南疆傳統(tǒng)發(fā)酵酸奶中可產(chǎn)生生物膜乳酸菌的篩選及鑒定

西熱娜依·阿布力克木，穆耶賽爾·玉蘇普，努爾古麗·熱合曼

(新疆師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，新疆特殊環(huán)境物種保護(hù)與調(diào)控生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，新疆 烏魯木齊，830054)

南疆傳統(tǒng)發(fā)酵酸奶中可產(chǎn)生生物膜乳酸菌的篩選及鑒定

西熱娜依·阿布力克木，穆耶賽爾·玉蘇普，努爾古麗·熱合曼*

(新疆師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，新疆特殊環(huán)境物種保護(hù)與調(diào)控生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，新疆 烏魯木齊，830054)

為了探索新疆長(zhǎng)壽地區(qū)傳統(tǒng)發(fā)酵酸奶中優(yōu)勢(shì)乳酸菌的生物膜形成能力，采用純培養(yǎng)法、96 孔微量板定量檢測(cè)法、掃描電子顯微鏡觀察法及16S rRNA基因序列分析法，對(duì)3份阿圖什和1份烏什傳統(tǒng)發(fā)酵酸奶中可產(chǎn)生生物膜的乳酸菌進(jìn)行了篩選、分子鑒定及生物膜結(jié)構(gòu)圖片觀察。最終從4份樣品中分離出57 株乳酸菌，其中38 株(73.68%)乳酸菌均有不同程度的生物膜形成能力，16 株(28.07%)乳酸菌為強(qiáng)黏附成生物膜菌株、22 株(38.59%)為中等黏附成生物膜菌株。分子鑒定實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，可形成生物膜的乳酸菌共有3 個(gè)屬、6 個(gè)種，其中16 株為Enterococcusdurans、1 株為Enterococcusfaecium、7 株為Enterococcusthailandicus、3 株為Enterococcuslactis、6 株為L(zhǎng)actobacillusplantarum、5 株為Streptococcusthermophilus?？僧a(chǎn)生生物膜乳酸菌中腸球菌(Enterococcus)為優(yōu)勢(shì)菌屬，其次為乳桿菌屬(Lactobacillus)和鏈球菌屬(Streptococcus)。

乳酸菌；生物膜；電子顯微鏡

新疆為多民族居住的重要的牧業(yè)基地，地理位置獨(dú)特，不同地區(qū)氣候差異較大。這里的少數(shù)民族千百年以來食用以傳統(tǒng)方法制作的酸奶，酸奶中有芳香物質(zhì)、壁外多糖、多種乳酸、乳糖、氨基酸、礦物質(zhì)、維生素、酶等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值甚至超過純牛奶[1]。酸奶里面營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)豐富、促進(jìn)調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)、可以有效地降低膽固醇、抗衰老、在人體健康中起著重要作用[2]。

不同的民族特色發(fā)酵乳制品中均蘊(yùn)含著豐富的乳酸菌資源。乳酸菌能夠產(chǎn)生多種有益的代謝產(chǎn)物，例如乳酸、細(xì)菌素、胞外多糖等。胞外多糖是分泌于細(xì)胞外的一類糖類化合物，它對(duì)改善發(fā)酵乳制品的組織狀態(tài)起著重要作用[3]。胞外多糖(EPS)的存在有利于細(xì)胞與細(xì)胞之間的黏附及生物膜的形成和成熟、使細(xì)胞免受惡劣環(huán)境的影響[4]，即作為生物膜形成中關(guān)鍵的組成部分[5]。

生物膜(Biofilm)指細(xì)菌黏附于接觸表面，分泌多糖基質(zhì)、纖維蛋白、脂質(zhì)蛋白等，將其自身包繞其中而形成的大量細(xì)菌聚集膜樣物，是微生物在宿主體內(nèi)形成的一種具有復(fù)雜結(jié)構(gòu)并附著在宿主表面的微生物群落[6]。乳酸菌生物膜黏附定居在人體腸道并起益生作用，在連續(xù)接種等發(fā)酵工業(yè)中也具有十分重要的意義。

截至目前為止，關(guān)于新疆各地區(qū)酸奶中篩選出可產(chǎn)生物膜乳酸菌的研究較少。任曉鏷等探索能誘導(dǎo)植物乳桿菌形成生物膜的外界環(huán)境因素[7]。本實(shí)驗(yàn)采用純培養(yǎng)法、96 孔微量板定量檢測(cè)法、掃描電子顯微鏡觀察法及16S rRNA基因序列分析法，對(duì)3份阿圖什和1份烏什傳統(tǒng)發(fā)酵酸奶中可產(chǎn)生生物膜乳酸菌進(jìn)行了篩選、分子鑒定及生物膜結(jié)構(gòu)圖片觀察。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

