余甘子核仁油的體外抗氧化活性及其作用機理

葛雙雙，張雯雯，李 坤，徐 涓，劉蘭香，鄭 華，張 弘*

（中國林業(yè)科學(xué)研究院資源昆蟲研究所，國家林業(yè)局特色森林資源工程技術(shù)研究中心，云南 昆明 650224）

余甘子核仁油的體外抗氧化活性及其作用機理

葛雙雙，張雯雯，李 坤，徐 涓，劉蘭香，鄭 華，張 弘*

（中國林業(yè)科學(xué)研究院資源昆蟲研究所，國家林業(yè)局特色森林資源工程技術(shù)研究中心，云南 昆明 650224）

本研究旨在研究余甘子核仁油的體外抗氧化作用，并探索多不飽串聯(lián)和脂肪酸的抗氧化機理。以1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazl，DPPH）自由基與2,2’-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽自由基（2,2’-azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphoate) radical，ABTS+·）為實驗對象，通過余甘子核仁油對2種自由基的清除作用，評估其體外抗氧化能力。結(jié)果表明：余甘子核仁油對DPPH自由基清除作用的半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）為5.08 mg/mL，最大清除率為95.91%；對ABTS+·清除作用的IC50為9.84 mg/mL，最大清除率為98.58%。α-亞麻酸的清除自由基實驗表明，余甘子核仁油中起抗氧化作用的主要物質(zhì)為α-亞麻酸等多不飽和脂肪酸。通過抗氧化前后混合脂肪酸的紫外光譜掃描、紅外光譜吸收，檢測到了氧化后混合脂肪酸中共軛脂肪酸和羥基脂肪酸的生成，并在DPPH自由基過量條件下，利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀檢測到了單羥基脂肪酸的存在，從而證明多不飽和脂肪酸清除自由基反應(yīng)機理基至少包括多不飽和脂肪酸的共軛化、單分子加成、碳碳雙鍵α-H氧化及環(huán)氧化。

余甘子核仁油；體外抗氧化能力；多不飽和脂肪酸；α-亞麻酸；抗氧化作用機理

余甘子（Phyllanthus emblica L.）屬大戟科葉下珠屬植物，廣泛分布于中國、印度、印度尼西亞、馬來半島的熱帶和亞熱帶地區(qū)[1]，余甘子在中國與印度的傳統(tǒng)藥物體系中已經(jīng)使用了1 000多年，也是世界衛(wèi)生組織指定廣泛種植的3 種保健植物之一[2]。余甘子中富含多酚類、生物堿類、類黃酮、糖類、VC等成分[3-4]。豐富的營養(yǎng)成分使得余甘子具有抗衰老[5-7]、降血脂[8]、抑菌[9]、抗動脈粥樣硬化[10]、抗癌[11]等多種保健和藥用功效。因此，針對余甘子果肉、葉子及其根莖的相關(guān)研究較多[12-14]，而對余甘子核仁的研究甚少。近年來，出現(xiàn)了少量有關(guān)余甘子核仁的研究，主要集中在余甘子核仁油的提取方法[15]及其脂肪酸組成的分析等方面[16-18]。從其脂肪酸組成來看，余甘子核仁油的不飽和度較高，α-亞麻酸更是超過50%[19]。事實上，圍繞不飽和脂肪酸的研究已涵蓋了諸多方面[20-23]，抗氧化無疑是研究熱點之一。然而，絕大多數(shù)抗氧化研究關(guān)注的是試材自身對不同自由基的清除活性，對試材中發(fā)揮抗氧化作用的物質(zhì)種類卻多不明確，對試材中活性物的抗氧化機理研究更是鮮有報道。就油脂與不飽和脂肪酸而言，有關(guān)其自氧化的報道較多[24-27]，然而，對其抗氧化的相關(guān)報道較少。少量有關(guān)油脂與不飽和脂肪酸抗氧化的報道，亦偏重于抗氧化活性研究[28-29]。本實驗以余甘子核仁油為研究對象，在驗證了余甘子核仁油抗氧化活性的基礎(chǔ)上，揭示了油脂中抗氧化活性物質(zhì)的類別，并進一步對不飽和脂肪酸的抗氧化機理進行了探索，為油脂抗氧化的深入研究提供了參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

