HSV Us3蛋白激酶對(duì)巨噬細(xì)胞生物學(xué)活性和凋亡的影響研究

吳建奇， 柴若楠， 木村吉延， 劉北星

(1.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 神經(jīng)外科，遼寧 沈陽(yáng) 110001；2.沈陽(yáng)軍區(qū)總醫(yī)院 變態(tài)反應(yīng)科，遼寧 沈陽(yáng) 110016；3.福井醫(yī)科大學(xué) 微生物學(xué)教研室，福井 日本 910-1193；4.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 免疫學(xué)教研室，遼寧 沈陽(yáng) 110122)

HSV Us3蛋白激酶對(duì)巨噬細(xì)胞生物學(xué)活性和凋亡的影響研究

吳建奇1， 柴若楠2， 木村吉延3， 劉北星4*

(1.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 神經(jīng)外科，遼寧 沈陽(yáng) 110001；2.沈陽(yáng)軍區(qū)總醫(yī)院 變態(tài)反應(yīng)科，遼寧 沈陽(yáng) 110016；3.福井醫(yī)科大學(xué) 微生物學(xué)教研室，福井 日本 910-1193；4.中國(guó)醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 免疫學(xué)教研室，遼寧 沈陽(yáng) 110122)

為探討單純皰疹病毒Us3基因及其編碼產(chǎn)物對(duì)LPS活化的巨噬細(xì)胞生物學(xué)活性和凋亡的影響，小鼠巨噬細(xì)胞系RAW246.7細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)-Us3重組質(zhì)粒并體外培養(yǎng)。利用免疫熒光技術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染率，ELISA方法檢測(cè)培養(yǎng)上清中TNF-α分泌水平，Annexin-V染色評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)染細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn),pcDNA3.1(+)-Us3重組質(zhì)粒可成功轉(zhuǎn)染至RAW246.7細(xì)胞，轉(zhuǎn)染率為10.3%。與空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組相比，pcDNA3.1(+)-Us3轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)上清中TNF-α分泌水平明顯升高，但凋亡細(xì)胞數(shù)量略有下降，證實(shí)Us3基因及其編碼蛋白在調(diào)控巨噬細(xì)胞細(xì)胞因子分泌活性及其活化細(xì)胞凋亡方面發(fā)揮一定作用。

Us3蛋白激酶基因；RAW246.7細(xì)胞；TNF-α；凋亡

單純皰疹病毒(herpes simplex virus，HSV)屬皰疹病毒科，有兩個(gè)血清型，可分別引起眼角膜炎、致死性腦炎及生殖器皰疹等嚴(yán)重危害人類(lèi)健康的疾病[1]。HSV為約80個(gè)基因的DNA病毒，其基因的一半以上為與病毒復(fù)制無(wú)直接關(guān)系的附加基因[2]。Us3即為HSV的附加基因，其產(chǎn)物Us3蛋白激酶具有多功能性，其中Us3介導(dǎo)的病毒抗宿主細(xì)胞凋亡功能受到密切關(guān)注。 研究發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)細(xì)胞系及小鼠感染模型中，Us3蛋白激酶通過(guò)影響細(xì)胞凋亡途徑相關(guān)因子的活性介導(dǎo)HSV抗宿主細(xì)胞凋亡，進(jìn)而在HSV病毒的增殖及擴(kuò)散方面發(fā)揮重要作用[3-6]。巨噬細(xì)胞作為連接固有免疫應(yīng)答和適應(yīng)性免疫應(yīng)答的橋梁細(xì)胞，HSV病毒、特別是Us3蛋白激酶對(duì)巨噬細(xì)胞生物學(xué)活性及凋亡的影響作用值得研究。本研究利用含HSV Us3基因的DNA質(zhì)粒-pcDNA3.1(+)-Us3轉(zhuǎn)染巨噬細(xì)胞系RAW246.7細(xì)胞株，探討Us3基因?qū)PS活化巨噬細(xì)胞TNF-α分泌活性及活化巨噬細(xì)胞凋亡的影響，為闡明Us3蛋白激酶在抗宿主細(xì)胞凋亡中的作用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 重組DNA質(zhì)粒 pcDNA3.1(+)-Us3(HSV-2)質(zhì)粒, 由愛(ài)滋醫(yī)科大學(xué)森勇博士惠贈(zèng)。