樣品來源：從居住于新疆阿圖什、烏什等地區(qū)的農(nóng)民家庭采集4份樣品，樣品詳細(xì)信息見表1。

表1 樣品采集信息表

樣品采集：用無菌吸管將樣品吸取并立刻裝在50 mL無菌離心管中，用封口膜緊密包裝并立即裝在冰袋中運(yùn)輸?shù)綄?shí)驗(yàn)室。

改良MRS培養(yǎng)基、 改良Lee氏培養(yǎng)基[8]。

1.2儀器與設(shè)備

LRH-250生化培養(yǎng)箱，上海一恒科技有限公司；光學(xué)顯微鏡，寧波舜宇儀器有限公司；PCR儀、凝膠成像系統(tǒng)、離心機(jī)、振蕩培養(yǎng)箱，上海天呈實(shí)驗(yàn)儀器制造有限公司； 96 孔平底培養(yǎng)板、酶標(biāo)儀，基因有限公司；掃描電鏡(JSM-6390)，日本JEOL公司。

1.3方法

1.3.1 乳酸菌的分離及染色鏡檢

先取4.5 mL 無菌生理鹽水分別裝入7個(gè)試管里，再取500 μL酸奶加入第1個(gè)試管充分混勻，按稀釋梯度法準(zhǔn)備10-3、10-4、10-5、10-6、10-7稀釋液，接著依次取100 μL稀釋度為 10-5、10-6、10-7的樣品，涂布改良MRS、Lee氏培養(yǎng)基瓊脂平板，最后把MRS、Lee氏平板放于37 ℃培養(yǎng)48 h[9]。培養(yǎng)完畢后菌落根據(jù)于MRS平板上是否有明顯的容鈣圈以及Lee氏培養(yǎng)基顏色是否由紫色變?yōu)辄S色等特征來挑取。形態(tài)不同的菌落再純化培養(yǎng)幾次，至到菌落形態(tài)一直為止(以染色鏡檢法判斷是否純化)。最后通過過氧化氫酶、革蘭氏染色等試驗(yàn)來篩選并初步鑒定乳酸菌。

1.3.2 96孔微量板定量檢測(cè)法篩選可產(chǎn)生生物膜的菌株

1)通過分離純化得到的乳酸菌于37 ℃條件下靜置培養(yǎng)48 h后，取菌懸液1 μL加入裝有MRS液體培養(yǎng)基(100 μL/孔)的標(biāo)準(zhǔn)96 孔微量滴定板進(jìn)行培養(yǎng)48 h，以未接菌的MRS培養(yǎng)基為空白對(duì)照。

2)培養(yǎng)完成后用酶標(biāo)儀測(cè)定培養(yǎng)物于波長(zhǎng)為630 nm處的光密度值OD1，接著棄去原培養(yǎng)基并以蒸餾水洗滌除去浮游狀態(tài)的菌(重復(fù)進(jìn)行3～4次)，96 微孔板置于室溫干燥2 h。

3)取100 μL 1%結(jié)晶紫溶液依次加入每個(gè)孔，染色20 min后用蒸餾水去除孔壁染液(重復(fù)進(jìn)行4～5次)并將96微孔板置于室溫干燥30 min。

4)每孔中依次加入100μL 95%乙醇，同時(shí)微量振蕩30 min。最后采用酶標(biāo)儀測(cè)定OD630 nm處的 OD2。 做3次平行實(shí)驗(yàn)。

(1)

(2)

OD1c，OD2c為空白對(duì)照吸光度值，B<0.1為不黏附成膜，B≥0.1為黏附成膜，0.1 1為強(qiáng)黏附成膜[10-12]。

1.3.3 掃描電子顯微鏡觀察生物膜結(jié)構(gòu)

無菌六孔板內(nèi)放置無菌蓋玻片，按比例為1∶100接種乳酸菌后37 ℃條件下靜置培養(yǎng)48 h。將培養(yǎng)皿用0.1% PBS(pH 7.2)洗3次，每次5 min，以處理未粘附菌，再加4%戊二醛固定液固定并過夜。以0.1 mol/L PBS 沖洗培養(yǎng)皿，加1%四氧化鋨固定2 h (20 ℃)，以0.1 mol/L PBS再洗2次。最后每隔10 min于50%、70%、80%、90%、100%乙醇系列中脫水后通過JFD-320冷凍干燥儀干燥5 min，真空噴金，并于掃描電鏡(JSM-6390，日本JEOL公司)下拍照[13-14]。