余甘子核仁由昆明酷特利生物科技有限公司提供。

氫氧化鉀、過硫酸鉀（均為分析純） 天津市風船化學(xué)試劑有限公司；正己烷、無水乙醇、乙醚、甲醇、苯、石油醚（60～90 ℃）（均為分析純）廣東光華科技股份有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazl，DPPH）自由基 美國Sigma公司；2,2’-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）（2,2’-azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphoate)，ABTS）（純度100%） EMD生物科技有限公司；抗壞血酸（分析純） 國藥集團化學(xué)試劑有限公司；亞麻酸甲酯（純度≥99.5%，色譜純）阿拉丁試劑（上海）有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

AB204-S精密型電子天平 瑞士梅特勒-托利多（中國）有限公司；116型搖擺式六兩裝高速中藥粉碎機 浙江瑞安市永歷制藥機械有限公司；TY742X2A純水機 美國Barnstead公司；DSX-90數(shù)顯攪拌機杭州儀表電機有限公司；VOS-3000VD型真空干燥箱、N1000 Rotavapor R11型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 日本東京理化器械株式會社；DU 800紫外分光光度計 美國貝克曼庫爾特有限公司；Tensor-27傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)T-IR）儀 德國布魯克公司；Xevo TQ-S超高壓液相色譜三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國Waters公司；ITQ 900氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）儀賽默飛世爾科技（中國）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 余甘子核仁油的提取

取適量余甘子核仁粉碎，參照GB/T 14488.1—2008《植物油料含油量測定》[30]，以正己烷為溶劑進行提取，提取液經(jīng)旋蒸濃縮后得到余甘子核仁油。

1.3.2 余甘子核仁油對DPPH自由基清除率的測定

以無水乙醇為溶劑，分別配制濃度為2×10-4mol/L的DPPH自由基溶液，配制質(zhì)量濃度為2.0、5.0、10.0、15.0、20.0、30.0 mg/mL的余甘子核仁油溶液和質(zhì)量濃度為0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 mg/mL抗壞血酸溶液。精確吸取4 mL不同質(zhì)量濃度余甘子核仁油溶液和抗壞血酸溶液，加入4 mL DPPH自由基溶液，搖勻后在暗室下放置30 min，在517 nm波長處測定上述溶液的吸光度[31]。按照式（1）計算DPPH自由基清除率。

式中：A為樣品（不同質(zhì)量濃度的樣品溶液）與DPPH混合溶液的吸光度；A0為樣品（同上）與無水乙醇混合溶液的吸光度；A1為無水乙醇與DPPH混合溶液的吸光度。

1.3.3 余甘子核仁油對ABTS+·清除率的測定

將ABTS及過硫酸鉀用少量水溶解，再以無水乙醇為溶劑配制濃度為7×10-3mol/L 的ABTS+·溶液與濃度為2.5×10-3mol/L 的過硫酸鉀溶液，并將二者等體積混合，在暗處放置12 h后取混合溶液稀釋50 倍待用。配制質(zhì)量濃度為5.0、10.0、15.0、20.0、30.0 mg/mL的余甘子核仁油溶液和質(zhì)量濃度為0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、1.00 mg/mL的抗壞血酸溶液。精確吸取1 mL不同質(zhì)量濃度的余甘子核仁油樣品溶液或抗壞血酸樣品溶液，分別加入5 mL ABTS+·和過硫酸鉀混合溶液，搖勻后于室溫條件下避光30 min。以無水乙醇作為對照，在734 nm波長處分別測定上述溶液的吸光度[32]。按照式（2）計算其清除率。

式中：A為樣品（不同質(zhì)量濃度的樣品溶液）與ABTS+·和過硫酸鉀混合溶液的吸光度；A0為樣品（同上）與無水乙醇混合溶液的吸光度；A1為無水乙醇與ABTS+·和過硫酸鉀混合溶液的吸光度。

1.3.4 亞麻酸甲酯對DPPH自由基清除率的測定

配制質(zhì)量濃度為1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mg/mL的亞麻酸甲酯樣品溶液，采用1.3.2節(jié)中的方法，按式（1）計算亞麻酸甲酯對DPPH自由基的清除率。

