奧希替尼聯(lián)合貝伐珠單抗治療伴EGFR T790M突變肺腺癌的療效與機制研究*

熊志成 劉洋 孫鑫 馬潔韜 張樹玲 孫麗 孫婧 張曉諾 韓琤波

奧希替尼聯(lián)合貝伐珠單抗治療伴EGFR T790M突變肺腺癌的療效與機制研究*

熊志成 劉洋 孫鑫 馬潔韜 張樹玲 孫麗 孫婧 張曉諾 韓琤波

目的：通過移植瘤動物實驗探討奧希替尼聯(lián)合抗VEGF單克隆抗體靶向藥物貝伐珠單抗的療效及作用機制，為進一步臨床試驗提供理論依據(jù)。方法：構(gòu)建EGFR T790M突變的H1975人肺腺癌細(xì)胞移植瘤動物模型。實驗分組：低劑量奧希替尼組、高劑量奧希替尼組、低劑量奧希替尼聯(lián)合貝伐珠單抗組、高劑量奧希替尼聯(lián)合貝伐珠單抗組。每組各5只小鼠，給藥方法：奧希替尼2.5 mg/kg/d或5 mg/kg/d，采用每天灌胃處理；貝伐珠單抗5 mg/kg，每周2次腹腔注射。接種后和給藥期間繪制腫瘤生長曲線，給藥2周后處死裸鼠，活檢整個腫瘤。免疫組織化學(xué)SP法檢測腫瘤HIF-1α、VEGF和微血管密度（microvessel density，MVD）。應(yīng)用Western blot法檢測EGFR及其下游AKT和ERK信號通路蛋白的表達(dá)。結(jié)果：給藥2周后，高劑量奧希替尼單藥組較低劑量奧希替尼單藥組腫瘤體積明顯縮小，HIF-1α、VEGF表達(dá)率和MVD顯著降低（P＜0.05），p-EGFR、p-AKT和p-ERK表達(dá)減少（P＜0.05）。低劑量奧希替尼聯(lián)合貝伐珠單抗組腫瘤體積明顯小于低劑量奧希替尼單藥組（P＜0.05），上述因子均明顯降低（P＜0.05）。低劑量奧希替尼聯(lián)合組與高劑量奧希替尼單藥組比較，腫瘤體積差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.178），p-EGFR、p-AKT、p-ERK表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。高劑量奧希替尼聯(lián)合組與高劑量奧希替尼單藥組體積差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.642）。兩個聯(lián)合組之間，體積差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.072），上述因子表達(dá)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論：貝伐珠單抗能夠顯著增加奧希替尼對伴EGFR T790M突變的肺腺癌移植瘤的殺傷能力。貝伐珠單抗與奧希替尼協(xié)同作用是通過降低腫瘤中VEGF表達(dá)，改善腫瘤微環(huán)境，增強抑制EGFR下游信號通路激活而實現(xiàn)的。

非小細(xì)胞肺癌 表皮生長因子受體 酪氨酸激酶抑制 劑抗血管生成治療 腫瘤微環(huán)境

肺癌是世界上發(fā)病率最高的惡性腫瘤，其中85%為非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）［1］?；熉?lián)合抗血管生成靶向藥物可顯著延長非鱗型NSCLC患者總生存期（overall survival，OS）［2-5］。近年來，個體化分子靶向治療取得了巨大成功。對于EGFR敏感突變的NSCLC（外顯子19缺失［E19 del］和外顯子21點突變［E21 L858R］），采用第一代或第二代EGFR-TKIs治療，相比于傳統(tǒng)化療可明顯改善患者的預(yù)后。

AURA-3Ⅲ期臨床研究顯示，既往使用EGFR-TKIs進展且存在T790M獲得性突變的患者，奧希替尼的客觀緩解率（objective response rate，ORR）高達(dá)71%，中位無進展生存期（median progression free survival，mPFS）10.1個月［6］。

