柚子皮黑曲霉的分離鑒定及產(chǎn)酶特性研究

張超鳳, 汪雨晨, 陳衛(wèi)平, 張鳳英

(江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，江西 南昌 334450)

柚子皮黑曲霉的分離鑒定及產(chǎn)酶特性研究

張超鳳, 汪雨晨, 陳衛(wèi)平, 張鳳英*

(江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，江西 南昌 334450)

對(duì)柚子皮上自然生長(zhǎng)的黑曲霉進(jìn)行分離鑒定，并探討其產(chǎn)酶特性。以平板稀釋法從柚子皮上分離出一株霉菌菌株，通過(guò)觀察其形態(tài)特征和培養(yǎng)特征，對(duì)照《真菌鑒定手冊(cè)》判定該菌株的種屬；采用鑒定培養(yǎng)基法對(duì)其產(chǎn)酶特性進(jìn)行分析。根據(jù)柚子皮的成分特性，以干柚子皮為主要原料，該菌為生產(chǎn)菌株，采用固態(tài)發(fā)酵法探究培養(yǎng)基的成分、柚子皮含量、培養(yǎng)基初始含水量及發(fā)酵時(shí)間4個(gè)因素對(duì)纖維素酶活力的影響。結(jié)果表明，該菌株為黑曲霉(Aspergillusnige)，可產(chǎn)淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶、果膠酶；固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中添加柚子皮12 g，麩皮0.5 g和(NH4)2SO40.5 g，培養(yǎng)基初始含水量保持在68.5 mL/100 g，培養(yǎng)時(shí)間控制在60 h左右時(shí)纖維素酶產(chǎn)量較高。

柚子皮；黑曲霉；固態(tài)發(fā)酵；纖維素酶

黑曲霉(Aspergillusnige)屬半知菌亞門、絲孢綱、絲孢目、叢梗孢科，是一種常見(jiàn)的繁殖能力較強(qiáng)的真菌，且又是不產(chǎn)生毒素的安全菌種，因而被人類長(zhǎng)期利用[1]。黑曲霉對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求不高，在含有碳源、氮源及微量元素的培養(yǎng)基中就能生長(zhǎng)。黑曲霉可產(chǎn)生許多酶類，包括α-淀粉酶、纖維素酶、過(guò)氧化氫酶、果膠酶、糖化酶和蛋白酶等，是常用的工業(yè)酶制劑生產(chǎn)菌株[2]。由于其生產(chǎn)的酶制劑具有安全性好、應(yīng)用范圍廣的特點(diǎn)而越來(lái)越受到人們的重視[3]。黑曲霉是纖維素酶產(chǎn)量最高的菌株之一[4]，纖維素酶不僅在一些傳統(tǒng)行業(yè)具有應(yīng)用價(jià)值，而且在紡織、造紙、單細(xì)胞發(fā)酵和環(huán)保等新興領(lǐng)域具有巨大的市場(chǎng)潛力[5]。 纖維素酶的生產(chǎn)方式分為液體發(fā)酵和固態(tài)發(fā)酵兩種，固態(tài)發(fā)酵具有成本低廉、工藝簡(jiǎn)單的優(yōu)點(diǎn)，因此被國(guó)內(nèi)大部分廠家所采用[6]。 黑曲霉在土壤、水果、糧食等植物原料或產(chǎn)品中廣泛存在，在腐爛的柚子皮上也會(huì)大量生長(zhǎng)。柚子作為我國(guó)主要水果之一，在南方地區(qū)大面積種植，柚子皮占到全重的54%～55%。我國(guó)對(duì)柚子皮的利用率很低，每年都有很多柚子皮被當(dāng)做廢棄物扔掉，造成資源浪費(fèi)[7]。柚子皮含有多種營(yíng)養(yǎng)成分，適合微生物的生長(zhǎng)，白色絮狀層含有大量的纖維素[8]。目前，工業(yè)上利用真菌生產(chǎn)纖維素酶的固態(tài)發(fā)酵基料主要為麥麩、稻殼、秸稈等，利用柚子皮為原料固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)酶的研究較少。 因此本研究試圖從柚子皮上自然生長(zhǎng)的霉菌中分離出適合用柚子皮固態(tài)發(fā)酵法產(chǎn)纖維素酶的菌株，以期為柚子皮的綜合利用開(kāi)辟新途徑，也為真菌工業(yè)化固態(tài)發(fā)酵柚子皮提取纖維素酶提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 柚子皮 福建琯溪蜜柚皮，購(gòu)自江西農(nóng)業(yè)大學(xué)校園水果店。