1.3.5 余甘子核仁油混合脂肪酸的制備方法

稱取30 g余甘子核仁油加入裝有300 mL濃度為1 mol/L KOH-乙醇溶液的燒瓶中，在80 ℃的水浴中加熱回流1 h，回流期間不斷搖動燒瓶，皂化完全冷卻至室溫，得到皂化液，加入100 mL蒸餾水，將其混合均勻，轉(zhuǎn)移至分液漏斗，分別用300 mL正己烷萃取非皂化物3 次，取下層水相，用體積分數(shù)為10%的HCl調(diào)pH值至2～3，加入適量的正己烷進行萃取，留正己烷相，并加入無水硫酸鈉脫水，經(jīng)溶劑回收得到混合脂肪酸。稱取上述混合脂肪酸200 mg，定容至100 mL，配制質(zhì)量濃度為2 mg/mL混合脂肪酸溶液后保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.6 余甘子核仁油的抗氧化作用機理研究

1.3.6.1 氧化前后余甘子核仁油的組分分析

余甘子核仁油與混合脂肪酸的甲酯化方法參照GB/T 17376—2008《動植物油脂脂肪酸甲酯制備》[33]中三氟化硼法。

氣相色譜條件：色譜柱：C P 7 4 2 0毛細管柱（100 m×0.25 mm，0.25 μm）；升溫程序：初始溫度100 ℃，保持20 min，以20 ℃/min的速率升至190 ℃，保持20 min，然后以1 ℃/min的速率升溫到210 ℃，保持10 min，再以4 ℃/min的速率升溫至250 ℃，最后保持10 min；進樣口溫度：250 ℃；載氣：高純氦氣，流速1.0 mL/min；分流比：20∶1；進樣量：1 μL。

質(zhì)譜條件：電離方式：電子轟擊離子源，電子能量70 eV；離子源溫度：250 ℃；傳輸線溫度：250 ℃；質(zhì)量掃描范圍：40～400 u。

1.3.6.2 多不飽和脂肪酸抗氧化作用的結(jié)果驗證

以α-亞麻酸甲酯代替余甘子核仁油，按照1.3.2節(jié)中的方法進行DPPH自由基清除實驗，再按照1.3.6.1節(jié)的方法采用GC-MS儀檢測。

1.3.6.3 多不飽和脂肪酸抗氧化作用機理研究

氧化前后樣品的紫外-分光光度計分析：掃描條件：采樣間隔為1 nm，掃描速率為中速，光譜寬帶為1 nm，波長范圍為200～800 nm，每個樣品平行掃描3 次。

氧化前后樣品的FT-IR分析條件：掃描范圍為4 000～400 cm-1，分辨率為4 cm-1，固體樣品經(jīng)KBr壓片后進行測試，液體樣品直接滴加在KBr片上進行測試。

氧化前后樣品的GC-MS分析：取DPPH溶液200 mL，與1 mL混合脂肪酸貯備液混合，按照1.3.2節(jié)方法進行DPPH自由基清除反應(yīng)后，濃縮上述反應(yīng)液至3～5 mL，參照文獻[34]向反應(yīng)濃縮液中加入2 mL體積分數(shù)為5%的氫氧化三甲基（間-三氟甲基）苯基銨（3-(tri fl uoromethyl)phenyltrimethylammonium hydroxide，TMTFTH）的甲醇溶液后，常溫反應(yīng)24 h，進行GC-MS檢測。檢測條件為：DB-5MS色譜柱（100 m×0.25 mm，0.25 μm），進樣口溫度300 ℃，接口溫度300 ℃；升溫程序：起始溫度50 ℃，保持2 min，以10 ℃/min升至310 ℃，保持22 min；進樣量5 μL；分流比50∶1；離子源溫度250 ℃；四極桿溫度180 ℃。

氧化前后樣品的電噴霧質(zhì)譜（electrospray ionization mass spectrometry，ESI源質(zhì)譜）分析：取α-亞麻酸甲酯及1.3.5節(jié)中制備所得混合脂肪酸樣品，按照1.3.2節(jié)的方法進行DPPH自由基清除實驗后，采用ESI源質(zhì)譜進樣檢測。質(zhì)譜檢測條件為：α-亞麻酸甲酯標準品為正離子模式ESI+，混合脂肪酸為負離子模式ESI-；錐孔電壓5 V；射頻透鏡電壓為0.5 V；源溫120 ℃；脫溶劑氣溫度為350 ℃；脫溶劑氣流為600 L/h；錐孔氣流為50 L/h；采集模式為四通道選擇性離子采集模式。