血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）在血管發(fā)生中發(fā)揮重要作用，是腫瘤中內(nèi)皮細(xì)胞存活所必需的。貝伐珠單抗能夠降低VEGF水平阻斷新生血管生成，瞬時正?；[瘤迂曲的血管，改善腫瘤氧合并減少間質(zhì)液壓力，以及恢復(fù)藥物到腫瘤中的遞送，這可能使腫瘤細(xì)胞對EGFRTKIs更敏感。JO25567Ⅱ期臨床試驗顯示，厄洛替尼聯(lián)合貝伐珠單抗較單藥厄洛替尼可顯著延長EGFR敏感突變NSCLC患者的mPFS（16個月vs.9.7個月），相比單純EGFR敏感突變患者而言，EGFR敏感突變合并T790M突變肺癌采用厄洛替尼聯(lián)合貝伐珠單抗一線治療PFS明顯延長（16個月vs.10.5個月）［7］。

本研究通過構(gòu)建T790M突變裸鼠肺癌移植瘤模型，采用奧希替尼聯(lián)合或不聯(lián)合貝伐珠單抗干預(yù)，探討腫瘤微環(huán)境的改變對第三代EGFR-TKI治療T790M突變肺癌的影響及相關(guān)分子機制，為進一步臨床試驗提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑和材料

人肺腺癌細(xì)胞系H1975（EGFR E20 T790M）細(xì)胞株由四川大學(xué)華西醫(yī)院饋贈。實驗動物為SPF級雌性裸鼠BALB/C裸鼠20只（4～6周齡，20 g左右），購自北京華阜康生物科技股份有限公司，實驗動物許可證編號SCXK（京）2014-0004。實驗獲醫(yī)院動物保護和應(yīng)用委員會批準(zhǔn)。

奧希替尼（AZD9291）購自美國Selleck公司；貝伐珠單抗購自瑞士羅氏公司，ECL Plus發(fā)光試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。免疫組織化學(xué)SP超敏試劑盒、DAB試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。CD34、VEGFA、HIF-1α抗體購于武漢博士德生物工程有限公司。EGFR、AKT、ERK及p-EGFR、p-AKT、p-ERK購于美國Santa Cruz公司，GAPDH抗體購自美國Proteintech公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及裸鼠移植瘤模型建立H1975細(xì)胞培養(yǎng)于RPMI 1640培養(yǎng)基中（含10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素），于37℃，5%CO2，90%濕度孵箱中培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁。取對數(shù)生長期細(xì)胞，消化計數(shù)，2×106/mL細(xì)胞/只接種于小鼠右后肢前方的側(cè)腹壁皮下。約1周后開始成瘤，接種后和給藥期間每周測量腫瘤體積至少2次。

在小鼠腫瘤長至平均為0.2～0.4 cm3時隨機分4組：A組（Low-O）：低劑量奧希替尼組（n=5，2.5mg/kg/d）；B組（High-O）：高劑量奧希替尼組（n=5，5 mg/kg/d）；C組（Low-OB）：奧希替尼低劑量聯(lián)合貝伐珠單抗給藥組（n=5，奧體替尼2.5 mg/kg/d，貝伐珠單抗5 mg/kg，每周2次）；D組（High-OB）：奧希替尼高劑量聯(lián)合貝伐珠單抗給藥組（n=5，奧體替尼5 mg/kg/d，貝伐珠單抗5 mg/kg，每周2次）。當(dāng)腫瘤平均體積達(dá)到0.4～0.6 cm3（腫瘤體積V=L×W2×π/6）時開始藥物干預(yù)。給藥方法：奧希替尼采用每天灌胃處理，貝伐珠單抗每周2次腹腔注射。接種后和給藥期間繪制腫瘤生長曲線，給藥2周后處死裸鼠，活檢整個腫瘤切取部分置于4%多聚甲醛溶液中，剩余凍存于液氮中。