1.1.2 細(xì)胞株 小鼠巨噬細(xì)胞系RAW246.7細(xì)胞，為本實(shí)驗(yàn)室保存細(xì)胞株。用含10% FCS 的RPMI 1640培養(yǎng)液常規(guī)傳代培養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 重組質(zhì)粒體外培養(yǎng)及表達(dá) 轉(zhuǎn)染前1天，在放有載玻片的35 mm培養(yǎng)皿中加入RAW246.7細(xì)胞，37 ℃、5%CO2孵箱培養(yǎng)細(xì)胞至單層。將含4 μg質(zhì)粒DNA和10 μL脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染液加入其中，培養(yǎng)4 h后棄轉(zhuǎn)染液，加入含10% FCS的RPMI 1640繼續(xù)培養(yǎng)至48 h。取出載玻片，丙酮固定后，用抗Us3蛋白激酶單克隆抗體染色，4 ℃過(guò)夜, 加FITC標(biāo)記的二抗，熒光顯微鏡下觀察質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染和表達(dá)情況。同設(shè)空質(zhì)粒和細(xì)胞對(duì)照。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染率用熒光顯微鏡40倍視野下熒光染色細(xì)胞數(shù)與同一視野普通光源下細(xì)胞總數(shù)比值的百分率來(lái)表示：

a：熒光染色細(xì)胞數(shù)；A：相同視野普通光源下的細(xì)胞數(shù)。

1.2.2 細(xì)胞因子檢測(cè) 將RAW246.7細(xì)胞接種于6孔板培養(yǎng)至單層。轉(zhuǎn)染DNA質(zhì)粒 4 h后，加入含10 μg/mL LPS的10% FCS RPMI 1640繼續(xù)培養(yǎng)至48 h，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清，ELISA試劑盒檢測(cè)細(xì)胞因子TNF-α含量。

1.2.3 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn) 將細(xì)胞培養(yǎng)于含LPS的10% FCS RPMI 1640培養(yǎng)液中72 h后制備細(xì)胞懸液，按照凋亡試劑盒說(shuō)明書(shū)用Annexin V-FITC和Propidium iodide (購(gòu)自BD Pharmingen)染色細(xì)胞。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用Mann-Whitney U檢驗(yàn)分析重組質(zhì)粒(pcDNA3.1-Us3)與對(duì)照空質(zhì)粒組(pcDNA3.1)的顯著性差異。P<0.05判定為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 活化RAW246.7細(xì)胞的最適LPS刺激濃度

用含不同濃度LPS的RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)RAW246.7細(xì)胞, 37 ℃、5% CO2培養(yǎng)48 h后，收集培養(yǎng)上清, 檢測(cè)TNF-α水平。結(jié)果顯示，在LPS終濃度為10 μg/mL的培養(yǎng)條件下，RAW246.7細(xì)胞培養(yǎng)上清中TNF-α含量最高，提示10 μg/mL是本實(shí)驗(yàn)體系中活化RAW246.7細(xì)胞的最適LPS濃度(圖1)。

圖1 不同LPS刺激濃度下RAW246.7細(xì)胞培養(yǎng)上清中TNF-α分泌水平Fig.1 Levels of TNF-αin the supernatant of cultured RAW246.7cells by stimulation with different concentrations of LPS

2.2 DNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染RAW246.7細(xì)胞

將質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-Us3及空質(zhì)粒pcDNA3.1(+)轉(zhuǎn)染至RAW246.7細(xì)胞，免疫熒光染色后觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)染情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)pcDNA3.1(+)-Us3質(zhì)?？沙晒D(zhuǎn)入目的細(xì)胞，并在細(xì)胞中表達(dá)Us3基因編碼蛋白，即Us3蛋白激酶。轉(zhuǎn)染48 h后，在熒光顯微鏡下可觀察到發(fā)出綠色熒光的細(xì)胞(圖2), 而空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組及LPS刺激組未發(fā)現(xiàn)熒光陽(yáng)性細(xì)胞。pcDNA3.1(+)-Us3質(zhì)粒對(duì)RAW246.7細(xì)胞轉(zhuǎn)染率為10.3%。