2 結(jié)果與分析

2.1 余甘子核仁油對DPPH自由基的清除能力

DPPH自由基溶液呈紫羅蘭色且在517 nm波長處有特征吸收峰，當具有抗氧化成分的物質(zhì)與自由基作用后，紫羅蘭顏色褪去，通過溶液吸光度變化來計算自由基清除程度[35]。因此，可以通過對DPPH自由基的清除能力來評價某些組分的抗氧化活性。該法被廣泛應(yīng)用于物質(zhì)清除自由基能力的研究中。不同質(zhì)量濃度的余甘子核仁油溶液及抗壞血酸溶液對DPPH自由基的清除效果如圖1所示。

圖1 余甘子核仁油（a）和抗壞血酸（b）對DPPH自由基的清除作用Fig. 1 DPPH radical scavenging capacity of Phyllanthus emblica L. seed oil (a) and ascorbic acid (b)

由圖1可知，隨著余甘子核仁油質(zhì)量濃度的升高，對DPPH自由基清除率也逐漸增大。在2～20 mg/mL范圍內(nèi)，余甘子核仁油溶液對DPPH自由基的清除效果由26.28%迅速增加到95.70%；隨著余甘子核仁油溶液質(zhì)量濃度的進一步升高，清除率增加緩慢直至趨于平緩，當質(zhì)量濃度在30 mg/mL時，清除率達到95.91%。抗壞血酸在質(zhì)量濃度為0.02 mg/mL時，對DPPH自由基的清除率已經(jīng)達到89.50%，最大清除率為93.03%，其半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）為0.015 mg/mL。根據(jù)文獻[36]報道，抗壞血酸在低濃度時就有一定的清除作用，主要因為DPPH自由基溶液中有DPPH自由基和正離子態(tài)的DPPH+兩種形態(tài)平衡存在，抗壞血酸對兩種形態(tài)都具有清除作用，而油脂清除DPPH自由基的作用機理還未明確，本研究選擇抗壞血酸作為余甘子核仁油體外抗氧化研究的一個陽性對照。由圖1可知，余甘子核仁油對DPPH自由基的最大清除率與抗壞血酸相當，余甘子核仁油對DPPH自由基清除作用的IC50=5.08 mg/mL，文獻[37]中葡萄籽油質(zhì)量濃度為25 mg/mL時，對DPPH自由基的清除率在80%左右，燕麥粗油[38]的IC50=5.15 mg/mL，最大清除率在80%左右，與其他油脂相比，余甘子核仁油具有較強的抗氧化作用。

2.2 余甘子核仁油對ABTS+·的清除能力

檢測一種物質(zhì)抗氧化的能力時，由于其抗氧化原理不同，在一種檢測方法中其抗氧化效果較好，而在另一種檢測方法中可能是促氧化劑[39]。因此，實驗選取ABTS+·作為另一種抗氧化活性檢測方法。ABTS+·溶液呈藍綠色，具有抗氧化活性的物質(zhì)與其反應(yīng)后導(dǎo)致溶液褪色，通過其在734 nm波長處吸光度的變化評價物質(zhì)的抗氧化能力。余甘子核仁油樣品溶液及抗壞血酸溶液對ABTS+·的清除效果如圖2所示。

·的清除作用Fig. 2 ABTS+· radical scavenging capacity of Phyllanthus emblica L. seed oil (a) and ascorbic acid (b)圖2余甘子核仁油（a）和抗壞血酸（b）對ABTS +

由圖2可以看出，不同質(zhì)量濃度的余甘子核仁油溶液與抗壞血酸溶液對ABTS+·均有清除作用，且隨著質(zhì)量濃度的提高，ABTS+·的清除率也逐漸升高。余甘子核仁油溶液在5～20 mg/mL范圍內(nèi)，對ABTS+·的清除率由8.41%迅速增加到95.70%，之后趨于平緩；對于ABTS+·，抗壞血酸溶液仍有較強的清除能力，在質(zhì)量濃度為0.05 mg/mL時，對ABTS+·的清除率已經(jīng)達到90.51%。余甘子核仁油對ABTS+·清除作用的IC50=9.84 mg/mL，抗壞血酸對ABTS+·清除作用的IC50=0.035 mg/mL，二者差異較大，不過余甘子核仁油對ABTS+·的最大清除率（98.58%）與抗壞血酸（90.51%）相近，表明余甘子核仁油具有一定的ABTS+·清除能力。

