草和燕麥，將藏嵩草和燕麥草樣剪碎至2～3 cm后晾至水分含量為65%～70%，用30 cm×23 cm聚氯乙烯塑料袋裝200 g草樣，真空包裝機(jī)抽真空并封口后帶回實(shí)驗(yàn)室青貯。

1.1.2 菌種來源 來自青藏高原燕麥和藏嵩草表面的乳酸菌共40株，進(jìn)行MRS液體培養(yǎng)基及綠汁發(fā)酵液篩選；本課題組于2012年7月從青藏高原果洛藏族自治州采集的垂穗披堿草青貯飼料中分離得到108株乳酸菌，經(jīng)過液體培養(yǎng)基篩選后，確定7株乳酸菌為優(yōu)良乳酸菌[4]。其編號和菌種依次為Q1(清酒乳桿菌)、Q2(植物乳桿菌)、Q3(短乳桿菌)、Q4(彎曲乳桿菌(Lactobacilluscurvatus))、Q5(干酪乳桿菌)、Q6(戊糖片球菌)、Q7(棒狀乳桿菌)。這7株乳酸菌參與本研究中綠汁發(fā)酵液篩選。生理生化特性試驗(yàn)中用購自中國普通工業(yè)微生物中心(CGMCC)的模式菌作對比，編號和菌種依次為1.2437(植物乳桿菌)、1.2435(干酪乳桿菌)、1.2695(戊糖片球菌)、1.1879(棒狀乳桿菌)。

1.1.3 培養(yǎng)基 綠汁發(fā)酵液：將采集的拔節(jié)期新鮮草地早熟禾(Poapretensis)(多年生，適宜氣候冷涼、濕度較大的環(huán)境，抗寒能力強(qiáng)，耐旱性稍差，耐踐踏。根狀莖繁殖迅速，再生能力強(qiáng)，耐修剪)按草∶水=1∶2.5比例(質(zhì)量比)，先用榨汁機(jī)榨取綠汁發(fā)酵液，再用4層紗布過濾，1 000 r/min離心后4 ℃冷藏備用。由于綠汁發(fā)酵液不進(jìn)行滅菌處理，建議現(xiàn)制現(xiàn)用。

1.1.4 主要儀器與設(shè)備 PB-10pH計(jì)(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)、MLS-3780高壓滅菌鍋(三洋公司)、DYY-6C電泳儀(北京市六一儀器廠)、U-2910紫外可見分光光度計(jì)(日立公司)、SIM-F140Y65制冰機(jī)(三洋公司)、Microfuge 18型臺式離心機(jī)(BECKMAN公司)、生化反應(yīng)管(20支×0.25 mL)(杭州濱和微生物試劑有限公司)、細(xì)菌總基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 乳酸菌分離純化 ①菌體分離：將青貯9和14 d后的藏嵩草和燕麥樣品，用滅菌后的榨汁機(jī)(主要靠酒精和紫外線滅菌)按草∶水=1∶5比例(質(zhì)量比)進(jìn)行榨汁，然后分裝至滅菌的15 mL離心管中，添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%的葡萄糖，分別置于15 ℃和25 ℃下培養(yǎng)0.5、1和2 d，按照10-1～10-5進(jìn)行稀釋后，選取適當(dāng)濃度涂MRS固體培養(yǎng)基[4]平板，分別置于無菌厭氧盒15 ℃和25 ℃生化培養(yǎng)箱中厭氧培養(yǎng)3 d，根據(jù)菌落形態(tài)，大小、光澤、透明度等，挑取優(yōu)勢菌的單菌落，進(jìn)行革蘭染色、過氧化氫酶檢驗(yàn)和油鏡鏡檢試驗(yàn)[6]。革蘭染色陽性、過氧化氫酶陰性的菌株均為疑似乳酸菌。②優(yōu)勢菌純化：將挑出的優(yōu)勢菌用劃線法，先在37 ℃厭氧條件和MRS固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)48 h，然后挑選單菌落連續(xù)純化2次后，接種至MRS液體培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h，再加入體積分?jǐn)?shù)10%的二甲基亞砜，保存在-80 ℃超低溫冰箱備用。