圖2 pcDNA3.1(+)-Us3重組質(zhì)粒 (a) 和空質(zhì)粒pcDNA3.1(+) (b) 轉(zhuǎn)染RAW246.7細(xì)胞后48 h的免疫熒光照片F(xiàn)ig.2 Fluorescence staining of RAW246.7 cells that were transfected with recombinant plasmids of pcDNA3.1(+)-Us3 (a) and blank plasmid of pcDNA3.1(+) (b) for 48 h

2.3 Us3對(duì)LPS活化的RAW246.7細(xì)胞TNF-α分泌活性的影響

將轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)-Us3質(zhì)粒及空質(zhì)粒的RAW246.7細(xì)胞培養(yǎng)于含10 μg/mL LPS的10% FCS RPMI 1640中，檢測(cè)培養(yǎng)上清中TNF-α水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與空質(zhì)粒組及LPS單純刺激組相比，pcDNA3.1(+)-Us3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組RAW246.7細(xì)胞培養(yǎng)上清中TNF-α分泌水平有所升高，提示Us3對(duì)巨噬細(xì)胞TNF-α分泌活性具有一定的促進(jìn)作用(圖3)。

圖3 轉(zhuǎn)染DNA質(zhì)粒的LPS活化RAW246.7細(xì)胞培養(yǎng)上清中TNF-α分泌水平Fig.3 Cytokine production from LPS-stimulated RAW246.7 cells transfected with plasmid DNA*與空質(zhì)粒pcDNA3.1(+)相比,P<0.01* Significant difference (P<0.01, by Mann-Whitney U-test), compared with corresponding pcDNA3.1(+) and Mock group

2.4 Us3對(duì)LPS活化的RAW246.7細(xì)胞凋亡活性的影響

利用凋亡檢測(cè)試劑盒檢測(cè)巨噬細(xì)胞系RAW246.7細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)-Us3基因的RAW246.7細(xì)胞死亡率低于空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組和LPS刺激組，提示Us3基因?qū)PS活化誘導(dǎo)的RAW246.7細(xì)胞凋亡起到一定的抑制作用(表1)。

表1 Us3蛋白激酶對(duì)LPS活化的RAW246.7細(xì)胞凋亡的影響

注：*與空質(zhì)粒pcDNA3.1(+)組相比，P<0.05

3 討 論

本研究利用含HSV Us3目的基因的DNA質(zhì)粒，采用體外細(xì)胞培養(yǎng)體系，探討Us3基因及其編碼蛋白對(duì)巨噬細(xì)胞生物學(xué)活性和凋亡的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)重組質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-Us3可成功轉(zhuǎn)入目的細(xì)胞，并在細(xì)胞中表達(dá)Us3基因編碼的蛋白，即Us3蛋白激酶，并一定程度上提升LPS活化巨噬細(xì)胞的細(xì)胞因子TNF-α的分泌水平。推測(cè)pcDNA3.1(+)-Us3轉(zhuǎn)染的RAW246.7細(xì)胞培養(yǎng)上清中高水平TNF-α可能源于以下兩個(gè)方面：其一，Us3基因的轉(zhuǎn)染改變了RAW246.7細(xì)胞生物學(xué)活性，使其對(duì)LPS的刺激能更好地反應(yīng)活化，由此產(chǎn)生更多的細(xì)胞因子；其二，Us3基因通過(guò)種種相關(guān)機(jī)制抑制RAW246.7細(xì)胞的凋亡，活化RAW246.7細(xì)胞存活時(shí)間延長(zhǎng)，由此可分泌更多的細(xì)胞因子，從而導(dǎo)致培養(yǎng)上清中TNF-α水平的上升。與轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染了重組質(zhì)粒的RAW246.7細(xì)胞死亡率明顯下降，提示Us3基因一定程度上抑制LPS活化RAW246.7細(xì)胞的凋亡。