2.3 余甘子核仁油體外抗氧化作用機理研究

2.3.1 氧化前后余甘子核仁油的組分對比

由2.1和2.2節(jié)可知，余甘子核仁油對DPPH自由基和ABTS+·均顯示出了一定的清除能力。從化學(xué)反應(yīng)本質(zhì)上看，清除自由基為氧化還原反應(yīng)，自由基為氧化劑，作為還原劑的余甘子核仁油清除自由基后的氧化產(chǎn)物是分析其抗氧化機理的直接有力證據(jù)。因此，以DPPH自由基為例，采用三氟化硼甲酯化方法，對氧化前后余甘子核仁油的脂肪酸組成進行GC-MS檢測，結(jié)果如表1所示。

表1 DPPH自由基處理前后余甘子核仁油中的脂肪酸組成及相對含量Table 1 Fatty acid composition of Phyllanthus emblica L. seed oil before and after DPPH radical scavenging

由表1可知，DPPH自由基氧化前后余甘子核仁油的脂肪酸含量發(fā)生變化。氧化前，余甘子核仁油中主要有6 種脂肪酸，總含量占所檢測出總成分的98.96%，其中多不飽和脂肪酸含量占72.95%，9,12,15-十八碳烯酸（α-亞麻酸）占檢出化合物的54.46%。而氧化后，多不飽和脂肪酸和α-亞麻酸相對含量分別下降至72.60%和54.07%。盡管DPPH自由基氧化前后多不飽和脂肪酸的含量降低幅度不大，但必須指出的是，在該抗氧化實驗中，DPPH自由基的用量僅為混合脂肪酸用量的1/375～1/25。依據(jù)余甘子核仁油的組成，并結(jié)合相關(guān)報道[40-41]可推測，余甘子核仁油中體外抗氧化作用的主要物質(zhì)為多不飽和脂肪酸，而余甘子核仁油中多不飽和脂肪酸主要是α-亞麻酸?？梢?，α-亞麻酸可能就是余甘子核仁油中抗氧化的活性物質(zhì)。為進一步驗證該推論，以α-亞麻酸甲酯為還原劑的驗證實驗很有必要。

2.3.2 多不飽和脂肪酸的抗氧化作用驗證

圖3 α-亞麻酸甲酯對DPPH自由基的清除作用Fig. 3 DPPH radical scavenging capacity of

由圖3可以看出，α-亞麻酸甲酯對DPPH自由基有較好的清除作用，其作用效果及趨勢與余甘子核仁油高度一致。主要區(qū)別在于相同質(zhì)量濃度條件下，α-亞麻酸甲酯的DPPH自由基清除率明顯高于余甘子核仁油，這初步說明α-亞麻酸在余甘子核仁油清除自由基中的主體作用。此外，以半數(shù)抑制率IC50為例，α-亞麻酸甲酯對DPPH自由基清除作用的IC50為2.81 mg/mL，2.1節(jié)中余甘子核仁油對DPPH自由基清除作用的IC50為5.08 mg/mL，其占比為55.3%，與余甘子核仁油中α-亞麻酸的相對含量為54.46%高度接近，可推斷余甘子核仁油對DPPH自由基有清除作用的成分可能正是α-亞麻酸。

2.3.3 α-亞麻酸的抗氧化作用機理探索

為進一步探索α-亞麻酸對DPPH自由基的作用機理，以混合脂肪酸為樣品，經(jīng)DPPH自由基氧化前后的相關(guān)表征結(jié)果及分析如下。

2.3.3.1 紫外光譜掃描分析

如圖4所示，DPPH自由基樣品分別在326、515 nm波長處存在特征吸收峰，這與文獻[42]報道的323 nm和 517 nm波長處存在吸收峰基本一致；混合脂肪酸樣品在200～800 nm波長范圍內(nèi)并無特征吸收峰，而經(jīng)DPPH自由基氧化后的混合脂肪酸在240、245、251、257 nm波長處分別有明顯的特征吸收峰，這與相關(guān)報道共軛脂肪酸在230～240 nm波長范圍內(nèi)有特征吸收峰的結(jié)果吻合[43]，且隨著共軛結(jié)構(gòu)的不同和共軛雙鍵數(shù)目的增多，特征吸收峰發(fā)生紅移[44]。