1.2.2 優(yōu)勢菌菌種鑒定 ①DNA提?。簩⑺魞?yōu)勢菌菌液按照體積分?jǐn)?shù)10%的接種量接到MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧培養(yǎng)12 h以上，連續(xù)活化2～3次后進(jìn)行DNA提取。使用天根細(xì)菌DNA提取試劑盒，具體方法嚴(yán)格遵守試劑盒使用方法說明。②PCR擴(kuò)增16S rDNA基因序列:引物序列為27f∶5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和1492r：5′-AAGTCGTAACAAGGTAACC-3′。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s；72 ℃ 5 min，循環(huán)30次[7]。擴(kuò)增完成后，取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物與等量的6×Loading Buffer混合進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，電泳后在紫外燈下與Marker條帶對比觀察是否有與之對應(yīng)的亮帶。確保PCR擴(kuò)增成功后進(jìn)行下一步送樣測序。③16S rDNA基因序列測序:將PCR產(chǎn)物送樣測序，測序由上海美吉生物技術(shù)有限責(zé)任公司完成。④16S rDNA基因序列同源性分析:將乳酸菌菌株16S rDNA基因序列在GenBank中用BLAST(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi)程序搜索與待測菌株同源性最高的菌種。如測序菌株與搜索出的同源性最高菌株同源性高于97.5%，一般便可判斷它們屬于同一個(gè)種[8-10]。本研究中，選取同源性≥ 99%的菌種進(jìn)行對照。

1.2.3 耐低溫乳酸菌篩選及生理生化指標(biāo)測定 ①優(yōu)勢菌MRS液體培養(yǎng)基初篩：將純化后的乳酸菌菌液按照10%的接種量,用MRS液體培養(yǎng)基活化2～3次后，稀釋菌液，使其數(shù)量為108cfu/g,按3%的接種量,將稀釋好的菌液接至MRS液體培養(yǎng)基，分別于10 ℃條件下低溫培養(yǎng)3 d。在600 nm處測定其吸光值(OD值)，同時(shí)用pH計(jì)測定發(fā)酵液酸度，選取OD值高且pH值低的菌株作為初篩優(yōu)良菌。將MRS液體培養(yǎng)基初篩所得優(yōu)良菌進(jìn)行綠汁發(fā)酵液篩選。②綠汁發(fā)酵液篩選：分別把活化好的乳酸菌稀釋至108cfu/g，按3%的接種量將乳酸菌稀釋液接種到裝有綠汁發(fā)酵液的滅菌的15 mL離心管中，分別置于10、15和25 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d，測定發(fā)酵液pH值，選擇pH值較低的乳酸菌為優(yōu)良乳酸菌。③乳酸菌生理生化特性測定：因在菌體分離過程中已經(jīng)完成革蘭染色試驗(yàn)和過氧化氫酶檢驗(yàn)及油鏡鏡檢試驗(yàn)，此處只進(jìn)行不同溫度和pH值條件下MRS液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，糖發(fā)酵試驗(yàn)與精氨酸產(chǎn)氨、葡萄糖產(chǎn)氣和硝酸鹽還原試驗(yàn)。a.MRS液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，按3%接種量將稀釋至乳酸菌為106cfu/g的菌液，接至MRS液體培養(yǎng)基，分別在4、10、15、25、45和50 ℃條件下培養(yǎng)3 d，分光光度計(jì)600 nm處測定其OD值，同樣在pH值為3.0、3.5、4.0、8.0、8.5和9.0條件下，37 ℃培養(yǎng)3 d后測定其OD值，以判斷其生長狀況;b.糖發(fā)酵試驗(yàn)和精氨酸產(chǎn)氨、葡萄糖產(chǎn)氣和硝酸鹽還原試驗(yàn)全部采用細(xì)菌微量生化反應(yīng)管，用接種針從平板挑取單菌落至生化管，滅菌石蠟封口，37 ℃培養(yǎng)72 h，觀察其變色情況，操作嚴(yán)格按照使用說明書進(jìn)行。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析 所得數(shù)據(jù)用EXCEL進(jìn)行基礎(chǔ)數(shù)據(jù)計(jì)算，并制作圖表。用SPSS17.0進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 16S rDNA菌種鑒定

