三元離子締合物測(cè)定牛奶中的四環(huán)素殘留

單展，范晶晶，馬小龍，唐寧莉

1(桂林理工大學(xué) 化學(xué)與生物工程學(xué)院，廣西 桂林， 541004) 2(桂林理工大學(xué) 廣西高校食品安全與檢測(cè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 桂林,541004)

分析與檢測(cè)

三元離子締合物測(cè)定牛奶中的四環(huán)素殘留

單展1，范晶晶1，馬小龍1，唐寧莉*

1(桂林理工大學(xué) 化學(xué)與生物工程學(xué)院，廣西 桂林， 541004) 2(桂林理工大學(xué) 廣西高校食品安全與檢測(cè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 桂林,541004)

在醋酸溶液中，四環(huán)素(tetracycline，Tc)與Cu2+形成螯合陽(yáng)離子，然后進(jìn)一步與帶負(fù)電荷的鉻天青S通過(guò)靜電引力形成三元離子締合物，導(dǎo)致反應(yīng)體系的共振散射信號(hào)增強(qiáng)，據(jù)此建立了一種測(cè)定痕量Tc的共振散射光譜新方法。在最佳條件下，波長(zhǎng)700 nm處，Tc濃度與體系共振散射強(qiáng)度的增加值(ΔI)在0.2～22 μmol/L呈良好的線(xiàn)性關(guān)系，其線(xiàn)性回歸方程為：ΔI=1.021×107c+1.437(c為T(mén)c的濃度，mol/L)，方法的檢出限為8.81×10-9mol/L，相關(guān)系數(shù)r=0.999 0。將該方法應(yīng)用于牛奶樣品中Tc的測(cè)定，回收率為100.00%～101.20%。

鉻天青S；四環(huán)素；牛奶；共振散射

四環(huán)素(tetracycline，Tc)是一種具有廣譜抗菌活性的抗生素，可作為預(yù)防和治療禽畜疾病的獸藥或作為飼料添加劑應(yīng)用于動(dòng)物飼料中。近年來(lái)，隨著我國(guó)禽畜養(yǎng)殖業(yè)的規(guī)?；l(fā)展，殘留的四環(huán)素對(duì)環(huán)境和人類(lèi)健康構(gòu)成了巨大的潛在危險(xiǎn)和威脅。因此四環(huán)素的痕量分析對(duì)于環(huán)境監(jiān)管和食品監(jiān)管部門(mén)是非常重要的工作。目前，測(cè)定Tc的主要方法有高效液相色譜法及其聯(lián)用技術(shù)[1-2]、毛細(xì)管電泳、酶聯(lián)免疫分析法[3]、紫外-可見(jiàn)分光光度法[4-5]、熒光光度法[6-7]、共振散射法[8-9]等。

共振散射光譜法(resonance light scattering，RLS)具備簡(jiǎn)易、靈敏、快速和成本低的優(yōu)點(diǎn)，近年來(lái)被廣泛應(yīng)用于檢測(cè)痕量金屬離子、生物大分子和藥物。但目前應(yīng)用共振散射光譜技術(shù)定量檢測(cè)四環(huán)素的研究較少。本研究利用四環(huán)素分子中C11、C12位上的β-二酮結(jié)構(gòu)與金屬離子Cu2+形成二元陽(yáng)離子，然后二元陽(yáng)離子進(jìn)一步與帶負(fù)電荷的鉻天青S通過(guò)靜電引力形成三元離子締合物，導(dǎo)致反應(yīng)前后體系的共振散射強(qiáng)度發(fā)生變化，從而建立測(cè)定四環(huán)素的共振散射光譜新方法，進(jìn)一步提高了方法的靈敏度和選擇性，并用實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了反應(yīng)機(jī)理。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1儀器與試劑

Cary Eclipse型熒光光度計(jì)，美國(guó)Varian；ZS90型納米粒度與Zeta電位分析儀,英國(guó)Malvern公司；pHS-3C型精密pH計(jì),上海雷磁儀器廠(chǎng)。