1.1.2 培養(yǎng)基 PDA培養(yǎng)基；酪素培養(yǎng)基：參照文獻(xiàn)[9]；剛果紅培養(yǎng)基：參照文獻(xiàn)[10]；果膠瓊脂培養(yǎng)基：參照文獻(xiàn)[11]；固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基：烘干碾碎的柚子皮適量，麩皮0.5 g、(NH4)2SO40.5 g、水適量，pH自然。

1.2 方法

1.2.1 菌株的分離純化 將柚子皮置陰涼處，待出現(xiàn)明顯黑色霉菌后，采用平板劃線法分離出單菌落,再使用孢子懸液平板稀釋法純化菌株，將其接種至斜面培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)48 h，于4 ℃冰箱中備用

1.2.2 菌種鑒定 ①菌落特征觀察：挑取上述6支少量斜面菌體點(diǎn)接于PDA培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)24～72 h，觀察菌落特征與生長(zhǎng)變化；②菌體特征觀察：采用載片培養(yǎng)法，在顯微鏡下觀察菌體的特征結(jié)構(gòu)，并用顯微測(cè)微尺測(cè)量菌體各部分結(jié)構(gòu)的大小。

1.2.3 菌株產(chǎn)酶鑒定 ①產(chǎn)淀粉酶鑒定：從斜面挑取少量菌體點(diǎn)接于PDA培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)72 h，在培養(yǎng)基內(nèi)滴加適量碘液，觀察菌落周圍是否有淀粉分解圈產(chǎn)生；②產(chǎn)蛋白酶鑒定：從斜面挑取少量菌體點(diǎn)接于酪素培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)72 h，觀察菌落周圍是否有水解圈產(chǎn)生；③產(chǎn)纖維素酶鑒定：從斜面挑取少量菌體點(diǎn)接于剛果紅培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)72 h，觀察菌落周圍是否有水解圈產(chǎn)生；④產(chǎn)果膠酶鑒定：從斜面挑取少量菌體點(diǎn)接于果膠瓊脂培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)72 h，在培養(yǎng)基內(nèi)滴加適量1 mg/mL剛果紅染液染色40 min，用蒸餾水洗滌2～3次除去溶液，再用蒸餾水脫色10 min后觀察菌落周圍是否有透明圈產(chǎn)生。

1.2.4 菌株分解柚子皮能力的粗測(cè)定 采用直接干燥法[12]測(cè)得柚子皮的含水量為81.87%，取3 g烘干至恒重的柚子皮放入培養(yǎng)皿中，按計(jì)算的失水率補(bǔ)充水分使其恢復(fù)至失水前的狀態(tài)，并接種3 mL菌懸液，將培養(yǎng)皿放入30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 d左右，將長(zhǎng)滿黑色孢子的柚子皮取出，用清水將表面的孢子洗凈，并放入56 ℃烘箱內(nèi)烘干至恒重后稱重。黑曲霉對(duì)柚子皮的分解率(%)=((分解前烘干柚子皮的質(zhì)量-分解后烘干柚子皮的質(zhì)量)/分解前干柚子皮的質(zhì)量)×100%。同樣的方法做5組平行實(shí)驗(yàn)，并用顯微鏡觀察柚子皮被分解前后的顯微結(jié)構(gòu)。

1.2.5 孢子懸浮液制備 選取產(chǎn)纖維素酶能力較強(qiáng)的菌株，加入10 mL無(wú)菌水，用接種針將斜面上的孢子輕刮至裝有玻璃珠的小錐形瓶中，充分搖勻，并加無(wú)菌水調(diào)整為所需要的孢子濃度，制成孢子懸浮液。