本試驗(yàn)分離得到的40株乳酸菌經(jīng)過16S rDNA測序后發(fā)現(xiàn)，40株乳酸菌分屬于植物乳桿菌和戊糖片球菌兩個(gè)種，其中來自青藏高原燕麥的植物乳桿菌4株，戊糖片球菌16株；來自藏嵩草的植物乳桿菌6株，戊糖片球菌14株(表1)。

表1 16S rDNA菌種鑒定結(jié)果

2.2 MRS液體培養(yǎng)基篩選

40株乳酸菌在10 ℃、MRS培養(yǎng)液中培養(yǎng)12 h時(shí)，編號為11、14、15、16、24、31、34、38的乳酸菌MRS培養(yǎng)液OD值均超過0.3；24 h時(shí)，11、12、14、15、16、24、31、34的OD值均高于0.6；36 h時(shí)，14、15、16、17、18、24、31的OD值達(dá)0.8以上；48 h時(shí)，14、15、16、17、24的OD值均在1.0以上(圖1)。

40株乳酸菌在10 ℃下MRS培養(yǎng)液的pH值在培養(yǎng)12 h時(shí)，編號為14、15、16、24、31、34的乳酸菌MRS培養(yǎng)液pH值為5.4左右；24 h時(shí)，14、15、24、31、34的pH值低于5.4；36 h時(shí)，14、15、16、17、18、24、31的pH值低于5.2；48 h時(shí)，14、15、16、17、18、24、31、34的pH值低于5.0(圖2)。 綜合乳酸菌MRS培養(yǎng)液的OD值和pH值，確定編號為14、15、16、17、18、24、31的乳酸菌為初篩優(yōu)良乳酸菌。

圖1 40株菌10 ℃ MRS培養(yǎng)液中培養(yǎng)12、24、36和48 h菌液OD值Fig.1 OD value of bacteria solution incubated at 10 ℃ in MRS medium for 12,24,36 and 48 h

圖2 40株菌10 ℃ MRS培養(yǎng)液中培養(yǎng)12、24、36和48 h菌液pH值Fig.2 pH value of bacteria solution incubated at 10 ℃ in MRS medium for 12、24、36 and 48 h

2.3 綠汁發(fā)酵液篩選

綠汁發(fā)酵液在10、15、25 ℃條件下培養(yǎng)48 h后pH值結(jié)果見表2。10 ℃條件下，編號為14、15、16、31、Q5、Q6、Q7的7株乳酸菌綠汁發(fā)酵液pH值低于5.50，尤其是14的發(fā)酵液pH值最低為5.32；15 ℃條件下，編號為31、Q3、Q4、Q5、Q6、Q7的6株乳酸菌發(fā)酵液pH值在4.70左右，其中Q7、Q6的綠汁發(fā)酵液pH值最低，降低至4.6左右；25 ℃條件下，除編號為16、17、Q2、Q3的4株乳酸菌發(fā)酵液pH值顯著高于其他菌株，其余菌株pH值均降低至4.0左右。綜合三個(gè)溫度條件下綠汁發(fā)酵液的pH值以及乳酸菌來源，考慮編號為14、31、Q5、Q6、Q7為耐低溫優(yōu)良乳酸菌，但由于14與Q6同為戊糖片球菌，綜合考慮，最終確定編號為31、Q5、Q6、Q7的乳酸菌作為青藏高原耐低溫乳酸菌。

表2 10、15、25 ℃下乳酸菌在綠汁發(fā)酵液中培養(yǎng)48 h時(shí)pH值

注：14、16、17、18、Q6：戊糖片球菌；15、24、31、Q2：植物乳桿菌；Q1：清酒乳桿菌； Q3：短乳桿菌；Q4：彎曲乳桿菌；Q5：干酪乳桿菌； Q7：棒狀乳桿菌；同行不同字母表示差異顯著(P<0.05)