1.3.4 16S rRNA 基因序列分析

采用TIAN GEN 細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，對(duì)具有生物膜形成能力的菌株進(jìn)行16S rRNA基因序列分析。以成功提取的DNA 為細(xì)菌模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。16S rRNA 基因序列擴(kuò)增設(shè)計(jì)引物：上游引物為27F (5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)；下游引物為1495r(5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′)[15-16]。擴(kuò)增循環(huán)為94 ℃，5 min；(94 ℃，1 min；55 ℃，1 min；72 ℃，1．5 min；30個(gè)循環(huán))；72 ℃，5 min[17]，擴(kuò)增體系見表2。擴(kuò)增完成后，取6 μL PCR產(chǎn)物和3 μL溴酚藍(lán)，混合點(diǎn)樣1.0%瓊脂糖凝膠電泳來確認(rèn)PCR產(chǎn)物質(zhì)量，以在1 500 bp左右出現(xiàn)清晰的條帶為對(duì)照。擴(kuò)增產(chǎn)物由上海生工有限公司測(cè)序。

表2 16S rRNA基因序列 PCR擴(kuò)增體系

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送給上海生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序。待測(cè)菌測(cè)序序列后提交到GenBank，采用Blast程序與己知序列進(jìn)行相似性比對(duì)分析。GenBank將按照與測(cè)得序列的相似性高低列出己知序列名單、相似性程度以及這些序列相對(duì)應(yīng)的微生物種類。最后采用Mega7.0軟件繪制出(Neighbor-Joining)系統(tǒng)發(fā)育樹，因而對(duì)所可形成生物膜菌進(jìn)行鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1乳酸菌的分離純化

根據(jù)改良MRS 及Lee氏平板上是否有明顯的溶鈣圈及顏色是否變成為黃色等2種實(shí)驗(yàn)結(jié)果隨機(jī)挑取并純化菌落，通過簡(jiǎn)單染色確認(rèn)是否已純化，最后4個(gè)樣品從不同稀釋度中篩選出57 個(gè)菌落。用光學(xué)顯微鏡來觀察細(xì)胞形態(tài)，部分菌株形態(tài)結(jié)果如圖1，有短桿狀，長(zhǎng)桿狀，球狀，連球狀，表面光滑，半透明或不透明，凸起，邊緣整齊等。最后實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，這57 株菌均為接觸酶陰性、革蘭氏陽性，初步鑒定為乳酸菌。

圖注：13為球狀菌；111為鏈球狀菌；120為短桿狀菌圖1 傳統(tǒng)發(fā)酵酸奶中乳酸菌細(xì)胞形態(tài)(放大×100)Fig．1 The morphology of lactic acid bacteria in fermented milk

2.2篩選具有生物摸形成能力的乳酸菌

菌株根據(jù)生物膜形成能力分成4組：B<0.1為不黏附成膜，B≥0.1為黏附成膜，0.11為強(qiáng)黏附成膜[6]。分離得到的57 株乳酸菌生物膜形成能力，如表3所示，其中16 株乳酸菌為強(qiáng)黏附成膜、22 株為中等強(qiáng)度黏附成膜、其他19 株為不黏附成膜。乳酸菌生物膜形成能力按來源分類的結(jié)果見圖2與圖3。從烏什酸奶中分離得到的乳酸菌與從阿圖什酸奶中分離得到的乳酸菌相比，烏什酸奶中的乳酸菌顯示出較高的生物膜形成能力。

表3 分離菌株根據(jù)生物膜形成能力分組

圖2 阿圖什酸奶中可形成生物膜的菌株Fig.2 Biofilm formation ability of LAB in Atux fermented milk

圖3 烏什酸奶中可形成生物膜的菌株Fig.3 Biofilm formation ability of LAB in Uqturpan fermented milk

A-28號(hào)株；B-76號(hào)株；C-M63株；D-132號(hào)株；E-L5株；F-L2株圖4 生物膜電子顯微鏡圖片F(xiàn)ig.4 Biofilm picture of electron microscophy

2.3掃描電子顯微鏡觀察生物膜結(jié)構(gòu)