圖4 DPPH自由基氧化混合脂肪酸后的全波長掃描Fig. 4 Full wavelength scanning spectra of mixed fatty acids after DPPH radical scavenging

2.3.3.2 FT-IR分析

圖5 DPPH自由基氧化前后混合脂肪酸的FT-IR對比Fig. 5 FTIR spectra of mixed fatty acids after DPPH radical scavenging

對比圖5中DPPH自由基、混合脂肪酸、DPPH自由基氧化后的混合脂肪酸的FT-IR圖可發(fā)現(xiàn)：1）氧化后的混合脂肪酸在3 458 cm-1處的羥基吸收峰相對前兩者明顯變寬變強，這說明氧化后的混合脂肪酸中的羥基數(shù)量明顯增多；2）混合脂肪酸的1 710 cm-1處的羰基吸收峰，在氧化后平移至1 740 cm-1，且原1 657 cm-1處的非共軛—C＝C—的伸縮振動吸收峰，平移至1 639 cm-1處的共軛— C＝C—C＝C—的伸縮振動吸收峰[45]，這充分說明氧化后的混合脂肪酸樣品中有新的共軛結(jié)構(gòu)生成。

2.3.3.3 GC-MS分析

在2.3.1節(jié)中，通過GC-MS分析了經(jīng)DPPH自由基氧化前后余甘子核仁油的脂肪酸組成差異，除質(zhì)譜數(shù)據(jù)外，其他檢測方法并未發(fā)現(xiàn)相關(guān)氧化產(chǎn)物的存在，原因在于以余甘子核仁油清除DPPH自由基時，核仁油過量（相同濃度條件下，DPPH自由基溶液與核仁油的加入體積比例為1∶1），即核仁油為DPPH自由基用量的25～375 倍，因此，即使反應(yīng)轉(zhuǎn)化率為100%條件下，氧化產(chǎn)物的占比也極小，僅為0.26%～3.80%，加之羥基脂肪酸僅為自由基氧化的中間產(chǎn)物，在其生成的同時，還必然伴隨有深度氧化反應(yīng)的消耗，因此存在于反應(yīng)體系中的羥基脂肪酸的量極少，在GC-MS譜圖中極易被掩蓋。而在過量DPPH自由基氧化時，DPPH自由基與核仁油的加入體積比例為200∶1（如圖5中c所示），即DPPH自由基的用量為混合脂肪酸的7.88 倍。以DPPH自由基過量的方式，通過GC-MS檢測氧化前后混合脂肪酸成分的差異，結(jié)果如圖6所示。

圖6 過量DPPH自由基氧化前后混合脂肪酸的GC-MS譜圖對比Fig. 6 GC-MS prof i les of fatty acid mixture before and after oxidization by excessive DPPH radical

由圖6可知，氧化前后混合脂肪酸的組成在DPPH自由基過量的條件下表現(xiàn)出了明顯的差異，氧化前混合脂肪酸中分別為棕櫚酸、硬脂酸、油酸、亞油酸和α-亞麻酸，而經(jīng)DPPH自由基氧化后，亞油酸（峰d）消失，α-亞麻酸（峰e）急劇降低，且在氧化后的氣質(zhì)檢測圖中產(chǎn)生了2-羥基亞麻酸。這再次說明余甘子核仁油中抗氧化的主要物質(zhì)為α-亞麻酸和亞油酸等多不飽和脂肪酸，且抗氧化產(chǎn)物中確有羥基脂肪酸生成，而2號位羥基的存在則可能是部分雙鍵發(fā)生轉(zhuǎn)移的結(jié)果[46]。此外，這里必須指出的是，為降低多羥基脂肪酸的沸點，使得其在GC-MS中能夠順利汽化，本實驗參照文獻[34]中所采用的TMTFTH完全甲氧基化方法，但實際操作中發(fā)現(xiàn)TMTFTH與DPPH自由基間會優(yōu)先發(fā)生反應(yīng)，使得DPPH自由基溶液產(chǎn)生明顯的褪色現(xiàn)象，這使得TMTFTH的甲氧基化效力降低，故而也僅檢測到了單羥基脂肪酸的甲酯化產(chǎn)物（峰f）。