2.4 所選優(yōu)良菌株生理生化特性

所選耐低溫乳酸菌生理生化特性結(jié)果見表3。4株耐低溫乳酸菌各自與其對應(yīng)的模式菌進(jìn)行糖源利用能力對比后發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)室所選植物乳桿菌不能利用棉籽糖和蜜二糖，植物乳桿菌的模式菌1.2437可以利用，對其他糖源的利用能力除了效率有所差異外，其結(jié)果差異不大；雖然實(shí)驗(yàn)室所選干酪乳桿菌不能利用乳糖，其對應(yīng)模式菌1.2435可以利用，但是它可以利用山梨醇、苦杏仁苷、七葉苷、纖維二糖，而與其對應(yīng)的模式菌則不能利用，干酪乳桿菌與其對應(yīng)的模式菌利用其他糖源的能力一致，所以，實(shí)驗(yàn)室所選干酪乳桿菌糖源利用能力強(qiáng)于購自CGMCC干酪乳桿菌模式菌。實(shí)驗(yàn)室所選戊糖片球菌可以利用甘露醇、山梨醇，對鼠李糖可微弱利用，但其對應(yīng)的模式菌1.2695則不能利用，戊糖片球菌的模式菌可以利用乳糖和L-阿拉伯糖，但是實(shí)驗(yàn)室篩選的戊糖片球菌不能利用這兩種糖源。實(shí)驗(yàn)室篩選的棒狀乳桿菌和其對應(yīng)的模式菌糖源利用能力差異不大。綜合來看，除了干酪乳桿菌外，其他菌株與其對應(yīng)的模式菌糖源利用能力差異不大。

實(shí)驗(yàn)室所選植物乳桿菌和干酪乳桿菌都可以精氨酸產(chǎn)氨，其對應(yīng)的模式菌不能利用精氨酸產(chǎn)氨，而戊糖片球菌的模式菌1.2695可以精氨酸產(chǎn)氨，實(shí)驗(yàn)室所選戊糖片球菌不可以(表3)。

表3 耐低溫乳酸菌生理生化特性

注：31：植物乳桿菌，1.2437：植物乳桿菌模式菌；Q5：干酪乳桿菌，1.2435：干酪乳桿菌模式菌；Q6：戊糖片球菌，1.2695：戊糖片球菌模式菌；Q7：棒狀乳桿菌，1.1879：棒狀乳桿菌模式菌；“+++”代表糖發(fā)酵管在18～24 h以內(nèi)變色；“++”代表糖發(fā)酵管在24～36 h以內(nèi)變色；“+”代表糖發(fā)酵管在36～72 h以內(nèi)變色；W代表糖發(fā)酵管在72 h時(shí)顏色從深藍(lán)紫色變成無色；“-” 代表不變色

乳酸菌在不同pH值條件下MRS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)3 d后的生長狀況見表4。pH 3.0時(shí)，所有乳酸菌均不能生長；pH 3.5時(shí)，只有植物乳桿菌和棒狀乳桿菌的模式菌不能生長，其他乳酸菌可以微弱生長；pH 4.0、8.0、8.5、9.0條件下，所有乳酸菌都生長良好。堿性環(huán)境中，乳酸菌可以利用自身產(chǎn)生的乳酸中和環(huán)境pH值，從而生長良好。在4 ℃條件下，菌株Q5、Q6和Q7能微弱生長，模式菌則不能生長；10 ℃條件下，實(shí)驗(yàn)室所選菌只有棒狀乳桿菌生長情況一般，不如對應(yīng)的模式菌株，其他實(shí)驗(yàn)室所選菌生長都優(yōu)于對應(yīng)模式菌；15、25和45 ℃條件下，所有乳酸菌菌株都能良好生長；而在50 ℃條件下培養(yǎng)3 d后，所有乳酸菌都不能生長。