1.2.2 免疫組織化學(xué)檢測和判定標(biāo)準(zhǔn)活檢組織于4%多聚甲醛溶液固定48 h后，常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片，一抗采用兔抗鼠CD34、VEGFA、HIF-1α單克隆抗體，SP法免疫組織化學(xué)染色、最后DAB顯色，蘇木精復(fù)染，封片。常規(guī)光鏡觀察表達(dá)情況，每張切片隨機選取至少5個400倍視野，采用染色陽性細(xì)胞和染色強度雙評法［8-9］。未見陽性細(xì)胞者評分0分，陽性細(xì)胞比例≤10%者評定為1分，陽性細(xì)胞比例11%～50%者評定為2分，陽性細(xì)胞比例51%～80%者評定為3分，陽性細(xì)胞比例＞80%者評定為3分；不顯色或顯色模糊者評定為0分，淺黃色者評定為1分，棕黃色者評定為2分，棕褐色者評定為3分。最終結(jié)果判定采用兩項相加：3分為弱陽性，4～5分為中度陽性，6～7分為強陽性，當(dāng)陽性細(xì)胞比例＜10%，不管顯色程度，均判為陰性。微血管密度（microvessel density，MVD）陽性判定：每張切片在100×倍鏡下找到3個染色血管最密集的區(qū)域，稱為熱點區(qū)域，在200倍鏡下計數(shù)熱點區(qū)域血管。每1個染成棕色，可與周圍血管、腫瘤細(xì)胞和其他腫瘤間質(zhì)分開的內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞簇，均可作為單一計數(shù)的微血管。3個區(qū)域的均值為腫瘤的MVD值。

1.2.3 Western blot法檢測分別將各組移植瘤標(biāo)本在冰水浴中勻漿后裂解（加入蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑）提取蛋白。BCA法測定蛋白濃度，5×上樣緩沖液混勻，煮沸3 min，迅速冰浴中冷卻，上樣量為每泳道30 μg，聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，小牛血清蛋白封閉2 h，加入相應(yīng)一抗4℃過夜孵育（GAPDH為內(nèi)參）。洗滌后用二抗孵育，化學(xué)發(fā)光顯色，用image J分析各目的蛋白灰度值檢測及分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 移植瘤裸鼠腫瘤生長情況

實驗期間A、C、D組各有1只裸鼠死亡，其余裸鼠一般狀況良好，裸鼠移植瘤情況（圖1），各組移植瘤生長曲線（圖2），切除后各組移植瘤（圖3）。

各處理組移植瘤裸鼠給藥前和處死后腫瘤體積變化情況（表1）。腫瘤細(xì)胞接種2.5周時（給藥前）各處理組之間腫瘤體積差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。給藥2周后，奧希替尼聯(lián)合貝伐珠單抗給藥兩組腫瘤體積均顯著小于低劑量奧希替尼單藥組（P＜0.05），低劑量奧希替尼聯(lián)合組與高劑量奧希替尼單藥組腫瘤體積差異不明顯（P=0.178）。高劑量奧希替尼聯(lián)合組與高劑量奧希替尼單藥組體積差異無顯著性（P=0.642）。兩聯(lián)合組間體積差異無顯著性（P=0.072）。

圖1 各處理組給藥2周后移植瘤圖Figure 1Nude mice of each group after weeks of treatment

圖2 各處理組移植瘤生長曲線Figure 2Tumor growth curve of each group

2.2 移植瘤裸鼠腫瘤組織中VEGF、HIF蛋白表達(dá)及MVD

免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，VEGF表達(dá)在腫瘤細(xì)胞的胞質(zhì)或胞膜，而HIF-1α表達(dá)在胞核（圖4，5）。奧希替尼聯(lián)合貝伐珠單抗給藥組VEGF和HIF-1α表達(dá)率較單藥組低（P＜0.01）；兩聯(lián)合組之間VEGF和HIF-1α表達(dá)率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.348，0.830）；高劑量奧希替尼單藥組VEGF和HIF-1α表達(dá)率較低劑量奧希替尼單藥組低（P=0.012，0.008）。