四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)溶液(Tc，90%，美國(guó)Amresco公司)：1.0×10-3mol/L的Tc儲(chǔ)備液，Tc工作液(1.0×10-4mol/L)由儲(chǔ)備液稀釋得到；Cu2+溶液(1.0×10-2mol/L)，由CuSO4(廣州化學(xué)試劑廠(chǎng))配制；鉻天青S溶液(CAS，1.2×10-3mol/L),上海試劑三廠(chǎng);HCl、H2SO4、HAc溶液(5.0×10-5mol/L),廣東汕頭市西隴化工股份有限公司。

實(shí)驗(yàn)用水均為二次去離子水，所用試劑均為分析純。盒裝鮮牛奶樣品，購(gòu)于當(dāng)?shù)爻小?/p>

1.2實(shí)驗(yàn)方法

在10 mL的比色管中，分別加入5.0×10-5mol/L的HAc溶液0.5 mL，1.0×10-2mol/L的Cu2+溶液1.0 mL，1.2×10-3mol/L的CAS溶液1.0 mL和一定量的Tc工作液(以不加Tc的溶液為試劑空白)，加水稀釋至10 mL，搖勻，25 ℃反應(yīng)10 min后，在熒光光度計(jì)上以λex=λem方式進(jìn)行同步掃描，記錄波長(zhǎng)700 nm處加有四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)溶液的RLS強(qiáng)度I和試劑空白的RLS強(qiáng)度I0，并計(jì)算RLS強(qiáng)度差值ΔI=I-I0。

2 結(jié)果與討論

2.1體系的共振散射光譜

按照實(shí)驗(yàn)方法掃描了體系不同組合的RLS光譜，結(jié)果如圖1所示。在HAc溶液中，Cu2+、CAS、Tc的兩兩反應(yīng)產(chǎn)物(圖1中的a～c)的RLS強(qiáng)度均較弱，但當(dāng)三者共存時(shí)，體系的RLS強(qiáng)度隨Tc的加入量增大而增強(qiáng)(圖1中的d和e)，同時(shí)在700 nm處具有最強(qiáng)的RLS峰，由此可見(jiàn)三者結(jié)合生成三元離子締合物導(dǎo)致體系的RLS強(qiáng)度增強(qiáng)。

a:四環(huán)素與銅離子混合溶液；b:四環(huán)素與鉻天青S混合溶液；c:鉻天青S與銅離子混合溶液；d-e:鉻天青S與銅離子及四環(huán)素混合溶液四環(huán)素的濃度: 1.0×10-5 mol/L(a,b,e); 5.0×10-6 mol/L (d)圖1 體系的共振散射光譜Fig.1 Resonance light scattering spectra of the systems

2.2實(shí)驗(yàn)條件的選擇

2.2.1 反應(yīng)介質(zhì)的選擇

按實(shí)驗(yàn)方法分別考察了HCl、H2SO4、HAc三種溶液不同濃度下體系的ΔI值，結(jié)果表明,在HAc溶液中體系的ΔI值較大且重現(xiàn)性好，說(shuō)明體系在弱酸介質(zhì)中比較穩(wěn)定。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，體系在0.5 mL的5.0×10-5mol/L的HAc溶液中ΔI值最大，靈敏度最高，故選擇5.0×10-5mol/L的HAc溶液作為最佳反應(yīng)介質(zhì)，用量為0.5 mL。

2.2.2 CuSO4用量的選擇

在0.2～1.0 mL內(nèi)，隨著CuSO4用量的增加，Cu2+開(kāi)始與Tc結(jié)合形成螯合物，體系的ΔI值不斷增大。當(dāng)CuSO4的用量為1.0 mL時(shí)，體系的ΔI值達(dá)到最大；當(dāng)CuSO4的用量超過(guò)1.0 mL后，體系的ΔI值逐漸下降，故選擇1.0×10-2mol/L CuSO4的用量為1.0 mL。

2.2.3 鉻天青S用量的選擇

當(dāng)鉻天青S的用量為1.0 mL時(shí)，體系的ΔI值達(dá)到最大；鉻天青S的用量過(guò)多或過(guò)少都會(huì)使體系的ΔI值下降，故選擇1.2×10-3mol/L鉻天青S的用量為1.0 mL。

2.2.4 反應(yīng)時(shí)間的選擇

在室溫條件下，體系反應(yīng)5 min即可反應(yīng)完全，在3 h內(nèi)體系的ΔI值基本保持穩(wěn)定。為了便于實(shí)驗(yàn)操作，實(shí)驗(yàn)選擇在反應(yīng)10 min后進(jìn)行測(cè)定。

