人乳頭瘤病毒在宮頸鱗癌宮旁組織中的表達及意義

楊 卓， 陳英漢， 顧佳暉， 劉巋然， 李馨慧， 王丹波

(1.中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院 婦產(chǎn)科，遼寧 沈陽 110004；2.中國醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院 婦產(chǎn)科，遼寧 沈陽 110000)

人乳頭瘤病毒在宮頸鱗癌宮旁組織中的表達及意義

楊 卓1， 陳英漢1， 顧佳暉1， 劉巋然1， 李馨慧1， 王丹波2

(1.中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院 婦產(chǎn)科，遼寧 沈陽 110004；2.中國醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院 婦產(chǎn)科，遼寧 沈陽 110000)

為研究高危型人乳頭瘤病毒(high-risk human papillomavirus，hr-HPV)在宮頸鱗癌宮旁組織中的表達及意義，采用免疫組織化學(xué)技術(shù)對51例宮頸鱗癌患者術(shù)后宮旁組織不同位點的hr-HPV表達情況進行檢測，應(yīng)用重復(fù)測量設(shè)計的方差分析及單因素分析方法進行統(tǒng)計。hr-HPV在宮旁組織中的表達隨著距宮頸距離的增加呈明顯的梯度下降趨勢(P<0.05)，在不同臨床分期、宮頸浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組內(nèi)表達存在差異(P<0.05)，當(dāng)臨床分期ⅠB1期、宮頸浸潤深度≤1/2以及無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移時，hr-HPV在距離宮頸2 cm處主韌帶、骶韌帶及距離宮頸3 cm處陰道中表達開始與正常對照組無差異(P>0.05)。結(jié)果表明，部分早期宮頸鱗癌患者可選擇Ⅱ型改良式根治性子宮切除術(shù)，但陰道切除仍推薦>3 cm。

人乳頭瘤病毒；宮頸鱗癌；宮旁組織

我國宮頸浸潤癌(invasive cervical cancer，ICC)以每年約13.15萬新發(fā)病例的速度在增長，年輕患者及早期診斷患者比例逐年上升[1]。目前對于全部IA2-ⅠB1期患者均采用根治性子宮切除術(shù)，由此給患者帶來的膀胱、直腸等功能障礙及性功能障礙等至今仍是臨床面臨的最大問題。婦科腫瘤醫(yī)生已嘗試探討對部分ⅠB1期患者適當(dāng)縮小宮旁組織切除范圍，進一步保護周圍臟器功能、性功能，降低術(shù)后并發(fā)癥幾率，提高生活質(zhì)量，目前觀察總生存率及預(yù)后未見影響，但如何篩選出部分早期患者及宮旁組織切除的安全范圍仍無基礎(chǔ)理論依據(jù)支持。高危型人乳頭瘤病毒(high-risk human papillomavirus，hr-HPV)的感染是宮頸浸潤癌發(fā)病的核心因素[2]，其持續(xù)活性是發(fā)生和進展到高級別宮頸病變及宮頸癌的必要條件，也是宮頸癌疾病進展過程中的預(yù)示性標(biāo)記物[3]。因此，本研究應(yīng)用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測51例宮頸鱗癌患者術(shù)后宮旁組織不同離心位點的hr-HPV表達情況，分析其與臨床分期、病理浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理分化的相關(guān)性，以期為進一步探討宮頸癌個體化手術(shù)范圍提供客觀依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對象與分組 選取2014年1月至2016年1月間在中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院診治的早期宮頸浸潤癌患者為實驗組，共計51例，中位年齡48.28歲(36歲～52歲)，根據(jù)臨床分期分為兩組：ⅠB1期組23例；>ⅠB1期組28例。對照組選擇因其他良性疾病選擇全子宮切除及hr-HPV16、18陽性的手術(shù)患者，共計20例。全部病例均經(jīng)盛京醫(yī)院倫理委員會審批，術(shù)前患者簽署知情同意書，術(shù)后均經(jīng)病理再次確認診斷，同時證明宮旁無癌浸潤。

1.1.2 實驗組入選標(biāo)準(zhǔn)及排除標(biāo)準(zhǔn) ①入選標(biāo)準(zhǔn)：原發(fā)宮頸鱗癌，未進行術(shù)前化療或放療，無其他腫瘤病史；行III型根治性子宮切除術(shù)，即主韌帶、骶韌帶及陰道切除范圍>3 cm；hr-HPV16、18陽性；術(shù)后病理確定無宮旁組織受累。 ②排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他惡性腫瘤；其他型HPV病毒感染或無HPV感染；術(shù)前接受新輔助化療等其他治療；行II型根治性子宮切除術(shù)，宮旁組織手術(shù)切除范圍<3 cm；病理診斷為其他病理類型或者宮旁組織受累。