聯(lián)合貝伐珠單抗給藥組MVD較單藥組低（P＜0.05），兩聯(lián)合組MVD表達(dá)率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.453）；奧希替尼單藥處理兩組中，高劑量單藥組較低劑量單藥組MVD低（P=0.026）。

2.3 各組EGFR及其下游AKT和ERK通路蛋白表達(dá)

應(yīng)用Western blot法檢測各處理組蛋白結(jié)果（圖6）。高劑量奧希替尼單藥組相比低劑量奧希替尼組p-EGFR、p-AKT和p-ERK蛋白表達(dá)明顯降低（P＜0.05）；奧希替尼聯(lián)合貝伐珠單抗給藥組p-EGFR、p-AKT和p-ERK表達(dá)較奧希替尼單藥組明顯降低（P＜0.05）；p-EGFR、p-AKT和p-ERK表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.089，0.381，0.590）；兩聯(lián)合給藥組之間p-EGFR、p-AKT、p-ERK蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.216，0.178，0.076）。EGFR、AKT、ERK在各處理組中表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

圖3 切除后各組移植瘤Figure 3Resected tumor samples in each group

表1 各處理組移植瘤體積變化Table 1 Tumor volume change of each group

圖4 VEGF在各處理組表達(dá)（IHC×400）Figure 4Expression of VEGF in each group by immunohistochemical method(IHC×400)

圖5 HIF-1α在各處理組中的表達(dá)（IHC×400）Figure 5Expression of HIF 1α in each group by immunohistochemical method(IHC×400)

圖6 Western blot結(jié)果Figure 6Results of Western blot

表2 各處理組VEGF、HIF表達(dá)率及微血管密度Table 2 Positive rates of VEGF,HIF,and MVD in each group

表3 各組EGFR、AKT、ERK、p-EGFR、p-AKT、p-ERK相對表達(dá)量Table 3 Expression levels of EGFR,AKT,ERK,p-EGFR,p-AKT,and p-ERK in each group

3 討論

有研究提示，EGFR-TKIs獲得性耐藥后腫瘤VEGF水平會升高，提出耐藥后腫瘤細(xì)胞對EGFR信號通路的依賴性會降低，而對VEGF通路的依賴提高［10］。本研究顯示，EGFR信號通路依然是T790M耐藥突變肺癌細(xì)胞重要的生長依賴信號通路，奧希替尼對EGFR及其下游PI3K/AKT/mTOR和Ras-Raf-MAPK信號通路均有抑制作用，聯(lián)合貝伐珠單抗改善了腫瘤組織內(nèi)的微環(huán)境，增強了這兩條信號通路的抑制作用，從而更有效地殺傷腫瘤細(xì)胞。

EGFR與VEGF相關(guān)信號通路均在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。EGFR的異常激活導(dǎo)致腫瘤增殖加速且不受調(diào)控，VEGF信號通路與腫瘤血管生成相關(guān)。Folkman等［11］提出腫瘤血管生成依賴于激活“血管生成開關(guān)”，VEGFA是VEGF最常見的亞型，與VEGFR1，VEGFR2，NRPs（神經(jīng)素）結(jié)合后，觸發(fā)并激活下游信號通路，促進血管內(nèi)皮增殖與遷移。VEGF也可引起微血管通透性升高，還可使循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞前體、相關(guān)免疫細(xì)胞和間充質(zhì)細(xì)胞聚集，在構(gòu)建腫瘤微環(huán)境中發(fā)揮重要作用。Lichtenberger等［12］研究顯示，EGFR通路與VEGF通路存在“cross?talk”效應(yīng)，兩者具有協(xié)同促進腫瘤生長的作用。