2.2.5 反應(yīng)溫度的選擇

在10～25 ℃內(nèi)，隨著溫度升高，體系ΔI值逐漸增大；當(dāng)溫度達(dá)到25 ℃時(shí)，體系ΔI值最大；25 ℃后隨著溫度繼續(xù)上升，體系ΔI值下降。原因可能是溫度過(guò)高，破壞了體系之間的靜電引力作用，從而導(dǎo)致體系的RLS強(qiáng)度減弱，ΔI值下降。故選擇25 ℃作為反應(yīng)溫度。

2.2.6 試劑加入順序的選擇

當(dāng)試劑加入順序?yàn)門(mén)c-Cu2+-HAc-CAS時(shí)，體系的ΔI值較其他加入順序的ΔI值大，故選擇最佳的試劑加入順序?yàn)椋篢c-Cu2+-HAc-CAS。

2.3工作曲線(xiàn)和方法的檢出限

在最優(yōu)的實(shí)驗(yàn)條件下，按照實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)λ=700 nm處不同濃度四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)的RLS強(qiáng)度，Tc濃度在0.2～22 μmol/L內(nèi)與ΔI呈良好的線(xiàn)性關(guān)系，線(xiàn)性回歸方程為：ΔI=1.021×107c+1.437，c為T(mén)c的濃度，單位為mol/L，相關(guān)系數(shù)r=0.999 0。按實(shí)驗(yàn)方法平行測(cè)定空白13次，標(biāo)準(zhǔn)偏差S=0.03，根據(jù)DL=3S/K(K為回歸方程的斜率)，求得檢出限為8.81×10-9mol/L。

2.4干擾物質(zhì)的影響

當(dāng)Tc濃度為4.3 μg/mL時(shí)，考查了可能存在的干擾物質(zhì)對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響，當(dāng)相對(duì)誤差≤±5%時(shí)，共存物質(zhì)的允許量為(μg/mL)：蔗糖(860)；K+(430)；Ca2+(340)；Na+(300)；NH4+(250)；葡萄糖、淀粉和L-精氨酸(210)；Mg2+、NO3-、SO42-和L-天冬氨酸(130)；L-酪氨酸(90)；DL-半胱氨酸和甘氨酸(60)。Fe2+(2.6)、Fe3+(3.4)、Al3+(5.1)干擾比較大，可加入EDTA進(jìn)行掩蔽。

2.5樣品測(cè)定

在當(dāng)?shù)爻匈?gòu)買(mǎi)蒙牛、伊利純牛奶作為樣品。準(zhǔn)確量取5.0 mL牛奶樣品置于100 mL離心管中，加入50 mL乙酸鹽緩沖液-乙腈混合溶液(體積比1∶4)，振蕩搖勻5 min，5 000 r/min離心20 min除去蛋白質(zhì)。取上清液至分液漏斗中，加入25 mL正己烷，振蕩搖勻5 min，靜置分層后棄去正己烷層。吸取下層清液，用正已烷反復(fù)脫脂至澄清，待用[10]。取一定體積的樣品待測(cè)液，按照實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定其共振散射強(qiáng)度，未檢出四環(huán)素。為考察實(shí)驗(yàn)方法的可行性，進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)(表1)。由表中可以看出本方法的加標(biāo)回收率為100.00%～101.20%，結(jié)果令人滿(mǎn)意。