1.2 方法

1.2.1 宮旁組織獲取 實驗組：宮頸癌根治性子宮切除術(shù)后立即取主、骶韌帶及陰道的不同位點新鮮組織，各組距宮頸1、2 及3 cm處分別標(biāo)記為主韌帶1、主韌帶2、主韌帶3，骶韌帶1、骶韌帶2、骶韌帶3及陰道1、陰道2、陰道3，見圖1。對照組：全子宮切除術(shù)中于切除斷端獲取正常主韌帶、骶韌帶及陰道組織。

圖1 骶韌帶及陰道的靶位點選取示意圖Fig.1 Target site selection of cardinal ligament, sacral ligament and vagina

實驗組新鮮標(biāo)本分成兩份，一份浸泡于福爾馬林、石蠟包埋，隨機多點抽取石蠟切片進行常規(guī)HE染色，確定病理無轉(zhuǎn)移；另一份液氮迅速凍存后移至-80 ℃冰箱保存。

1.2.2 免疫組織化學(xué)檢測hr-HPV16、18的表達 利用過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素染色試劑盒進行ABC免疫組化法檢測hr-HPV16、18的表達。蠟塊連續(xù)切片，厚度4～6 μm，每個位點連續(xù)切片10張；一抗為生物素標(biāo)記山羊抗兔大鼠小鼠豚鼠IgG，調(diào)節(jié)濃度為1∶100；最后應(yīng)用DAB顯色。

1.2.3 結(jié)果讀取及評分標(biāo)準(zhǔn) 結(jié)果由雙人雙盲進行光學(xué)顯微鏡觀察，按陽性細胞百分比及陽性細胞染色強度評分，HIS=X×Y，使用免去一抗的空白對照作為陰性對照。 X代表陽性細胞的百分比對應(yīng)的評分：陽性細胞顯色數(shù)≤25%，X=1；陽性細胞顯色數(shù)26%～50%，X=2；陽性細胞顯色數(shù)51%～75%，X=3; 陽性細胞顯色數(shù)>75%，X=4。 Y代表陽性細胞染色強度:不顯色，Y=1；淺黃色，Y=2；棕黃色，Y=3；深黃，Y=4。

1.2.4 統(tǒng)計學(xué)處理 使用SPSS21.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，檢測結(jié)果以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，應(yīng)用重復(fù)測量設(shè)計的方差分析、單因素方差分析進行各靶組織及不同分組間hr-HPV16、18的表達差異比較，P<0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 各靶組織中hr-HPV16、18的表達情況

由圖2、圖3可以看出，隨著距宮頸的距離增加(1、2、3 cm)hr-HPV16、18在主韌帶、骶韌帶、陰道中呈明顯的梯度下降趨勢(P<0.05)。

2.2 hr-HPV16、18表達與臨床分期、病理浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理分化的相關(guān)性

hr-HPV16、18表達在不同臨床分期、宮頸浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組間表達存在差異(P<0.05)；而在不同病理分化組間表達均無差異，見表1。進一步的研究將篩選同時滿足ⅠB1期、宮頸浸潤深度≤1/2及無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移低危因素的設(shè)為“早期組”，其他設(shè)為“晚期組”，分別進行各位點再比較。

圖2 hr-HPV16、18在宮旁組織中的陽性表達Fig.2 The positive expression of hr-HPV16、18 in the parametriuma：主韌帶；b：骶韌帶；c：陰道；圖3同a: cardinal ligament;b: sacral ligament;c: vagina;Figure 3 is the same

圖3 hr-HPV16、18在距宮頸1、2、3 cm宮旁組織中的表達Fig.3 The expression of HPV in parametrium with the increasing distance from the cervix (1 cm，2 cm，3 cm)