本研究觀察到，隨著奧希替尼給藥劑量的增加，藥物抑瘤效果增強，而聯(lián)合VEGF抗體后，奧希替尼抑瘤作用也會增強。而從腫瘤生長曲線可以觀察到，貝伐珠單抗協(xié)同抑瘤作用較單藥劑量加倍抑瘤作用更顯著。提示適當(dāng)劑量的奧希替尼聯(lián)合抗血管治療或許比單純增加奧希替尼劑量能帶來更大獲益。另一方面，這種聯(lián)合作用可以降低因為單一增加藥物劑量所造成的劑量限制性毒性，當(dāng)然聯(lián)合貝伐珠單抗也會引起高血壓和出血等風(fēng)險的增加。在實驗中，兩聯(lián)合組各有1只小鼠死亡。需要注意的是，與低劑量奧希替尼組小鼠在實驗后期因為腫瘤負(fù)荷大所導(dǎo)致的死亡不同，聯(lián)合組小鼠死亡發(fā)生在貝伐珠單抗給藥后第3 d，不能確定是由于藥物本身引起還是由于實驗操作所導(dǎo)致。

本實驗中還觀察到，奧希替尼聯(lián)合貝伐珠單抗組VEGF表達(dá)與微血管密度較奧希替尼單藥組減少，但奧希替尼聯(lián)合貝伐珠單抗組并未因為微血管密度降低而高表達(dá)HIF-1α。研究表明，HIF-1α能夠增強腫瘤細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化作用，重構(gòu)細(xì)胞外基質(zhì)，誘導(dǎo)耐藥，而且能夠增強腫瘤干細(xì)胞活性，協(xié)助腫瘤細(xì)胞免疫逃逸的產(chǎn)生。本研究認(rèn)為雖然貝伐珠單抗抑制了腫瘤新生血管生成，但卻改善了腫瘤內(nèi)環(huán)境，進而改善了腫瘤組織內(nèi)的供氧。這也符合Jain等［13］提出的在抗血管生成治療中出現(xiàn)的血管正?；F(xiàn)象：在1周以內(nèi)，抗血管生成治療能使迂曲變形的血管變得更加正常，組織含氧量增加。但治療持續(xù)2.5周，遠(yuǎn)超血管正?；臅r間窗。Foster等［14］認(rèn)為，HIF-1α mRNA與蛋白合成并不僅僅依賴于氧，很大程度上依賴PI3K和MAPK通路。而高劑量奧希替尼組和奧希替尼聯(lián)合貝伐珠單抗治療組PI3K和MAPK信號通路被抑制，所以HIF-1α表達(dá)下降是可以解釋的。

觀察到奧希替尼作用后能夠降低下游活化的p-EGFR表達(dá)，影響PI3K/AKT/mTOR和Ras-Raf-MAPK雙信號通路。這與既往Cross等［15］在體內(nèi)外實驗中對單藥奧希替尼作用機制的研究發(fā)現(xiàn)相一致。聯(lián)合貝伐珠單抗加強了這2條信號通路的抑制作用，這也從分子機制上解釋了聯(lián)合治療為什么能夠帶來更多的腫瘤縮小。

綜上所述，本研究通過移植瘤動物實驗證實，第3代EGFR-TKI奧希替尼對伴EGFR T790M突變的肺腺癌移植瘤具有很強的抑瘤作用，而貝伐珠單抗能夠顯著增加奧希替尼對伴EGFR T790M突變的肺腺癌移植瘤的殺傷能力，兩者具有協(xié)同作用。貝伐珠單抗與奧希替尼協(xié)同作用是通過降低腫瘤中VEGF表達(dá)，改善腫瘤微環(huán)境，增強抑制EGFR下游信號通路激活而實現(xiàn)的。本研究為進一步臨床試驗提供理論依據(jù)。

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（2017-04-08收稿）

（2017-06-08修回）

（編輯：楊紅欣 校對：周曉穎）

Effect of osimertinib combined bevacizumab on lung adenocarcinoma with EGFR T790M mutation and its mechanisms

Zhicheng XIONG,Yang LIU,Xin SUN,Jietao MA,Shuling ZHANG,Li SUN,Jing SUN,Xiaonuo ZHANG,Chengbo HAN