1.2.6 固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶的探討 ①培養(yǎng)基組成對(duì)產(chǎn)纖維素酶的影響:在250 mL錐形瓶中分別裝入10 g柚子皮、10 g柚子皮+0.5 g麩皮、10 g柚子皮+0.5 g (NH4)2SO4和10 g柚子皮+0.5 g麩皮+0.5 g (NH4)2SO4，用玻璃棒攪拌均勻，滅菌冷卻后加入8 mL無(wú)菌水，接入15%孢子懸浮液，搖勻打散，28 ℃恒溫培養(yǎng)60 h(培養(yǎng)期間搖晃4～5次)，提取粗酶液，檢測(cè)比較纖維素酶活；②柚子皮含量對(duì)產(chǎn)纖維素酶的影響:在250 mL錐形瓶中分別裝入6、8、10、12、14 g碾碎的柚子皮及0.5 g麩皮、0.5 g (NH4)2SO4，制成固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基，用玻璃棒攪拌均勻，滅菌冷卻后加入8 mL無(wú)菌水，接入15%孢子懸浮液，搖勻打散，28 ℃恒溫培養(yǎng)60 h(培養(yǎng)期間搖晃4～5次)，提取粗酶液，檢測(cè)比較纖維素酶活；③培養(yǎng)基含水量對(duì)產(chǎn)纖維素酶的影響:在250 mL錐形瓶中裝入適量柚子皮，0.5 g麩皮和0.5 g (NH4)2SO4，用玻璃棒攪拌均勻，滅菌冷卻后加入無(wú)菌水3、5、8、10 mL，使對(duì)應(yīng)培養(yǎng)基的含水量分別為34.2、47.9、68.5、82.2 mL/100 g，接入15%孢子懸浮液，28 ℃恒溫培養(yǎng)60 h(培養(yǎng)期間搖晃4～5次)，提取粗酶液，檢測(cè)比較纖維素酶活；④發(fā)酵時(shí)間對(duì)產(chǎn)纖維素酶的影響:在250 mL錐形瓶中裝入12 g柚子皮，0.5 g麩皮和0.5 g(NH4)2SO4，用玻璃棒攪拌均勻，滅菌冷卻后加入8 mL無(wú)菌水，接入15%孢子懸浮液，搖勻打散，28 ℃恒溫分別培養(yǎng)24、48、60、72、90 h(培養(yǎng)期間搖晃4～5次)，提取粗酶液，檢測(cè)比較纖維素酶活。

1.2.7 粗酶液的提取 取5 g發(fā)酵固體于錐形瓶中，加入50 mL蒸餾水，適當(dāng)攪拌后在40 ℃恒溫水浴鍋中浸提1 h。用濾紙過(guò)濾，濾液即為粗酶液[13]。

1.2.8 發(fā)酵因素對(duì)菌株產(chǎn)纖維素酶的影響 采用牛津杯法取100 μL粗酶液至牛津杯內(nèi)，37 ℃培養(yǎng)12～14 h，觀察透明圈的大小，比較各發(fā)酵因素對(duì)菌株產(chǎn)纖維素酶的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離菌株的菌落特征

純化菌株在PDA培養(yǎng)基上30 ℃培養(yǎng)24～72 h后，菌落生長(zhǎng)良好。菌落表面凸起，邊緣粗糙。菌落初為白色，呈棉絮狀，菌絲致密無(wú)褶皺，后長(zhǎng)出黑色孢子。

2.2 菌體特征觀察

將純化菌株30 ℃載片培養(yǎng)3 d后，據(jù)菌體大小情況用4倍、10倍或40倍的顯微鏡進(jìn)行觀察，可以清楚地觀察到菌絲、孢子穗、分生孢子等結(jié)構(gòu)，并用顯微測(cè)微尺測(cè)量菌絲、孢子穗、分生孢子等。通過(guò)對(duì)菌落形態(tài)及特征結(jié)構(gòu)的觀察，未發(fā)現(xiàn)其存在有性生殖過(guò)程和產(chǎn)子囊結(jié)構(gòu)，屬于無(wú)性生殖。參照《真菌鑒定手冊(cè)》及其群體和個(gè)體形態(tài)觀察，確定該菌株為半知菌亞門，絲孢綱，絲孢目，叢梗孢科，曲霉屬，黑曲霉種屬。見(jiàn)表1及圖1、圖2。

表1 菌體形態(tài)特征

圖1 目的菌株菌絲Fig.1 Culture results of purpose strains

圖2 目的菌株孢子Fig.2 Mycelium of purpose strains

2.3 菌株產(chǎn)酶鑒定

由圖3可知，在4種鑒定培養(yǎng)基上的菌落四周均出現(xiàn)了較明顯的透明圈或水解圈，說(shuō)明該分離菌株可產(chǎn)生淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶以及果膠酶，符合黑曲霉的產(chǎn)酶特性，進(jìn)一步證實(shí)該菌株為黑曲霉。

2.4 菌株分解柚子皮能力的粗測(cè)定

由表2可知，黑曲霉對(duì)柚子皮的分解率約為73.33%，分解能力較強(qiáng)，利用率高，通過(guò)分解前后柚子皮顯微結(jié)構(gòu)對(duì)比(圖4、5)，發(fā)現(xiàn)致密的纖維結(jié)構(gòu)明顯變得松散，故可將柚子皮作為黑曲霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶基質(zhì)的主要成分。

