1株耐高溫生物表面活性劑產生菌的特性研究

尤 賀， 張麗敏， 欒 靜， 孫玉梅

(大連工業(yè)大學 生物工程學院，遼寧 大連 116034)

1株耐高溫生物表面活性劑產生菌的特性研究

尤 賀， 張麗敏， 欒 靜*， 孫玉梅

(大連工業(yè)大學 生物工程學院，遼寧 大連 116034)

研究了耐高溫生物表面活性劑產生菌ZY-3的生理生化特性，并通過測定發(fā)酵液的菌體密度、表面張力和乳化活性等指標，研究不同碳源和初始pH對菌株ZY-3生長和產生物表面活性劑的影響，同時對其所產生物表面活性劑進行了初步分離和性質分析。菌株ZY-3被初步鑒定為芽胞桿菌屬(Bacillus)，具有產酸、不產H2S、還原硝酸鹽等特性。在以淀粉為碳源、初始pH 6.0的培養(yǎng)基中發(fā)酵，產生物表面活性劑多且穩(wěn)定；在種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基中都有淀粉的條件下，菌體生長較多，降低表面張力和乳化的作用均較強，所產生物表面活性劑可以使發(fā)酵液的表面張力從72.1 mN/m降到53.1 mN/m，乳化活性從0升高到24%。初步判斷產物為糖脂類陰離子表面活性劑。

生物表面活性劑；耐高溫菌株ZY-3；碳源

微生物采油是通過外源微生物或內源微生物的有益活動及其代謝產物的綜合作用來提高原油采收率。微生物的有益活動包括菌體細胞的增大和增多以及對油藏中原油的降解、降黏等作用[1-4]。而有利于采油的微生物代謝產物包括生物表面活性劑、生物聚合物、小分子有機溶劑、氣體和酶等[5-6]。有報道在物理模擬巖心實驗中向巖心管中注入低濃度的生物表面活性劑即可開采35%～45%的原油[7]。較充足的營養(yǎng)是微生物正常生長繁殖和代謝的保證，也是實現(xiàn)微生物采油的基礎，所需營養(yǎng)物質依菌種而異[8]。碳源和氮源的影響較大，其對微生物采油的影響研究也較多。通過向油井中注入糖蜜、玉米漿等廉價營養(yǎng)物質，可提高原油采收率[9]。分別以淀粉水解液為碳源、硝酸鈉為氮源、磷酸氫二銨為磷源，促進內源微生物產大量有機酸和生物表面活性劑，以提高石油采收率[10]。 油藏是一種高溫、高壓、高礦化度、貧營養(yǎng)的惡劣地層環(huán)境，研究耐高溫采油微生物利用不同營養(yǎng)物質的生長代謝，對微生物采油技術的改進和完善具有十分重要的意義。本研究對耐高溫菌株ZY-3進行生理生化特性測定，并研究碳源和初始pH對其生長和產生物表面活性劑的影響，通過測定發(fā)酵液表面張力和乳化活性反映生物表面活性劑的生成情況。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 耐高溫菌株ZY-3從遼河油田的原油中分離，在18%(體積分數(shù))甘油中于-80 ℃冰箱保存。

1.1.2 試劑 實驗用化學試劑均為分析純、化學純以及生化試劑。

1.1.3 儀器 Jzhy1-180界面張力儀(承德市材料試驗機廠)，722S型可見光分光光度計(上海精密科學儀器有限公司)，日立CR21G高速冰凍離心機(日本HITACHI公司)，GC-8900氣相色譜儀(滕州市經(jīng)緯分析儀器有限責任公司)。

1.1.4 材料 TLC鋁板(silica gel 60 F254，德國Merck公司)。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基的配制 ①斜面培養(yǎng)基：牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，瓊脂20 g，去離子水定容至1 000 mL，pH 7.0；②種子培養(yǎng)基：牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，去離子水定容至1 000 mL，pH 7.0；③發(fā)酵培養(yǎng)基：KH2PO43.4 g，Na2HPO41.5 g，(NH4)2SO44 g，MgSO4·7H2O 0.7 g，酵母粉0.2 g，液體石蠟17 g，去離子水定容至1 000 mL；④碳源發(fā)酵培養(yǎng)基：NaCl 10 g，NH4Cl 0.5 g，KH2PO40.5 g，K2HPO41 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，CaCl20.02 g，KCl 0.1 g，F(xiàn)eCl2·H2O 0.002 g，碳源2 g，去離子水定容至1 000 mL，pH 7.0。碳源分別為葡萄糖、木糖、蔗糖、淀粉、纖維素、液體石蠟。生理生化試驗所用培養(yǎng)基均參考文獻[11-16]。以上培養(yǎng)基的滅菌條件均為121 ℃，20 min。其中，蔗糖溶液通過0.45 μm水系微孔濾膜過濾除菌。