Chengbo HAN;E-mail:hanchengbo@sj-hospital.org
Department of Oncology,Shengjing Hospital of China Medical University,Shenyang 110020,China

Objective:This study was performed using preclinical transplanted animal experiments to analyce the effects and mechanisms of third-generation EGFR-TKIs combined with anti-angiogenic therapy,thereby providing theoretical basis for further clinical trials.Methods:Researchers constructed the transplant BALB/C nude mice models with H1975 lung adenocarcinoma cell line(EGFR T790M)and divided the mice into four groups and treated themwith osimertinib(2.5 or 5 mg/kg/day,gavage)alone or plus bevacizumab(5 mg/kg/twice weekly,i.p.)when the tumors reached approximately 0.4-0.6 cm3in volume.The tumor growth curve of tumor volume was drawn according to the time in every group.After 2 weeks of treatment,the mice were killed and the tumors were processed for immunohistochemical staining and Western blot analysis.Immunostaining was performed to detect:HIF-1α,VEGF,and microvessel density(MVD)by using SP method on paraffin sections.Western blot analysis was used to analyze the protein expression levels of EGFR,AKT,and ERK signal transduction pathways.Results:After 2weeks of treatment inhigh-andlow-doseosimertinibalone,tumor volumeinthehigh-dosegroupwas significantly lessthaninlow-doseosimertinib-alonegroup(P＜0.05).VEGF,HIF-1αexpression,andMVDweresignificantlylowinthehigh-doseosimertinibalone group(P＜0.05).Increasing doses of osimertinib induced dose-dependent weakening of the p-EGFR,p-AKT,and p-ERK expression levels(P＜0.05).In the low-dose osimertinib-plus-bevacizumab group and low-dose osimertinib-alone group,no significant difference in tumor volume and the above factors was observed.In the low-dose osimertinib-plus-bevacizumab group and high-dose osimertinib-alone group,tumor volumes did not exhibit significant difference(P=0.178).Moreover,VEGF,HIF-1α expression,and MVD exhibited no significant difference.No significant difference in the p-EGFR,p-AKT,and p-ERK expression levels was found between high-dose osimertinib-alone group and low-dose osimertinib-plus-bevacizumab group(P＞0.05).In the high-dose osimertinib-plus-bevacizumab group,tumor growth was not significantlygreater thanthat inthehigh-doseosimertinib-alonegroup(P=0.642).Nosignificant differencewas observedintheabovefactors.In the high-and low-dose osimertinib-plus-bevacizumab groups,tumor volume and the above factors did not exhibit significant differences(P＞0.05).Conclusion:Osimertinib has obvious antitumor effects in EGFR-mutant lung adenocarcinoma with T790M mutation cell xenografts.Bevacizumab has a synergetic inhibitory effect with osimertinib against EGFR-mutant lung adenocarcinoma with T790M mutation cell xenografts.Bevacizumab enhanced the antitumor effects of osimertinib by reducing VEGF expression and the microvascular density of the tumor,thereby improving the tumor microenvironment.Bevacizumab can enhance the effect of osimertinib by suppressing EGFR,ERK,and AKT phosphorylation,thereby synergistically inhibiting EGFR activation and downstream signaling.

non-small cell lung cancer,epidermal growth factor receptor,tyrosine kinase inhibitor,anti-angiogenesis therapy,tumor microenvironment

10.3969/j.issn.1000-8179.2017.15.406

中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院第一腫瘤科（沈陽市110022）

*本文課題受遼寧省高等學(xué)校杰出青年學(xué)者成長計劃項目（編號：LJQ2014082）資助

韓琤波hanchengbo@sj-hospital.org

This work was supported by Program for Liaoning Excellent Talents in University(No.LJQ2014082)

熊志成專業(yè)方向為肺癌分子靶向治療耐藥機制研究。

E-mail：xiongzhicheng@126.com