3 反應(yīng)機(jī)理探討

3.1表面活性劑的影響

在體系中分別加入了陽(yáng)離子表面活性劑十六烷基三甲基溴化銨(CTMAB)、 陰離子表面活性劑十二烷基苯磺酸鈉(DBS) 和非離子表面活性劑阿拉伯膠(AG)，觀(guān)察體系RLS強(qiáng)度的變化情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)體系中加入CTMAB后，空白體系的RLS強(qiáng)度I0值隨CTMAB的加入量增加而增大，同時(shí)加入Tc標(biāo)準(zhǔn)溶液的反應(yīng)體系的RLS強(qiáng)度I值也隨CTMAB的加入量增加而增大，且CTMAB加入量相同條件下I值要比I0值大，說(shuō)明帶正電荷的CTMAB、Tc與Cu2+形成的二元陽(yáng)離子同時(shí)與帶負(fù)電荷的CAS發(fā)生靜電引力作用，導(dǎo)致體系的I0、I值均增大。當(dāng)體系中加入DBS后，空白體系I0隨DBS的加入量增加基本不變，表明帶負(fù)電荷的DBS與帶負(fù)電荷的CAS不發(fā)生反應(yīng)；而當(dāng)體系中加入一定量Tc標(biāo)準(zhǔn)溶液后，I值隨DBS的加入量增加而增大，且I值大于I0值，說(shuō)明帶負(fù)電荷的DBS、CAS同時(shí)與帶正電荷的Tc與Cu2+形成的二元陽(yáng)離子作用從而使反應(yīng)體系I值增大。當(dāng)體系中加入AG后，空白體系的I0和加入Tc標(biāo)準(zhǔn)溶液的反應(yīng)體系的I值均隨AG的加入量增加基本不變，說(shuō)明AG與帶負(fù)電的CAS和帶正電的Tc與Cu2+形成的二元陽(yáng)離子幾乎都不反應(yīng)。

表1 樣品和回收率分析結(jié)果(n=5)

綜上所述，可得出CAS同Tc與Cu2+形成的二元陽(yáng)離子之間是通過(guò)靜電引力結(jié)合形成離子締合物的。

3.2粒徑分析

a:鉻天青S溶液；b:四環(huán)素與銅離子混合溶液；c:鉻天青S與銅離子混合溶液;d-e:鉻天青S與銅離子及四環(huán)素混合溶液四環(huán)素的濃度: 1.0×10-5mol/L(b,d); 1.5×10-5mol/L(e)圖2 反應(yīng)體系的粒徑分析Fig.2 Particle size analysis of the reaction system

圖2是反應(yīng)物和產(chǎn)物的粒徑分析圖，由圖2可知，CAS、CAS與Cu2+、Tc與Cu2+的平均粒徑比較小，分別為134 nm、211 nm和247 nm(圖2中的a、b和c)，當(dāng)三者結(jié)合反應(yīng)生成三元離子締合物后，形成的產(chǎn)物的平均粒徑明顯增大，加入1.0×10-5mol/L Tc后，平均粒徑約為619 nm(圖2中的d)，加入1.5×10-5mol/L Tc后，平均粒徑約為1 012 nm(圖2中的e)，由此可見(jiàn)，三者結(jié)合反應(yīng)后生成更大粒徑的締合微粒，這與RLS光譜結(jié)果相符合。

4 結(jié)論

本文研究了Tc-Cu2+-CAS三元離子締合物反應(yīng)的RLS光譜，發(fā)現(xiàn)三者結(jié)合導(dǎo)致體系RLS信號(hào)顯著增強(qiáng)，且RLS強(qiáng)度增加值與Tc的濃度在0.2～22 μmol/L內(nèi)成正比，據(jù)此建立了定量測(cè)定四環(huán)素的RLS新方法。該方法靈敏度高、選擇性好，操作簡(jiǎn)便、快速，可應(yīng)用于牛奶中Tc含量的測(cè)定。

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Determinationoftetracyclineresiduesinmilkusingternaryion-associationcomplexes

SHAN Zhan1,FAN Jing-jing1,MA Xiao-long1,TANG Ning-li*

1(College of Chemistry and Biological Engineering, Guilin University of Technology, Guilin 541004, China) 2(Guangxi Colleges and Universities Key Laboratory of Food Safety and Detection, Guilin University of Technology，Guilin 541004,China)

In HAc solution, tetracycline(Tc) reacted with Cu2+to form cation chelates, which further reacted with chromeazurol S to form a ternary ion-association complexes. This enhanced resonance scattering signals. A new resonance light scattering method was established for the determination of trace Tc. Under the optimal conditions, the increase of the intensity(ΔI) at 700nm was linear to concentration of Tc in the range of 0.2-22 μmol/L. Its regression equation was ΔI=1.021×107c+1.437, with a correlation coefficient of 0.999 0 and a detection limit of 8.81×10-9mol/L. This method was applied in determination of Tc in milk samples with satisfactory results. The recovery was within the range of 100.00%-101.20%.

chromeazurol S; tetracycline;milk;resonance light scattering

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.013486

碩士研究生(唐寧莉教授為通訊作者，E-mail: ysshiyanshi@163.com)。

2016-11-25，改回日期：2017-01-03