1.2.2 菌種活化 保存菌種接種在斜面培養(yǎng)基中，60 ℃靜置培養(yǎng)24 h。

1.2.3 種子液的制備 在液體種子培養(yǎng)基中接入活化的菌種2環(huán)/100 mL，60 ℃靜置培養(yǎng)24 h。

1.2.4 碳源對菌株ZY-3生長及產生物表面活性劑的影響 將種子液按5%(體積分數(shù))接種量接種到含有不同碳源的碳源發(fā)酵培養(yǎng)基中，60 ℃靜置培養(yǎng)7 d，每24 h取樣，測定發(fā)酵液菌體密度和表面張力。

1.2.5 pH對菌株ZY-3生長及產生物表面活性劑的影響 用0.1 mol/L檸檬酸和0.2 mol/L磷酸氫二鈉將發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH分別調至4.0、5.0、6.0、7.0、8.0。將種子液按5%(體積分數(shù))接種量接種到不同初始pH的發(fā)酵培養(yǎng)基中，60 ℃靜置培養(yǎng)7 d，每24 h取樣，測定發(fā)酵液菌體密度和乳化活性。

1.2.6 不同液體菌種與發(fā)酵液組合培養(yǎng)對ZY-3發(fā)酵的影響 用含0.2%(質量分數(shù))淀粉和不含淀粉的種子培養(yǎng)基培養(yǎng)ZY-3，將種子液按5%(體積分數(shù))的接種量分別接種到初始pH 6.0的以1.7%(質量分數(shù))淀粉或液體石蠟為碳源的發(fā)酵培養(yǎng)基中，60 ℃靜置培養(yǎng)7 d，每24 h取樣，測定發(fā)酵液菌體密度、表面張力和乳化活性。

1.2.7 測定方法 ①發(fā)酵液處理：定性濾紙過濾除去發(fā)酵液殘油，將濾液于3 000 g、4 ℃離心20 min，所得上清液用于測定表面張力、乳化活性；②表面張力測定：采用表面張力儀測定[12]；③pH測定：采用精密pH計測定；④乳化活性測定：把1.5 mL無菌上清液與1 mL液體石蠟混勻，漩渦振蕩5 min，靜置24 h。乳化活性(%)=(乳化層高度/液體總高度)×100%[12]；⑤菌體密度測定：采用比濁法[13]。把4 mL發(fā)酵液與0.5 mL TritonX-100(0.2%，質量分數(shù))溶液混勻，于3 000 g、4 ℃離心20 min，棄上清，用去離子水恢復原體積，于600 nm測定菌懸液OD。

1.2.8 生物表面活性劑提取與分析 ①生物表面活性劑的提?。簩⒊桶l(fā)酵上清液和等體積的三氯甲烷/甲醇(2∶1，體積比)一起加入250 mL的分液漏斗中，手動搖勻200下，靜置，待混合液分層后收集下層液體，重復操作3次。合并萃取相，于40 ℃旋轉蒸發(fā)，除去有機相，得到生物表面活性劑粗品[14]；②生物表面活性劑的定性分析：采用薄層色譜(TLC)對生物表面活性劑的成分進行鑒定，將生物表面活性劑粗品溶于氯仿中，點樣于硅膠板上，用V(氯仿)∶V(甲醇)∶V(水)=65∶15∶2進行展層，當樣品展到一定距離時，取出硅膠板，立即用吹風機吹干，分別進行以下操作：a.苯酚-硫酸顯色：展層后的硅膠板直接噴上苯酚-硫酸顯色劑，在105 ℃烘箱中加熱5 min后，觀察顯色現(xiàn)象。b.茚三酮顯色及原位酸水解-茚三酮顯色：展層后的硅膠板一塊直接噴上0.5%茚三酮顯色劑，在105 ℃烘箱中加熱5 min后，觀察顯色現(xiàn)象。另一塊硅膠板放入裝有2 mL濃鹽酸的密閉容器中105 ℃熏蒸2 h。鹽酸揮發(fā)后用0.5%茚三酮顯色劑顯色，在105 ℃烘箱中加熱5 min后，觀察顯色現(xiàn)象[15]；③生物表面活性劑帶電性分析：a.陰離子生物表面活性劑檢測方法：把5 mL除油發(fā)酵上清液與2倍體積亞甲基藍溶液(0.003%，質量分數(shù))和等體積的氯仿混合，充分振蕩后，氯仿層呈藍色則說明發(fā)酵液中的生物表面活性劑為陰離子[16]。b.陽離子生物表面活性劑檢測方法：把5 mL除油發(fā)酵上清液與2～5滴溴酚藍溶液(0.04%，質量分數(shù))混合，充分振蕩后，發(fā)酵上清液和溴酚藍混合溶液呈深藍色則說明該發(fā)酵液中的生物表面活性劑為陽離子[16]。