掃描電鏡可以直接觀察生物膜結(jié)構(gòu)。本研究利用掃描電子顯微鏡，對(duì)強(qiáng)黏附成膜乳酸菌代表菌株(28；76；M63)，中等強(qiáng)度黏附成膜乳酸菌代表菌株(132；L5)及不黏附成膜乳酸菌代表菌株(L2)進(jìn)行電鏡拍照。由圖4可知， A 、B、C等強(qiáng)黏附成膜乳酸菌菌落相互聚集，表面細(xì)菌密集，菌落增厚，聚集成團(tuán)，形成大塊的生物膜。D、E等中等強(qiáng)度黏附成膜乳酸菌中少部分開始粘附聚集并開始包裹在代謝產(chǎn)物中，菌落之間間隙較大，而不黏附成膜乳酸菌代表菌株(F)菌細(xì)胞黏附很少，與中、強(qiáng)黏附成膜乳酸菌相比具有顯著的差異。

2.416SrRNA分子鑒定

對(duì)38株可產(chǎn)生生物膜乳酸菌16S rRNA基因序列進(jìn)行擴(kuò)增鑒定，并用1%瓊脂糖凝膠，將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)，以1 500 bp左右出現(xiàn)清晰的條帶為準(zhǔn)。采用DNAStar 4.0軟件，對(duì)待測(cè)菌株的16S rRNA基因序列進(jìn)行整理，并將得到的有效序列提交到GenBank，采用Blast程序與己知序列進(jìn)行相似性比對(duì)。結(jié)果顯示，38株菌16S rRNA 基因序列同源性均≥99%。相似度及分離菌株在GenBank中的登錄號(hào)見表4。

表4 可產(chǎn)生生物膜乳酸菌16S rDNA序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中相關(guān)序列相似性分析

最后，采用MEGA7.0 軟件繪制(Neighbor-Joining)系統(tǒng)發(fā)育樹(系統(tǒng)發(fā)育樹見圖5)。結(jié)果表明，所可產(chǎn)生生物膜菌株歸屬于3 個(gè)屬6 個(gè)種，其中3個(gè)屬分別是腸球菌屬(Enterococcus)、乳桿菌屬(Lactobacillus)和鏈球?qū)?(Streptococcus)，6個(gè)種分別為耐久腸球菌 (E.durans)、屎腸球菌 (E.faecium)、E.thailandicus、Enterococcuslactis、植物乳桿菌(L.Plantarum)、嗜熱鏈球菌(S.thermophilus)。

圖5 乳酸菌(可形成生物膜)的16S rRNA 基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹 Fig.5 Phylogenetic analysis of 16S rRNA gene sequences of biofilm forming LAB

由圖5可知， M55、32、24、2、27、23 、M63、L15、M65、M64、M62、M59、M58、M57、M56、22與標(biāo)準(zhǔn)菌株Enterococcusduransstrain98D(T)相似性100%或99%，將其鑒定為Enterococcusdurans。34、28、70、9、8、L5、29與標(biāo)準(zhǔn)菌株Enterococcusthailandicus聚為一類，且相似度均為99%,所以歸屬于Enterococcusthailandicus。37 與EnterococcusfaeciumDSM 20477(T) 相似度是100%，并在進(jìn)化樹上同支上，將其鑒定為Enterococcusfaecium。L22 、L20、71與標(biāo)準(zhǔn)菌株EnterococcuslactisBT159(T)在同支上，并相似度分別為99%，因此鑒定為Enterococcuslactis。菌株107、120、129、131、132、134與標(biāo)準(zhǔn)菌株LactobacillusplantarumJCM 1149聚為一類并相似性均為100%，將其鑒定為L(zhǎng)actobacillusplantarum。 菌株3、7、17、76、L24與標(biāo)準(zhǔn)菌株StreptococcusthermophilusATCC 19258(T) 聚為一類并相似性均為100%，將其鑒定為Streptococcusthermophilus。

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)，在食品表面上形成益生菌生物膜可以有效地改善其表面的物理化學(xué)特性，并能抑制不良浮游微生物的黏附[18]。乳酸菌生物膜由蛋白質(zhì)、多糖和磷酸鹽分子組成，其可以合成酸、細(xì)菌素及表面活性劑等拮抗化合物，因而得到國(guó)內(nèi)外的高度重視[19-20]。 RANGASWAMY等人將德氏乳桿菌固定于網(wǎng)狀聚氨酷泡沫材料上后包裝在生物反應(yīng)器中并用于乳酸發(fā)酵，乳酸生產(chǎn)的速率有了顯著的提高[21]。FURUKAWA等研究者發(fā)現(xiàn)釀酒酵母與植物乳桿菌混合生物膜的形成促進(jìn)于Fukumaya米醋發(fā)酵[22]。