浸潤深度 淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移 病理分化 ≤1/2(N=14)>1/2(N=9)無(N=20)有(N=3)低分化(N=2)中分化(N=17)高分化(N=4)ⅠB1期(N=23)主韌帶主15.14±1.03*6.22±1.20*△5.40±1.14*6.67±1.16*6.00±0.00*5.65±1.06*5.00±2.00*主22.57±0.65*3.00±0.87*2.60±0.68*3.67±0.58*△2.50±0.712.76±0.75*2.75±0.96主31.43±0.761.78±0.831.55±0.821.67±0.581.00±0.001.53±0.802.00±0.82主C1.90±0.741.90±0.741.90±0.741.90±0.741.90±0.741.90±0.741.90±0.74骶韌帶骶15.14±1.29*6.89±2.26*△5.80±2.04*6.00±0.00*10.00±2.83*5.53±1.33*5.00±1.16*骶22.57±0.653.44±0.65*△2.85±0.99*3.33±0.58*4.50±2.12*2.82±0.73*2.50±0.58骶31.29±0.47*1.78±0.671.45±0.61*1.67±0.582.00±1.411.41±0.51*1.50±0.58骶C2.10±0.742.10±0.742.10±0.742.10±0.742.10±0.742.10±0.742.10±0.74陰道陰14.57±0.94*6.00±1.73*△5.00±1.38*6.00±2.00*5.00±1.41*5.18±1.46*5.00±2.00*

續(xù)表1

注：主C、骶C、陰C為正常對照組;*表示與正常對照相比較P<0.05;△表示病理因素組內(nèi)比較P<0.05

2.3 “早期組”及“晚期組”各靶位點hr-HPV16、18的表達

hr-HPV16、18表達在“早期組”主、骶韌帶2 cm處與對正常照組無差異，在陰道3 cm處與正常對照組無差異，而hr-HPV16、18表達在“晚期組”于主、骶韌帶3 cm處與正常對照組無差異，在陰道3 cm處仍與對照組有顯著差異(P<0.05)，見圖4。

圖4 hr-HPV16、18在“早期組”及“晚期組”各靶位點的表達情況Fig.4 The expressions of hr-HPV16、18 in different loci in "the early group" and "the advanced group" *表示與正常對照組相比表達有差異，P<0.05* means compareing with the normal control group, P<0.05

3 討 論

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對腫瘤治療越來越追求個體化治療方案的制定，當(dāng)前的趨勢是將之前統(tǒng)一在同一臨床分期的腫瘤根據(jù)臨床特點等細化分類，更有個體化、人性化的選擇治療方案。Ⅱ型改良式根治性子宮切除術(shù)，與Ⅲ型根治性子宮切除術(shù)最大的區(qū)別在于在宮旁約1.5～2.0 cm的子宮動脈與輸尿管交叉處切斷結(jié)扎子宮動脈，部分切除主韌帶和子宮骶韌帶，既保證了腫瘤“A”級根治手術(shù)切緣距離癌灶至少1 cm的根治范圍[7-8]，同時很好地保留了營養(yǎng)膀胱、遠端輸尿管及直腸的神經(jīng)和血管，降低了并發(fā)癥的發(fā)病率，從而提高患者的生存質(zhì)量。當(dāng)前基于對宮頸癌基礎(chǔ)和臨床的深入認識以及多元化治療方式的配合與進展，宮頸癌的手術(shù)范圍與幾十年前的手術(shù)方式相比，總體上趨向于縮小。那么對于相對早期、無高危因素的患者是否可以縮小手術(shù)范圍，如行Ⅱ型改良式根治性子宮切除術(shù)，而不影響治愈率及生存率呢？目前，Kodama 等[9]、Gemer等[10]、Kodama等[11]進行的多項臨床研究已經(jīng)對這一焦點問題進行了探討，但目前少有基礎(chǔ)實驗對此進行驗證。

宮頸癌宮旁組織受累是腫瘤轉(zhuǎn)移的復(fù)雜過程，致病基因hr-HPV16、18的整合、表達起著關(guān)鍵的作用。本研究結(jié)果表明，hr-HPV16、18表達在實驗組宮旁組織中隨著距宮頸的距離增加(1、2、3 cm)呈明顯的梯度下降趨勢(P<0.05)，不同臨床分期、宮頸浸潤深度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況下hr-HPV16、18的表達有差異(P<0.05)，這與其他臨床研究的結(jié)果基本符合。Lee等的臨床研究表明，通過對宮頸癌術(shù)后患者病理情況統(tǒng)計，僅約有4%～11%的患者存在宮旁累及[12]，當(dāng)腫瘤直徑≤2 cm，無宮頸深肌層浸潤，無淋巴血管間隙浸潤，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等情況時，宮旁受累的風(fēng)險明顯下降[11，13]。本研究結(jié)果也表明當(dāng)同時滿足臨床分期ⅠB1期、宮頸浸潤深度≤1/2以及無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的低危因素，即“早期組”時，hr-HPV16、18在距離宮頸2 cm處主韌帶、骶韌帶中表達開始與正常對照組無差異，在距離宮頸3 cm處陰道中表達與正常對照組無差異；而“晚期組”hr-HPV16、18在距離宮頸3 cm處的各組宮旁組織中表達仍有差異，提示可考慮縮小此類患者宮旁主、骶韌帶的手術(shù)切除范圍，采用Ⅱ型改良式根治性子宮切除術(shù)，保留營養(yǎng)膀胱、遠端輸尿管及直腸的神經(jīng)和血管，減少手術(shù)創(chuàng)傷，降低并發(fā)癥風(fēng)險，在保證治療腫瘤、延長腫瘤患者生存的同時提高生存質(zhì)量[14-16]。