2.3.3.4 ESI源質(zhì)譜分析

為全面地得到氧化產(chǎn)物信息以印證上述分析結(jié)果，氧化前后混合脂肪酸和α-亞麻酸甲酯的ESI源質(zhì)譜檢測結(jié)果圖7所示。

圖7 DPPH自由基氧化前后α-亞麻酸甲酯及混合脂肪樣品的MS圖Fig. 7 Mass spectra of α-methyl linolenate and mixed fatty acids after DPPH radical scavenging

由圖7可知，氧化后α-亞麻酸甲酯及混合脂肪酸樣品的MS圖中分子離子峰明顯增多，現(xiàn)以α-亞麻酸甲酯（M=292）和混合脂肪酸中的α-亞麻酸（M=278）為目標物，分析樣品m/z的變化規(guī)律如表2所示。

表2 氧化后α-亞麻酸甲酯和α-亞麻酸的m/z變化Table 2 Molecular weight variations of α- linolenic acid methyl ester and α- linolenic acid after oxidation

由表2可知，氧化后的α-亞麻酸及α-亞麻酸甲酯的m/z出現(xiàn)了較為明顯的規(guī)律性變化，以α-亞麻酸甲酯為例，MS圖中存在M+16及M+16+18的相對分子質(zhì)量交替增長的變化規(guī)律，依據(jù)此規(guī)律，α-亞麻酸中m/z 395處的分子離子峰亦能較好吻合；而除個別相對分子質(zhì)量有偏差外，α-亞麻酸甲酯的m/z與上述相對分子質(zhì)量變化規(guī)律幾乎完全吻合。可見，該體外抗氧化實驗在DPPH自由基氧化α-亞麻酸的過程中，必然伴隨著羥基脂肪酸的生成，且由相對分子質(zhì)量M+16和M+18的交替增長方式來看，α-亞麻酸的氧化首先以非共軛雙鍵的共軛化反應(yīng)開始，這與Buege等[47]的研究報道相符，但與油脂自氧化不同的是，該氧化過程由于DPPH自由基的存在而更加迅速，因此，1 次氧化后的穩(wěn)定終產(chǎn)物為α-亞麻酸的單羥基脂肪酸。隨后的2 次氧化，則是由自由基進攻共軛雙鍵開始的，拋開反應(yīng)歷程，單從反應(yīng)產(chǎn)物來看，2 次氧化與1 分子H2O對—C＝C—的加成反應(yīng)類似，生成H—C—C—OH結(jié)構(gòu)的羥基脂肪酸，第3次氧化與第1次氧化類似，繼續(xù)發(fā)生的是剩余2 個非共軛雙鍵重排為共軛雙鍵[48]，同時生成三羥基脂肪酸的過程，以此類推，直至雙鍵消耗完全。然而，按照上述反應(yīng)機理，最多只能產(chǎn)生五羥基脂肪酸，無法解釋質(zhì)譜中八羥基脂肪酸的存在，因此，在α-亞麻酸生成共軛脂肪酸的過程中，還應(yīng)伴隨有α-H氧化及環(huán)氧化反應(yīng)的存在[26,49-50]，使得部分雙鍵環(huán)氧化后水解為雙羥基脂肪酸。該反應(yīng)機理示意圖如圖8。

圖8 以α-亞麻酸為代表的體外抗氧化機理推測示意圖Fig. 8 Schematic diagram of putative antioxidant mechanism in vitro of α-linolenic acid

圖8僅為以α-亞麻酸為還原劑清除DPPH自由基的反應(yīng)中，α-亞麻酸的氧化機理示意圖，并不意味著羥基脂肪酸即為氧化終產(chǎn)物。事實上，所生成的多羥基脂肪酸僅可視為α-亞麻酸抗氧化的中間產(chǎn)物，只是該中間產(chǎn)物能在一定時間內(nèi)穩(wěn)定存在，而隨著反應(yīng)時間的延長，該中間產(chǎn)物將繼續(xù)氧化使得脂肪酸碳鏈斷裂而生成小分子的醛、酮、酸類物質(zhì)。