迄今為止，單純皰疹病毒Us3蛋白激酶調(diào)控細(xì)胞凋亡的作用機(jī)理尚不十分清楚。有研究表明，Us3基因可通過(guò)抑制山梨醇誘導(dǎo)的JNK磷酸化抑制山梨醇誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，當(dāng)Us3表達(dá)上調(diào)時(shí)，JNK上游激酶MKK4/SEK1磷酸化明顯減弱，提示Us3蛋白激酶抑制其磷酸化，從而在外部途徑上游阻斷細(xì)胞凋亡[3]。Us3是HSV的一個(gè)多功能基因，其編碼的蛋白分子是絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，該酶具有自磷酸化活性，且酶活性區(qū)域傾向于結(jié)合富含堿性氨基酸殘基的底物[7]。多種HSV蛋白均被報(bào)道為Us3蛋白激酶的底物[8]。Bcl-2家族成員Bad可被Us3蛋白激酶磷酸化，Us3還可阻斷Bax和Bid過(guò)表達(dá)介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[4-5]，表明Us3基因也可通過(guò)影響細(xì)胞凋亡內(nèi)部途徑相關(guān)因子的活性調(diào)控細(xì)胞凋亡。盡管本研究未檢pcDNA3.1(+)-Us3轉(zhuǎn)染RAW246.7細(xì)胞內(nèi)各種凋亡相關(guān)蛋白激酶活性或磷酸化方面的變化，但推測(cè)Us3基因及其編碼產(chǎn)物可能依然是通過(guò)細(xì)胞內(nèi)、外兩條凋亡途徑，影響RAW246.7細(xì)胞的凋亡活性。

HSV之所以能在宿主細(xì)胞內(nèi)長(zhǎng)期潛伏并反復(fù)激發(fā)，與其抗凋亡功能密切相關(guān)。Us3是介導(dǎo)HSV抗宿主細(xì)胞凋亡的重要基因。通過(guò)對(duì)其深入研究，對(duì)闡明HSV感染過(guò)程以及增殖擴(kuò)散機(jī)制等具有積極意義。

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Effects of HSV Us3 Protein Kinase on Bio-Activity and Apoptosis of Megaphage

WU Jian-qi1, CHAI Ruo-nan2, KIMURA Yoshi-nobu3, LIU Bei-xing4

(1.Dept.ofNeurosurgery,the1stAffil.Hosp.ofChinaMed.Uni.,Shenyang110001; 2.ThePLACtr.ofRespir. &Allerg.Dis.Diagnos.Manag’t,theGen.Hosp.ofShenyangMil.Comm.,Shenyang110016; 3.Teach. &Res.Div.ofMicrobiol.,FukuiMed.Uni.,Japan910-1193; 4.Teach&Res.Div.ofImmun.,Schl.ofBasicMed.Sci.,ChinaMed.Uni.,Shenyang110122)

In order to investigate the effect of Us3 gene of protein kinase of herpes simplex virus (HSV) on regulating cytokine production and apoptosis of RAW246.7 cells after LPS activation, RAW246.7 cells were transfected with recombinant plasmid of pcDNA3.1(+)-Us3 and culturedinvitro. Immunofluorescence staining was used for identification of transfection rate. The level of TNF-α in the cultured supernatant was detected by ELISA. And evaluated apoptosis of transfected cells with Annexin-V staining. The results showed that recombinant plasmid pcDNA3.1(+)-Us3 could successfully transfected into RAW246.7 with transfection rate at 10.3%. As compared with empty plasmid transfected group, the secretion level of TNF-α in supernatant transfected cells by pcDNA3.1(+)-Us3 was apparently ascent, but the amount of apoptosis cells were slightly descent, thus proved that Us3 gene and it coded protein play a certain role in regulating and controlling cytokine secretive activity by macrophage as well as in activating cell apoptosis.

Us3 protein kinase gene; RAW246.7 cells; TNF-α; apoptosis

沈陽(yáng)市科技計(jì)劃支持項(xiàng)目(F10-205-1-34)

吳建奇 男，碩士研究生。主要研究方向?yàn)槟[瘤與免疫。E-mail:2569660477@qq.com

* 通訊作者。女，教授，博士生導(dǎo)師。研究方向?yàn)榭垢腥久庖?。E-mail:bxliu@mail.cmu.edu.cn

2016-07-18；

2016-08-26

Q939.93

A

1005-7021(2017)03-0048-04

10.3969/j.issn.1005-7021.2017.03.009