本研究以新疆阿圖什及烏什傳統(tǒng)發(fā)酵酸奶中分離出57 株乳酸菌并采用96孔微量檢測(cè)法檢測(cè)其生物膜形成能力，接著以分子鑒定法鑒定可產(chǎn)生生物膜的乳酸菌，最后進(jìn)行電子顯微鏡觀察生物膜結(jié)構(gòu)圖。研究結(jié)果顯示，分離純化出的57 株菌中，16 株為強(qiáng)等黏附成膜菌，22 株為中等黏附成膜菌株。16 株強(qiáng)等黏附成膜乳酸菌中10 株為從烏什酸奶中分離到的，占總菌含量的17.54%，6 株為從阿圖什酸奶中分離到的，占總菌含量的10.52%。此實(shí)驗(yàn)結(jié)果可進(jìn)一步說明以烏什酸奶為來源的乳酸菌與阿圖什酸奶為來源的乳酸菌相比烏什酸奶為來源的乳酸菌顯出較高的生物膜形成能力，烏什酸奶拉絲性也強(qiáng)于阿圖什酸奶，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與原樣品特性一致。

本研究中可產(chǎn)生生物膜的乳酸菌歸屬于3 個(gè)屬6 種，其中15 株為耐久腸球、 3 株為屎腸球菌、 7 株為為Enterococcusthailandicus、2 株為Enterococcuslactis、6 株為植物乳桿菌、5 株為嗜熱鏈球菌。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明8、9、18、22、23、25、26、28、29、34、35、37、L22、L30、M62、M63、70、71等18 株強(qiáng)黏附成膜菌株都屬于腸球菌；NG-107、118、120、129、131、132等6 株中等粘附成膜菌株屬于植物乳桿菌。此結(jié)果進(jìn)一步說明腸球菌與植物乳桿菌相比具有較強(qiáng)的粘附成膜能力。丁武蓉等研究者實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示乳桿菌屬產(chǎn)EPS產(chǎn)量為100～150 mg/L，腸球菌屬EPS產(chǎn)量為200～300 mg/L，227株乳酸菌中球菌產(chǎn)胞外多糖的能力高于桿菌[23]，與本研究結(jié)果一致。耐久腸球菌生物膜形成能力可能基于腸球菌屬EPS產(chǎn)量。

2個(gè)地區(qū)酸奶樣品中的乳酸菌菌群在種類、數(shù)量及生物膜形成能力方面具有顯著差異的可能性包括以下幾點(diǎn)：地區(qū)地理環(huán)境、酸奶制作環(huán)境、制作酸奶工藝過程中的習(xí)慣性細(xì)節(jié)(如接種、發(fā)酵溫度，使用的容器等)、牛奶濃度及質(zhì)地和成分等。以上因素均能影響乳酸菌生物膜的形成能力。生物膜形成的原因及其機(jī)理待進(jìn)一步深入研究。

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ScreeningandidentificationoflacticacidbacteriaformingbiofilmintraditionalfermentedmilkinSouthXinjiang

XIRINAY·Ablikim, MUYESSER·Yusup, NURGUL·Rahman*

(College of Life Sciences Xinjiang Normal University, Xinjiang Key Laboratory of Special Species Conservation and Regulatory Biology, Urumqi 830054， China)

To explore the Lactic acid bacteria diversity and biofilm formation in traditional fermented milk from Xinjiang longevity region, the samples were analyzed using pure culture and 16S rRNA gene sequence analysis, 96 well micro-plate semi -quantitative methods and scanning electron microscopy. Finally 57 strains were isolated from four samples. The micro-plate semi -quantitative method was used to investigate biofilm formation of strains. The results showed that 38 strains (73.68%) of the LAB showed biofilm formation ability, of which 16 strains (28.07%) strongly adhered to biofilm and 22strains (38.59%)were moderately adherent. The strains which can form biofilm were belonging to three species of six genera includingEnterococcusdurans(16 strains),Enterococcusffaecium(1 strains),Enterococcusthailandicus(7 strains),Enterococcuslactis(3 strains),Lactobacillusplantarum(6 strains),Streptococcusthermophilius(5strains),in whichEnterococcuswas the dominant species and was followed byLactobacillusandStreptococcus. These provided foundation for the development and utilization of LAB resources and their biofilm characteristics.

lactic acid bacteria；biofilm；ESM

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.013974

碩士研究生(努爾古麗·熱合曼副教授為通訊作者,E-mail:Nurgulum@163.com)。

國(guó)家自然科學(xué)基金(31460448)；國(guó)家自然科學(xué)基金(31160333)

2017-02-04，改回日期：2017-04-19