圖3 菌株產(chǎn)酶特征Fig.3 The characteristics of enzyme production by strains 1：產(chǎn)淀粉酶特征；2：產(chǎn)蛋白酶特征；3：產(chǎn)纖維素酶特征；4：產(chǎn)果膠酶特征1：Characteristics of amylase production；2：Characteristics of protease production；3：Characteristics of cellulase production；4：Characteristics of pectinase production

試驗(yàn)編號(hào)分解能力 分解前/g 分解后/g 分解率/%13.000.7674.6723.000.7973.6733.000.8272.5743.000.8472.0053.000.7973.67

圖4 分解前柚子皮的顯微結(jié)構(gòu)Fig.4 The microstructure before decomposition

圖5 分解后柚子皮的顯微結(jié)構(gòu)Fig.5 The microstructure before decomposition

2.5 固態(tài)發(fā)酵各因素對(duì)產(chǎn)纖維素酶的影響

2.5.1 培養(yǎng)基組成對(duì)產(chǎn)纖維素酶的影響 通過(guò)測(cè)定牛津杯周圍透明圈大小可知(圖6)，當(dāng)培養(yǎng)基中只含有柚子皮時(shí)，產(chǎn)生的纖維素酶較少。當(dāng)加入麩皮或(NH4)2SO4后，纖維素酶產(chǎn)生量均有所增加。當(dāng)在柚子皮中同時(shí)加入麩皮和(NH4)2SO4后，纖維素產(chǎn)生量有明顯增加，說(shuō)明僅用柚子皮作為固態(tài)培養(yǎng)基成分生產(chǎn)纖維素酶的營(yíng)養(yǎng)素還不夠，在培養(yǎng)基中適當(dāng)增加碳、氮源和生長(zhǎng)因子更有利于纖維素酶的代謝積累。

圖6 培養(yǎng)基組成對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.6 Effect of medium composition on enzyme production1：柚子皮；2：柚子皮+麩皮；3：柚子皮+(NH4)2SO4；4：柚子皮+麩皮+(NH4)2SO41：pomelo peel；2：pomelo peel+wheat bran；3：pomelo peel+ammonium sulphate；4：peel+wheat bran+ammonium sulphate

2.5.2 柚子皮含量對(duì)產(chǎn)纖維素酶的影響 通過(guò)測(cè)定牛津杯周圍透明圈大小可知(圖7)，隨著固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中柚子皮含量的增加，透明圈逐漸增大，說(shuō)明柚子皮中豐富的纖維素和其他營(yíng)養(yǎng)成分可供菌株利用和誘導(dǎo)產(chǎn)酶，當(dāng)柚子皮含量為12 g時(shí)，纖維素酶活力最高，當(dāng)柚子皮含量增加到14 g時(shí)，纖維素酶活力下降，其可能原因是在一定容量發(fā)酵器皿中柚子皮過(guò)多使得培養(yǎng)基的通氣量變差，其他營(yíng)養(yǎng)素比例下降，影響產(chǎn)酶效果。

圖7 柚子皮含量對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.7 Effect of pomelo peel content on enzyme production1：柚子皮含量為6 g；2：柚子皮含量為8 g；3：柚子皮含量為10 g；4：柚子皮含量為12 g；5：柚子皮含量為14 g1：pomelo peel content is 6 g; 2： pomelo peel content is 8 g; 3：pomelo peel content is 10 g; 4：pomelo peel content is 12 g; 5：pomelo peel content is 14 g

2.5.3 培養(yǎng)基含水量對(duì)產(chǎn)纖維素酶的影響 通過(guò)測(cè)定牛津杯周圍透明圈大小可知(圖8)，當(dāng)培養(yǎng)基含水量為68.5 mL/100 g時(shí)，透明圈直徑最大，說(shuō)明產(chǎn)纖維素酶較多。培養(yǎng)基含水量較低時(shí)會(huì)影響菌株的生長(zhǎng)和產(chǎn)酶，而培養(yǎng)基含水量過(guò)高時(shí)，基質(zhì)的黏度增大，容易結(jié)塊，透氣性變差，供氧不足，從而影響產(chǎn)酶。因此，培養(yǎng)基含水量在68.5 mL/100 g左右時(shí)較為適宜。