2 結果與分析

2.1 菌株ZY-3的初步鑒定及其所產生物表面活性劑的定性分析

顯微觀察分離純化后的菌株ZY-3為桿狀，6 μm×0.8 μm。生理生化鑒定結果：革蘭染色陽性，產過氧化氫酶，不產H2S，M.R.反應陽性，V.P.反應陰性，還原硝酸鹽，牛奶石蕊褪色凝固，脲酶陰性，能水解淀粉，不水解酪素，不液化明膠，能同化葡萄糖、甘油、蔗糖和甘露醇。根據(jù)參考文獻[11-17]，初步鑒定菌株ZY-3為芽胞桿菌屬(Bacillus)。

經(jīng)TLC定性分析，只有苯酚-硫酸顯色時出現(xiàn)棕色斑點，茚三酮顯色及原位酸水解-茚三酮顯色均未出現(xiàn)顯色反應，說明菌株ZY-3所產生物表面活性劑為糖脂類，結合帶電性分析，為糖脂類陰離子表面活性劑。

2.2 單糖和二糖對菌株ZY-3生長和發(fā)酵液表面張力的影響

由圖1可知，菌株ZY-3以葡萄糖、木糖和蔗糖為碳源的發(fā)酵液表面張力總體呈震蕩下降趨勢，且在發(fā)酵前期下降速度快。在以葡萄糖為碳源的發(fā)酵培養(yǎng)基中生長量最小，發(fā)酵1 d后菌體總量變化不大，OD600保持在0.3左右。發(fā)酵第5天的發(fā)酵液表面張力降至最低值54.5 mN/m，降低了24.3%。可能是菌體到達穩(wěn)定期后更易積累生物表面活性劑。在木糖和蔗糖發(fā)酵培養(yǎng)基中的生長趨勢一致，利用木糖為碳源菌體生長較快，而且發(fā)酵液表面張力總體水平較低，表面張力的降低意味著產生了生物表面活性劑。結果表明，菌株ZY-3利用木糖生長良好，產生物表面活性劑較穩(wěn)定；利用葡萄糖雖然生長較弱，但產生物表面活性劑能力較強；利用蔗糖生長較慢，但生長量較多，產生物表面活性劑不夠穩(wěn)定。

圖1 菌株ZY-3利用單糖和二糖的發(fā)酵液菌體密度及表面張力變化Fig.1 Change of cell density and surface tension of fermentation broth by strain ZY-3 on mono-and di-sacchacharidesA：發(fā)酵液菌體密度變化情況；B：發(fā)酵液表面張力變化情況，圖2同A：cell density of fermentation broth；B：surface tension of fermentation broth,Figure 2 with

2.3 多糖對菌株ZY-3生長和發(fā)酵液表面張力的影響

由圖2可知，菌株ZY-3以淀粉、纖維素、葡萄糖為碳源時，發(fā)酵第1天，發(fā)酵液表面張力均明顯降低，隨后呈震蕩下降趨勢，菌體生長趨勢基本一致，且菌體生長量相對較小。在纖維素發(fā)酵培養(yǎng)基中菌體生長量最小，發(fā)酵液表面張力降低幅度最小，為17.4%；而淀粉發(fā)酵培養(yǎng)基中菌體生長量最大，發(fā)酵液表面張力降低幅度最大，為27.1%。以淀粉和葡萄糖為碳源的發(fā)酵液表面張力降低的較多，在發(fā)酵后期表面張力升高，可能是生物表面活性劑被菌體分解或利用。

圖2 菌株ZY-3利用多糖和單糖的發(fā)酵液菌體密度及表面張力變化的比較Fig.2 Comparison of change of cell density and surface tension of fermentation broth by strain ZY-3 on polysaccharides and monosacchacharides