本研究結(jié)果顯示，陰道3 cm切緣處在晚期組hr-HPV16、18表達仍顯現(xiàn)出與正常對照組有差異，而早期組在3 cm處方顯現(xiàn)出與對照組無差異，是因為HPV感染彌漫性導(dǎo)致，還是說明無論早期還是晚期，陰道切除范圍仍然保證>3 cm才更安全，有待進一步完善研究論證。同時本研究僅檢測了hr-HPV16、18一種指標(biāo)在宮旁組織的表達情況，具有一定局限性，應(yīng)進一步檢測與宮頸癌侵襲、轉(zhuǎn)移相關(guān)的其他因子在宮旁組織中的表達情況，以驗證研究結(jié)果。

總之，hr-HPV16、18在宮頸鱗癌宮旁組織中的表達隨著距宮頸的距離增加呈明顯的梯度下降趨勢，并且與臨床分期、宮頸浸潤深度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移病理因素相關(guān)，當(dāng)同時滿足臨床分期ⅠB1期、宮頸浸潤深度≤1/2以及無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的低危因素，hr-HPV16、18在距離宮頸2 cm處主韌帶、骶韌帶中表達與正常對照組無差異，在距離宮頸3 cm處陰道中表達與正常對照組無差異，提示可考慮縮小此類患者宮旁主、骶韌帶的手術(shù)切除范圍，采用Ⅱ型改良式根治性子宮切除術(shù)，但陰道切除范圍仍推薦>3 cm。

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Human Papillomavirus Expressions in Parametrium of Cervical Squamous Carcinoma and Its Clinical Significance

YANG Zhuo1, CHEN Ying-han1, GU Jia-hui1, LIU Kui-ran1, LI Xin-hui1, WANG Dan-bo2

(1.Dept.ofObstet&Gynecol,Affil.Hosp.Shengjing,ChinaMed.Uni.,Shenyang110004; 2.Dept.ofObstet&Gynecol,CancerHosp.,ChinaMed.Uni.,Shenyang110000)

Expression of high-risk human papillomavirus (hr-HPV) in parametrium of cervical squamous carcinoma and its significance was studied adopting immunohistochemistry in parametrium of 51 patients with cervical squamous carcinoma after operation, from the cancer tissue adjacent to different sites of parametrium foci to carry out tests and detection, and applied repeated measurement design to carry out statistics for analyses of variance as well as analyses of single factor. In the parametrium with increasing distance from the cervix, the expressions of hr-HPV showed a trend of obvious gradient descent (P<0.05). The expression of hr-HPV existed differences between groups in different clinical stage, cervical infiltration depth, within tissue in lymph node metastasis expression (P<0.05). When clinical stage at ⅠB1, the infiltration depth of cervical ≤1/2 as well as no lymph node metastasis, the expression of hr-HPV has no difference with the normal control group in the cardinal ligaments at 2 cm, sacral ligaments at 2 cm, and in vaginal at 3 cm (P>0.05). The results showed that part of early stage cervical cancer patients could choose individualized typeⅡ modified radical hysterectomy, but vaginal removal by >3 cm is still recommended.

human papillomavirus; cervical squamous carcinoma; parametrium

遼寧省自然科學(xué)基金項目(2014021029)；中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院科研基金項目(ME66)

楊卓 女，講師，主治醫(yī)師。主要從事宮頸病變及宮頸癌的臨床及基礎(chǔ)研究。

Tel：024-23892617，E-mail：yangz@sj-hospital.org

2017-03-14；

2017-03-23

Q939.47；R711.74

A

1005-7021(2017)03-0043-05

10.3969/j.issn.1005-7021.2017.03.008