2.5.4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)產(chǎn)纖維素酶的影響 通過(guò)測(cè)定牛津杯周圍透明圈大小可知(圖9)，發(fā)酵0～24 h，菌株生長(zhǎng)緩慢，培養(yǎng)基表面只有少量的菌絲生成，未產(chǎn)生黑色孢子，此時(shí)產(chǎn)生的纖維素酶較少；培養(yǎng)至48 h，培養(yǎng)基中有少量黑色孢子生成，纖維素酶開(kāi)始大量合成；發(fā)酵60 h，透明圈最大；發(fā)酵72 h，培養(yǎng)基布滿黑色孢子，但透明圈沒(méi)有變大；超過(guò)90 h，透明圈開(kāi)始變小，可能是菌體代謝產(chǎn)物積累和培養(yǎng)基纖維素的消耗造成的。60～72 h之間雖然透明圈變化不大，但由于72 h時(shí)黑色孢子太多不利于粗酶液的提取，因此選取60 h較為合適。

圖8 培養(yǎng)基含水量對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.8 Effect of water content on cellulase production1：34.2 mL/100 g；2：47.9 mL/100 g；3：68.5 mL/100 g；4：82.2 mL/100 g

圖9 發(fā)酵時(shí)間對(duì)產(chǎn)酶的影響Fig.9 Effect of fermentation time on cellulase production1：發(fā)酵24 h；2：發(fā)酵48 h；3：發(fā)酵60 h；4：發(fā)酵72 h；5：發(fā)酵90 h1：fermentation time is 24 h;2：fermentation time is 48 h;3：fermentation time is 60 h;4：fermentation time is 72 h;5：fermentation time is 90 h

3 討 論

本研究從腐爛的柚子皮上分離出一株黑色霉菌，通過(guò)對(duì)該菌株的形態(tài)特征和培養(yǎng)特征的觀察，對(duì)照《真菌鑒定手冊(cè)》判定該菌株為黑曲霉(Aspergillusnige)。該黑曲霉可產(chǎn)淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶和果膠酶。由于柚子皮富含纖維素且該菌株對(duì)柚子皮的分解率達(dá)到73.33%左右，故以干柚子皮為主要原料，選取一株產(chǎn)纖維素酶活力較強(qiáng)的黑曲霉為生產(chǎn)菌株，采用固態(tài)發(fā)酵法生產(chǎn)纖維素酶。結(jié)果表明，固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中添加12 g柚子皮，0.5 g麩皮和0.5 g (NH4)2SO4，培養(yǎng)基初始含水量保持在68.5 mL/100 g，培養(yǎng)時(shí)間控制在60 h左右時(shí)生產(chǎn)纖維素酶較多。

本研究利用黑曲霉固態(tài)發(fā)酵柚子皮是一種較為經(jīng)濟(jì)環(huán)保的纖維素酶的制備方法，不僅可為柚子皮資源的再利用開(kāi)辟了新的途徑，也為黑曲霉固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶提供了物美價(jià)廉的原料。

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Identification and Characterization ofAspergillusnigerIsolated from Pomelo Peel

ZHANG Chao-feng, WANG Yu-chen, CHEN Wei-ping, ZHANG Feng-ying

(Coll.ofFoodSci. &Engin.,JiangxiAgric.Uni.,Nanchang334450)

Aspergillusnigernaturally grow on pomelo peel was separated and characterized, and investigated for its enzyme-producing features. Plate dilution method was used to isolate a mold strain, and it was identified through observing its morphological and culture features, and compare toFungiCharacterizationHandbookto judge the genus and species of the strain. The identification medium is adopted to discuss the enzyme production characteristics. Dried pomelo peels as major raw material, according to the component feature of pomelo peel, and the strain as producing strain, adopting solid state fermentation method to investigate the effects on cellulase activity of four factors, component of culture medium, the content of pomelo peel, the initial water content of the medium, as well as fermentation time. The result showed that the strain wasAspergillusnigerand it can produce four enzymes: amylase, protease, cellulase and pectinase; 12 g pomelo peels, 0.5 g wheat bran, and 0.5 g (NH4)2SO4, and initial water content at about 68.5 mL/100 g and fermentation time at about 60 h, the yield of cellulase was at the higher level..

pomelo peels;Aspergillusniger; solid state fermentation; cellulase

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31560480)；江西省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2009BNA09400)

張超鳳 女，碩士研究生。從事微生物發(fā)酵研究。E-mail:1358440843@qq.com

* 通訊作者。女，研究員，碩士生導(dǎo)師。研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品加工與貯藏。E-mail:3q3w3q3w@163.com

2016-07-04；

2016-10-10

Q93-331

A

1005-7021(2017)03-0022-06

10.3969/j.issn.1005-7021.2017.03.004