2.4 pH對菌株ZY-3的生長和發(fā)酵液乳化活性的影響

由圖3A可知，菌株ZY-3在初始pH 4.0的發(fā)酵培養(yǎng)基中菌體生長緩慢且菌體生長量小；在初始pH 5.0的發(fā)酵培養(yǎng)基中雖然在發(fā)酵初期生長較少，但在第2天迅速生長到最大，隨后菌體量略有減少，但變化不大；在初始pH 6.0的發(fā)酵培養(yǎng)基中菌體卻表現(xiàn)穩(wěn)步生長，發(fā)酵到第5天接近最大生長量。在初始pH 7.0的發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵1 d達到較大生長后，菌體量增長較小?？梢?，發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH對菌株的生長影響顯著，初始pH 5.0時有利于菌體生長。

圖3 菌株ZY-3在不同初始pH的發(fā)酵液菌體密度及乳化活性變化Fig.3 Change of cell density and emulsifying activity of fermentation broth by strains ZY-3 at various initial pH valuesA：發(fā)酵液菌體密度變化情況；B：發(fā)酵液乳化活性變化情況A：cell density of fermentation broth；B：emulsifying activity of fermentation broth

由圖3B可知，菌株ZY-3在不同初始pH條件下，發(fā)酵前期的發(fā)酵液乳化活性相差較小，初始pH 5.0的發(fā)酵液在發(fā)酵初期雖較高，但不穩(wěn)定，起伏變化較大。初始pH 6.0的發(fā)酵液乳化活性穩(wěn)步升高，發(fā)酵第6天達到最大值56.25%，而且在整個發(fā)酵過程中都處于較高水平。初始pH 7.0的發(fā)酵液在發(fā)酵初期乳化活性較低，且在整個過程中起伏變化較大。發(fā)酵液具有乳化活性意味著產生了生物表面活性劑?？梢姡w生長與乳化活性的變化不完全一致，在初始pH 6.0時合成生物表面活性劑較穩(wěn)定。

2.5 不同液體菌種與發(fā)酵液組合培養(yǎng)對ZY-3發(fā)酵的影響

由圖4、圖5和圖6可知：①在含有淀粉的種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基組合下培養(yǎng)，隨培養(yǎng)時間增加，菌體數(shù)量增加，發(fā)酵液的表面張力逐漸下降，乳化活性也逐漸增大。該組合的菌體生長量最大，發(fā)酵液表面張力降得較低，降低的速度較快，發(fā)酵第7天降至最低值53.1 mN/m，降低了26.3%，降低幅度接近于石蠟發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵液表面張力。發(fā)酵液乳化活性較大，發(fā)酵第7天達到最大值24%。②在無淀粉種子培養(yǎng)基和有淀粉的發(fā)酵培養(yǎng)基組合下培養(yǎng)，隨培養(yǎng)時間增加，菌體數(shù)量增加，發(fā)酵液表面張力逐漸降低，乳化活性呈波動態(tài)增大趨勢。此組合的菌體生長量較大，發(fā)酵液表面張力降低最慢，發(fā)酵第7天降至最低值55.1 mN/m，降低了23.5%。發(fā)酵液乳化活性最低，發(fā)酵第7 天達到最大值18%。③在無淀粉的種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基組合下培養(yǎng)，發(fā)酵前期，菌體生長緩慢，發(fā)酵液的表面張力明顯減小，乳化活性逐漸增大。發(fā)酵5 d，乳化活性提高的同時，菌體數(shù)量明顯增多，說明乳化劑的產生有助于菌體利用液體石蠟進行生長。該組合的菌體生長較少，但發(fā)酵液表面張力降低最快，發(fā)酵第7 天降至最低值51.1 mN/m，降低了29%。發(fā)酵液乳化活性最高，發(fā)酵第7 天達到最大值49%。

圖4 不同培養(yǎng)組合的發(fā)酵液菌體密度變化Fig.4 Change in cell density of fermentation broth by various cultures combinationA：種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基均有淀粉；B：種子培養(yǎng)基無淀粉和發(fā)酵培養(yǎng)基有淀粉；C：種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基均無淀粉，圖5、6同A：the media for inocula and fermentation with starch；B: the media for inocula without starch， the media for fermentation with starch；C：the media for inocula and fermentation without starch,Figure 5,6 with

圖5 不同培養(yǎng)組合的發(fā)酵液表面張力變化Fig.5 Change in surface tension of fermentation broth by various combination cultures

圖6 不同培養(yǎng)組合的發(fā)酵液乳化活性變化Fig.6 Change in emulsification activity of fermentation broth by various combination cultures