表4 耐低溫乳酸菌在不同pH值和不同溫度的MRS液體培養(yǎng)基中的生長狀況

注： ++、+、w、- 分別表示生長良好(OD>0.5)、可生長(0.1

3 討 論

低溫成為限制傳統(tǒng)乳酸菌添加劑在青藏高原利用的重要因素，因?yàn)橐恍┤樗峋荒茉诘蜏丨h(huán)境中良好生長(低于15 ℃)[11-12]。分離篩選耐低溫乳酸菌可能成為提高青藏高原青貯飼料品質(zhì)的有效途徑。長期生存于特殊環(huán)境中的微生物具有能夠適應(yīng)惡劣環(huán)境的特性，與模式菌相比本研究中篩選的乳酸菌表現(xiàn)出更強(qiáng)的耐低溫特性。菌株Q5、Q6和Q7能在4 ℃環(huán)境下微弱生長，在10 ℃ 環(huán)境下生長良好，該結(jié)果與Pang等[13]從青藏高原分離乳酸菌研究結(jié)果相似，而Tohno等[14]分離的乳酸菌大部分都不能在10 ℃環(huán)境中生長。高靜[2]、楊楊[3]、秦麗萍[4]發(fā)現(xiàn)青藏高原乳酸菌與傳統(tǒng)商品乳酸菌相比可以利用更廣泛的糖源。本研究對所選4株優(yōu)良菌株進(jìn)行糖發(fā)酵試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)室所選的干酪乳桿菌和戊糖片球菌均不能利用乳糖，而其對應(yīng)的模式菌可以利用。編號為Q5的干酪乳桿菌可以利用山梨醇、苦杏仁苷、七葉苷和纖維二糖，而模式菌不可以利用，其具有更廣泛的糖源利用能力。本研究中與模式菌相比，只有部分乳酸菌可以利用更廣泛的糖源。本研究結(jié)果和上述文獻(xiàn)的結(jié)果有出入，可能是所選乳酸菌種間有差異。

本研究從當(dāng)雄地區(qū)藏嵩草和燕麥青貯樣品中分離得到的40株乳酸菌分屬于植物乳桿菌和戊糖片球菌兩個(gè)種。Ennahar等[15]從不同發(fā)酵時(shí)期的青貯飼料中分離得到的株菌，經(jīng)過16S rDNA序列分析分屬于腸球菌、明串珠菌屬、片球菌、乳桿菌屬和乳球菌屬。楊楊[3]對藏北嵩草附著乳酸菌進(jìn)行分離鑒定，從德慶、那曲古露和納木錯(cuò)地區(qū)藏北嵩草表面共分離得到的19株乳酸菌分屬于明串珠菌(Leuconostocmensenteroides)和魏斯氏(Weissella)乳酸菌兩個(gè)屬。本研究分離的乳酸菌和楊楊[3]的研究不一致，這可能是由于樣品來源地不同，微生物生存的微環(huán)境不同。徐婷等[16]對青海省人工種植的燕麥表面乳酸菌進(jìn)行分離鑒定后發(fā)現(xiàn)，植物乳桿菌、戊糖片球菌和干酪乳桿菌[16]與本研究中乳酸菌的鑒定結(jié)果相似，說明不同地區(qū)的同種飼草的乳酸菌種類既有相似又有不同。秦麗萍在對來自青藏高原青海省瑪沁縣的垂穗披堿草附著乳酸菌進(jìn)行分離鑒定后發(fā)現(xiàn)，所分離的108株乳酸菌分屬于18個(gè)種，其中就包括植物乳桿菌和戊糖片球菌[4]，說明不同地區(qū)的飼草，其微生物構(gòu)成既有聯(lián)系又有區(qū)別。另外，秦麗萍用滅菌綠汁發(fā)酵液進(jìn)行15和25 ℃下乳酸菌的篩選后確定清酒乳桿菌Q1、植物乳桿菌Q2、戊糖片球菌Q6作為優(yōu)良乳酸菌，與本研究結(jié)果不一致[4]，這說明綠汁發(fā)酵液滅菌與否對乳酸菌的生長有明顯影響。這可能是因?yàn)槲礈缇G汁發(fā)酵液中雜菌種類較多，與乳酸菌的生長發(fā)酵形成競爭，但是具體的競爭機(jī)理尚不明確。

MeDonald等[17]和Woolford[18]提出，在青貯過程中發(fā)揮作用的乳酸菌應(yīng)該具有統(tǒng)一的發(fā)酵途徑，有效利用可溶性碳水化合物，快速發(fā)酵產(chǎn)生足夠的乳酸，有一定的耐酸能力，使得青貯飼料pH值達(dá)到4.0左右，以抑制有害微生物的生長，提高青貯飼料品質(zhì)，維持青貯體系穩(wěn)定。由此可見產(chǎn)酸能力和耐酸能力是衡量乳酸菌在青貯過程中發(fā)酵性能的重要指標(biāo)。本研究對所分離的乳酸菌進(jìn)行10 ℃條件下MRS液體培養(yǎng)基的初篩，培養(yǎng)48 h后，表現(xiàn)較好的乳酸菌培養(yǎng)液pH值降低至5.0左右。而用未滅菌的綠汁發(fā)酵液進(jìn)行篩選時(shí)，10 ℃條件下發(fā)酵3 d后，培養(yǎng)液pH值由發(fā)酵前的6.3降低至5.4左右，尤其是編號為Q6的戊糖片球菌，其在綠汁發(fā)酵液篩選過程中不同溫度下pH值都較低；在對所選乳酸菌進(jìn)行不同pH值條件下的培養(yǎng)時(shí)發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)室所選的青藏高原棒狀乳桿菌比對應(yīng)的模式菌株具有更強(qiáng)的耐酸性。本研究所篩選的優(yōu)良乳酸菌有待進(jìn)一步驗(yàn)證其青貯性能。