3 結(jié) 論

余甘子核仁油對DPPH自由基的最大清除率為95.91%，其IC50為5.08 mg/mL，對ABTS+·的最大清除率為98.58%，IC50為9.84 mg/mL。與葡萄籽油、核桃油等不飽和脂肪酸含量較高的油脂相比，余甘子核仁油具有較強的抗氧化活性。

余甘子核仁油中，抗氧化活性物質(zhì)為多不飽和脂肪酸，即α-亞麻酸和亞油酸，其總含量占余甘子核仁油脂肪酸含量的72.95%，其中α-亞麻酸含量達54.46%。

以α-亞麻酸為目標物，通過對比氧化前后混合脂肪酸樣品的紫外光譜掃描、FT-IR分析檢測到氧化后混合脂肪酸樣品中共軛脂肪酸和羥基脂肪酸的生成，并在DPPH自由基過量條件下以GC-MS檢測到了單羥基脂肪酸的存在，并依據(jù)ESI源質(zhì)譜的檢測結(jié)果提出多不飽和脂肪酸清除自由基的過程是一個復(fù)雜反應(yīng)，反應(yīng)機理至少包括了多不飽和脂肪酸的共軛化、單分子加成、碳碳雙鍵α-H氧化及環(huán)氧化。

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Antioxidant Activity and Mechanism in Vitro of Phyllanthus emblica L. Seed Oil

GE Shuangshuang, ZHANG Wenwen, LI Kun, XU Juan, LIU Lanxiang, ZHENG Hua, ZHANG Hong*
(Research Center of Engineering and Technology on Forest Resources with Characteristics, State Forestry Administration, Research Institute of Resources Insects, Chinese Academy of Forestry, Kunming 650224, China)

The purpose of this study was to reveal the antioxidant activity in vitro of Phyllanthus emblica L. seed oil and to explore the role of the polyunsaturated fatty acids presented in the seed oil in its antioxidant mechanism. 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazl (DPPH) radical and 2,2’-azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphoate) radical (ABTS+·) scavenging assays were employed to evaluate the antioxidant activity. The results indicated that the scavenging capacity of Phyllanthus emblica L. seed oil against DPPH radical and ABTS+· were 95.91% and 98.58%, with half maximal inhibitory concentration (IC50) of 5.08 and 9.84 mg/mL respectively. The main antioxidants in Phyllanthus emblica L. seed oil were polyunsaturated fatty acids including α-linolenic acid. Conjugated fatty acid and hydroxyl fatty acid were detected in mixed fatty acids after oxidation characterized by ultraviolet (UV) spectroscopy and Fourier transform infrared spectroscopy (FT-IR). Moreover, monohydroxyl fatty acid was detected by gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) under the condition of excessive DPPH radical. All the above data indicated that the free radicals scavenging mechanism of polyunsaturated fatty acids included polyunsaturated fatty acid conjugation, singlemolecule addition, α-H oxidation of C＝C double bond and epoxidation reaction at least.

Phyllanthus emblica L. seed oil; antioxidant activity in vitro; polyunsaturated fatty acids; α-linolenic acid; antioxidant mechanism

10.7506/spkx1002-6630-201715021

TS201.2；TS225.1

A

1002-6630（2017）15-0127-08

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GE Shuangshuang, ZHANG Wenwen, LI Kun, et al. Antioxidant activity and mechanism in vitro of Phyllanthus emblica L. seed oil[J]. Food Science, 2017, 38(15): 127-134. (in Chinese with English abstract)

10.7506/spkx1002-6630-201715021. http://www.spkx.net.cn

2016-07-13

中央級公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)費專項（RIRICAF2015003M）；“十三五”國家重點研發(fā)計劃重點專項（2016YFD0600806）

葛雙雙（1990—），女，碩士研究生，研究方向為天然產(chǎn)物開發(fā)與利用。E-mail：geshuangshuang0407@163.com

*通信作者：張弘（1963—），男，研究員，博士，研究方向為林業(yè)生物資源化學(xué)與工程。E-mail：kmzhhong@163.com