3 討 論

菌株ZY-3被初步鑒定為芽胞桿菌屬(Bacillus)，產糖脂類陰離子表面活性劑，能降低發(fā)酵液的表面張力和乳化液體石蠟。馮蕾等[18]也分離到同屬的菌株，在油井中應用可使稠油黏度(25 ℃)下降25.2%～70.6%。有研究表明，酸可有效地溶解儲油巖層孔隙中沉積的碳酸鹽，增大油層的孔隙度和滲透率。而H2S為有毒有害氣體，會造成油井和油田管線腐蝕。能還原硝酸鹽說明可以利用硝酸鹽代替分子氧作為受氫體進行無氧呼吸，保證在缺氧的油藏環(huán)境能生長和代謝[18-19]。本研究中，菌株ZY-3具有產酸、不產H2S、還原硝酸鹽等特性，這些特性有助于菌株ZY-3應用于微生物采油。菌株ZY-3在以淀粉為碳源、初始pH 6.0的培養(yǎng)基中發(fā)酵，產生物表面活性劑多且穩(wěn)定。這與向培養(yǎng)基中添加淀粉、木糖更有利于AcinetobacterBHSN生長和合成生物表面活性劑的結果一致[20]。在種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基中都有淀粉的條件下，菌株ZY-3生長較多，乳化和降低表面張力的作用均較強，所產生物表面活性劑可以使發(fā)酵液的表面張力從72.1 mN/m降到53.1 mN/m，乳化活性從0升高到24%。以液體石蠟為碳源，發(fā)酵液乳化活性高，這樣有助于菌株利用液體石蠟，而以淀粉為碳源，菌體生長量大，表面張力卻與液體石蠟碳源的接近，發(fā)酵液乳化活性較低，這樣就不利于乳化原油中的低分子量組分并進一步利用原油，可以減少菌株對原油的利用，達到更多采油的目的。本研究結果表明，采用種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基中均有淀粉的組合更有利于微生物采油。Mohammad等[21]向接種GeobacillustoebiiR-32639的模擬微生物采油模型中注入淀粉等營養(yǎng)劑，可使原油表面張力降低25.3%，黏度降低14.1%，增強原油在巖石孔隙間的流動性，提高原油采收率。比較可知，菌株ZY-3以淀粉為碳源發(fā)酵的表面張力降低水平與之相近，結合該菌株產酸、不產H2S、還原硝酸鹽等特性，可推斷菌株ZY-3具有應用于微生物采油的潛力。本研究只對ZY-3進行初步鑒定，今后還將分析16S rDNA序列和全細胞脂肪酸組成，進一步鑒定菌種，并加強其對采油的應用研究，為微生物采油提供依據(jù)。

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Characterizations of a Thermotolerant Bio-Surfactant Producing Bacterium

YOU He, ZHANG Li-min, LUAN Jing, SUN Yu-mei

(Coll.ofBio-Engin.,DalianPolytechnicUni.,Dalian116034)

The physiobiochemical characteristics of a thermotolerant bacterium strain ZY-3 and characteristics of bio-surfactant produced by the strain were studied. The impact of different carbon sources on cell growth and bio-surfactant production of strain ZY-3 was also studied by measuring the cell density and surface tension and emulsification activity in the fermentation broth. The bio-surfactant produced was initially isolated and analyzed accordingly. The strain ZY-3 was primarily identified as the genusBacillus, it had the features of producing acid and reduce nitrates, but not produce H2S. When strain ZY-3 was fermented in a medium with starting pH at 6.0 and starch as carbon source, more and stable bio-surfactants were produced. When the media for seed and fermentation contained starch, the cell grew better, and the produced surfactant reduced surface tension and stronger emulsification, the produced bio-surfactant could reduced the surface tension of fermentation broth from 72.1 mN/m to 53.1 mN/m, and emulsification activity increased from 0 to 24%. It was judged initially that the product was glycolipid anion surfactant.

bio-surfactant; thermotolerant strain ZY-3; carbon source

國家自然科學基金項目 (31371742)

尤賀 男，碩士研究生。研究方向為微生物代謝控制發(fā)酵。E-mail:716863212@qq.com

* 通訊作者。女，碩士，工程師。研究方向為微生物發(fā)酵工程。E-mail:luanjing@dlpu.edu.cn

2016-04-19；

2016-08-06

Q93

A

1005-7021(2017)03-0010-06

10.3969/j.issn.1005-7021.2017.03.002