本研究從燕麥、藏嵩草和垂穗披堿草中共分離出148株乳酸菌，篩選后最終確定編號為31(植物乳桿菌)、Q5(干酪乳桿菌)、Q6(戊糖片球菌)和Q7(棒狀乳桿菌)為青藏高原耐低溫優(yōu)良菌株，可作為當(dāng)?shù)貎?yōu)良發(fā)酵備選菌株。通過對其生理生化特性的研究發(fā)現(xiàn)，編號為Q5的干酪乳桿菌比與之對應(yīng)的模式菌具有更廣泛的糖源利用能力；棒狀乳桿菌Q7與其模式菌相比，具有更強(qiáng)的耐低溫與耐酸特性。

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Screening of Cryophilic Lacto-Bacteria from Several Qinghai-Tibet Plateau Herbages

XU Dong-mei1, CAO Lei2, JING Pei-xin1, ZHANG Yong-hui2, ZHANG Hong-mei3, ZHANG Wan-xiang2, GUO Xu-sheng1

(1.Schl.ofLifeSci.,StateKeyLab.ofGrassland&Agro-Ecosys.,LanzhouUni.,Lanzhou730000; 2.GansuProv.DisseminationSta.ofGrasslandTech.,Lanzhou730046; 3.Coll.ofPastoralAgric.Sci. &Technol.,StateKeyLab.ofGrassland&Agro-Ecosys.,LanzhouUni.,Lanzhou730020)

In order to screen lacto-bacteria (LAB) that can adapt low temperature fermentation in Qinghai-Tibet Plateau 148 strains fromElymusnutans, oat andKoeleriatibeticain Qinghai-Tibet Plateau were isolated. These strains were confirmed as cryophilic LAB by means of culture medium under 10 ℃ for different time (12, 24, 36 and 48 h) and rescreened by fermented in green juice at 10 ℃，15 ℃ and 25 ℃, as well as studied their physiological and biochemical characteristics. The results showed that strains 31 (Lactobacillusplantarum), Q5 (Lactobacilluscasei), Q6 (Pediococcuspentosaceus), and Q7 (Lactobacilluscoryniformis) performed higher activity and acid-producing ability in MRS medium and fermented in green juice, and the physiological and biochemical characteristics indexes indicted that Q5 could performed more kinds of carbohydrates than corresponding model strain, Q7 had stronger acid and low temperature resistance properties than model strain. The above four LAB strains can be alternative strains for low temperature fermentation of ensilage in Qinghai-Tibet Plateau.

Qinghai-Tibet Plateau; lacto-bacteria; green juice fermented broth; low temperature

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31272486)；甘肅省2016年草牧業(yè)試驗(yàn)試點(diǎn)和草業(yè)技術(shù)創(chuàng)新聯(lián)盟科技支撐項(xiàng)目(GCLM2016002)

許冬梅 女， 碩士研究生。研究方向?yàn)榍噘A飼料與乳酸菌發(fā)酵。E-mail: xudm15@lzu.edu.cn

* 通訊作者。男，教授，博士，博士生導(dǎo)師。主要從事的研究方向?yàn)榍嗖馗咴樗峋N質(zhì)資源發(fā)掘、創(chuàng)新與利用；飼料青貯技術(shù)及

2016-07-25；

2016-08-26

Q939.11+7

A

1005-7021(2017)03-0087-08

10.3969/j.issn.1005-7021.2017.03.014

營養(yǎng)價(jià)值評價(jià)。E-mail:guoxsh07@lzu.edu.cn